001-经口急性毒性试验方法-改良寇氏法
001_经口急性毒性试验方法_改良寇氏法
急 性 毒 性 试 验 方 法――改良寇氏法Kärber 法由Kärber 于1931提出，后经Finney 改进，顾汉颐作过改进，1963年孙瑞元教授对该法进一步改进，改进后的计算方法称为点斜法或孙氏法，增加了不含0%和100%死亡率的校正式，所得LD 50及全部有关参数与正规概率单位法相近。
改良寇氏法（Käber）试验设计的原则是：各组剂量按等比级数；各组动物数相等：大致有一半组数的动物死亡率在10%～50%之间，另一半在50%～100%之间，最好出现0 %和100 %的剂量组。
一、剂量选择及分组1、剂量选择剂量设计是否合理是急性毒性试验能否成功的关键。
探求外源化学物的急性毒性，测定其LD 50或LC 50时，应首先广泛查阅文献资料，了解该化学物的化学结构和理化性质，如结构式、分子量、溶解度、挥发度、纯度及杂质含量等，其次确定测定LD 50的计算方法，然后设计剂量。
2、预试验：总的原则是先用少量动物，以较大的剂量间距染毒，求出粗略的致死剂量范围，即确定受试动物全部致死的最小剂量（b ）和全部不致死的最大剂量（a ），即求出待测化学物0 %~100 %的大致致死剂量范围，然后在这个剂量范围内按几何级数的间距设计5~7个剂量组，组间剂量呈等比级数（r ），其比值为1.2~1.5。
进行正式实验。
用于急性毒性试验时，动物的体重为：大鼠180~200g ，小鼠18~22g ，豚鼠200~250ｇ，家兔2~2.5kg ，犬10~12 kg 。
用于实验的同一批动物体重变异范围不得超过所用动物平均体重的20%。
仍然遵守雌雄各半或雌雄兼取的原则。
当预试中发现化学物的毒性有明显的性别差异时，则需要选用雌、雄两种性别的动物分别进行试验，求出各自的LD 50。
通过预试，找出受试化学物引起动物死亡的大致剂量范围，以此为依据设计正式试验的剂量和分组。
按下式设计剂量组：1n abr -= 式中：r —相邻两组剂量的比值，一般为1.2～1.5，b —最低全致死剂量量， a —最高不致死剂量， n —设计的组数。
毒理学实验报告参考格式
写题目：灭多威经口急性毒性试验一、目的意义（抄实验课本）二、原理（抄实验课本）三、内容与操作步骤（一）受试动物：昆明种小白鼠，体重18g~24g，雌雄各半。
（二）称重、分组原则：每性别各分、6个剂量组、每组5只、体重均衡法进行方法：实验课本P15（体重均衡法分配方法）（1）雄性小白鼠分组第一步将动物按体重分组按照18~g，19~g……24g分为7组，30只雄性小白鼠称重后放入相应的体重组中。
第二步照抄就好（2）雌性小白鼠分组同（1）（三）编号（参考课本P21）各小组的按照小组的做法来写（四）剂量设计原则：设6个剂量组，组间剂量(mg/kg)以及灌胃液浓度(mg/ml)均是等比数列，比值均为1.32设计方案：组别 1 2 3 4 5 6剂量（mg/kg）100 75.79 57.39 43.48 32.94 24.95 灌胃液浓度（mg/ml）5 3.79 2.87 2.17 1.64 1.24 原液取量（ml）5*2 3.79*2 2.87*2 2.17*2 1.64*2 1.24*2 （定容为10ml）动物死亡数（只）8 9 6 0 1 1（五）受试物的配制（课本P22）可以用自己的语言来简洁地描述（六）灌胃给药（课本P23）具体操作要写原则：等容量法（七）中毒体征和动物死亡观察记录写表3-1 急性毒性实验原始记录2.计算LD50（1）方法：改良寇氏法(课本P26，写原则和计算公式及表3-3(6组)求lgLD 50和SmLgLD50及其95%可信限为所以LgLD50及95%可信区间范围为四、结果评定（课本P25 写表3-2）判断受试物的毒性大小和毒性特征四、实验讨论1.写实验操作过程中出现了什么问题2.小组针对各小组结果进行讨论，特别是有异常结果的小组要注意了3.也可以比较雄雌性结果的差异大家发挥想象力吧！。
LD50测定预试(采用改良寇氏法)
取 2%敌百虫？ml 加生理盐水至？ml 即为母液。以此类推。 从母液中取出？ml 作为 4 号液（最高浓度）
在剩下的？ml+生理盐水？ml 取？ml 作为 3 号液。以此类推。 3. 计算剂量填入表格 以第一组剂量×比值按顺序填入各组剂量值。 4. 将稀释好的药液按顺序给每组小鼠 0.2ml/10g 腹腔注射，1 号液注射 1 组；2 号液 2 组……观察 10ˊ～15ˊ内死亡情况以翻正反射消失为准，并将死亡数 填入表格，一只未死的剂量组为 0%全部死亡的为 100%。 组号 剂 量 对数 实验动物 死亡数 死亡数 P P2 mg/10g 剂量 数
摇匀
1 2 3 4
实验一、LD50 测定预试（采用改良寇氏法） ——小白鼠腹腔注射敌百虫
目的：初步确定 0%和 100%死亡率的剂量范围。 1. 基本要求：步骤： （1）实验动物的选择：♂、♀各半后兼取，剔除病鼠及（远 ♂、近♀）孕鼠，体重应较接近 20±2g。品系、年龄、饲料、饥饱与环境因 素尽可能一致。本实验采用昆明小鼠 20 只。 （2）随机分组：减少人为的偏差，采用随机数字表。每个小鼠称（按体重轻 重分）重编号，和随机数字表对应，用组数去除时（本实验分四组） ，按如下 分配。 ①余数等于零时，其余数用组数表示如： 4÷4→余 0→4 组。 ②不够除时，直接把分子落下来。如：3÷4→3→3 组。 ③能除时，余数即为组数。如：0.5÷4→1→1 组。 如此类推，分完了不均衡（每组应相等） ，每组多的重新按随机数字表分配，随 机数字除以该组的动物数（参见例 1～例 3） 。 （3）确定剂量 ①剂量范围选择：据经验，预试找出 0%～100%范围，Dm 为使试验动物全部死亡 的最小剂量，Dn 为使试验动物一个也不死亡的最大剂量。 Dm =10mg/kg ;Dn =3.3mg/kg 二步法大致 a 新药——————→ 10x 稀释————→ 2 倍稀释 范围 x b 无资料：治疗量×100 作为最大剂量 ②剂量分组：5～8 组为宜，要求 50%死亡上下各有一半的组，包括 0%和 100% 组，两头舍去。 ③各组剂量呈等比级数，换成对数为等差级数。 比值=log −1 (
实验二-经口急性毒性试验-Acute-Oral-Toxicity
实习内容
试验动物的选择和性别鉴定。
试验动物的称重、编号以及随机分组方法。 急性毒性试验常用染毒途径和方法。
急性毒性反应的观察和LD50计算。
实验材料
(一) 实验动物：健康成年小鼠或大鼠若干只。
(二) 器材 注射器(O.25，1，2，5ml)、吸管(0.1，0.2，0.5，1，2，
10m1)、容量瓶(10，25，50ml、烧杯(10，25，50ml)、滴管、
灌胃针(大鼠、小鼠适用)、电子天平(感应量1/10000g)、动物 体重秤、外科剪刀、镊子。
(三) 试剂
受试化学物为氟化钠(NaF，分析纯)，苦味酸酒精饱和液 或其它染色剂。
实验动物的选择(提问)
实验动物的性别鉴定
♀
♂
分组成表3所示。雌性动物也按上法分组，然后将雌、雄动物合组进行试验。
表3 调配后30只动物随机分组
组别 A 1 14 鼠号 17 19 23 组别 D 4 9 鼠号 25 26 27
B
C
5
7
8
16
10
20
13
22
15
29
E
F
2
3
6
11
12
18
24
21
28
30
实验动物染毒途径和方法（示教）
常用的染毒途径： 经口染毒 经呼吸道染毒
面向自己,沿着门牙左 边滑入
气管
By LASCO
食道
经皮染毒
注射途径染毒
吸收速率：
静脉注射>吸入染毒>肌肉注射>腹腔注射>皮下注射> 经口染毒>皮内注射>其他染毒途径如经皮等
受试物的配制
实验二 经口急性毒性LD50测定
实验二经口急性毒性LD50测定实验二经口急性毒性LD50测定一、试验目的1. 熟悉急性毒性LD50测定的剂量设计2. 掌握小鼠灌胃技术3. 掌握改进寇氏法计算LD50的方法二、试验原理选择健康的实验动物，依据LD50计算的设计原则，将实验动物随机分成数个染毒组和一个阴性对照组。
一次或24小时内多次给予实验组受试物后，观察动物所产生的急性毒性反应及其严重程度，中毒死亡的特征以及可能的死亡原因。
根据受试物毒性反应与剂量的关系，求出半数致死剂量(LD50)，并根据LD50值将受试物进行急性毒性分级。
三、材料和试剂1. 实验动物:健康成年小鼠60只，雌雄各半2. 器材:灌胃针(小鼠适用)、注射器、吸管、容量瓶、烧杯、滴管、分析天平、台秤、外科手术剪、镊子3. 受试物:(敌百虫或克佰威)4. 染色剂:苦味酸酒精饱和溶液、0.5%品红溶液四、实验内容1. 实验动物称重、编号和随机分组2. 染毒剂量设计及试剂配制3. 小鼠灌胃染毒技术4. 毒性反应的观察及LD50计算五、试验方法(一)预实验1. 探索剂量范围先找出100%与0%的致死量(或阳性反应的剂量)为实验的上、下限剂量(Dmax和Dmin)。
据经验或文献定出一个估计量，取动物若干，每4只一组，按估计量给药，如出现4/4死亡时，下一组剂量降低，当出现3/4死亡时，则上一剂量为Dmax;如降低一档剂量出现的死亡率2/4或1/4时，应考虑到4/4死亡剂量组在正式实验时可能出现死亡率低于70%，为慎重起见可将4/4死亡剂量乘以1.4倍，作为Dmax。
以次类推，找出Dmin。
2. 剂量分组一般染毒组数(G)以5-8组为宜，组间剂量比值为r。
在确定组数后，按下列公式计算r。
1/(G-1)r = (Dmax/Dmin) 3. 受试物溶液的配制配制等比浓度的敌百虫溶液，并使每只动物在给药容量上相等(如0.5ml/20g)。
剂量按等比级数增减，相邻两剂量比值1:0.6,0.9，设5个剂量组。
急性经口毒性实验
小鼠灌胃法：左手拇指和食指捏住小鼠头部两耳后皮肤，无名指或小指将尾部紧压在手上，使小鼠腹部向上，尽量使其体位垂直，注意使动物的上消化道固定成一直线。右手持连着灌胃导针的注射器，将灌胃针由动物口腔侧插入，避牙齿，沿咽后壁缓缓滑人食管。若遇阻力，可轻轻上下滑动探索，一旦感觉阻力消失，即深人至胃部，一般进针深度小鼠2.5～4cm，随后将受试物溶液注入。如遇动物挣扎，应停止进针或将针拔出，千万不能强行插入，以免穿破食管，甚至误入气管，导致动物立即死亡。小鼠一次灌胃体积为10-20ml/kg
灌胃时操作要避免损伤食道或误入气管
正确捉拿动物，防止被咬伤且避免动物损伤
防止操作者中毒。注意通风，不要把药品撒到手、脸部皮肤及身体其他部位，操作过程中要小心。
五、注意事项：
实验动物的种属。
01
实验动物体重和随机分组情况。
02
受试物的名称、性状等情况。
03
受试物的配制和溶剂。
04
描述实验观察的中毒表现和死亡情况等。
LD50的95%可信限=log-1(X + 1.96 SX )
结果评价：
根据实验动物中毒体征、死亡时间、根据得出的LD50及受试物的种类，按相应的国家标准或技术规范中的急性经口毒性分级标准（课本 215页--农药的急性毒性分级）对受试物进行毒性定级，判断受试物的毒性大小。
灌入量计算和操作要准确，否则影响结果
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202X
急性经口毒性实验 （Acute Oral Toxicity Test）
通过本次实验掌握经口灌胃技术，半数致死剂量的意义。
通过本次实验学习半数致死剂量的计算及毒性判定。
一、实验目的：
二、测定方法：
本实验以灌胃方式测定敌敌畏DDV（80g/100ml）的半数致死量（LD50）。
急性经口毒性实验方法的比较与选择
急性经口毒性实验方法的比较与选择国内外的农药管理机构在对农药进行安全评价时，农药的急性毒性实验是必不可少的。
通过研究实验哺乳动物在不同接触途径（口腔、皮肤、呼吸道、眼睛）下对农药的中毒反应，来推测该农药对人类、家畜等的毒性大小，从而为安全生产、储存、运输及使用农药制定指导性文件。
急性经口毒性的概念急性经口毒性（acute oral toxicity）：机体一次或24h内多次经口接触外源化学物后在短期内（最长14天）所产生的毒性效应，包括一般行为和外观改变、大体形态变化以及死亡效应。
急性经口毒性试验的目的1）求出致死剂量及其他急性毒性参数2）观察中毒表现、毒作用强度和死亡情况，初步评价毒物的毒效应特征3）为其他毒理试验提供接触剂量和选择观察指标的依据4）为毒理学机制研究提供线索急性经口毒性的参数半数致死剂量：LD50实验要点(一)健康实验动物的选择和性别鉴定。
(二)实验动物称重、编号和随机分组方法。
(三)受试化合物溶液的配制。
(四)小鼠灌胃技术。
(五)毒性症状的观察和LD50计算。
国际通用的几种急性经口毒性实验方法传统的急性经口毒性试验多采用霍恩氏法和改良寇氏法。
我国过去普遍采用的急性毒性的评价方法大体上可以归为两类：一是死亡率剂量反应要求为正态分布的，其中概率分配图解法和寇氏法（Karber）较为常用；另一类是不要求为正态分布的（非正态分布），查对有关表格即可得到LD50值，如霍恩氏法（Horns）等。
目前中国主要采用三种急性经口毒性试验方法，分别为霍恩氏法、序贯法（up-and-down procedure）、概率单位法（Miller and Taninter’s method）。
具体方法可参看中华人民共和国国家标准GB/T 15670-2017 （农药登记毒理学试验方法）第2、3、4部分内容。
美国EPA农药登记推荐的方法是OPPTS 870.1100，实际内容与OECD 425 （up-and-down procedure）一致。
LD50计算方法
2.15
0.846～5.48
2.15
0.888～5.23
4.64
1.91～11.3
1.47
0.605～3.56
3.16
1.30～7.67
1.00
0.412～2.43
2.15
0.888～5.23
2.15
0.728～6.38
4.64
1.57～13.7
1.47
0.419～5.14
3.16
0.903～11.1
3.16
0.122～82.1
10.0
0.385～260
Horn氏表2-2
各剂量组动物死亡数 (只)
1234 2224 3024 3034 3114 3124 0033 0043 0123 0133 0143 0223 0233 0243 0333 1033 1043 1123 1133 1143 1223 1233 2033 2043 2123 2133 2223
0
2
1
0
3
1
0
4
1
1
1
1
1
2
1
1
3
1
1
4
1
2
2
1
2
3
2
0
2
2
0
3
2
0
4
2
1
1
2
1
2
2
1
3
每组4只动物，组距3.16倍
剂量1＝0.316
剂量2＝1.00 剂量3＝3.16
×10t
剂量4＝10.0
4
LD50
4
3.16
可信限 1.63～6.15
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001-经口急性毒性试验方法-改良寇氏法急性毒性试验方法――改良寇氏法Kärber 法由Kärber 于1931提出，后经Finney 改进，顾汉颐作过改进，1963年孙瑞元教授对该法进一步改进，改进后的计算方法称为点斜法或孙氏法，增加了不含0%和100%死亡率的校正式，所得LD 50及全部有关参数与正规概率单位法相近。
改良寇氏法（Käber）试验设计的原则是：各组剂量按等比级数；各组动物数相等：大致有一半组数的动物死亡率在10%～50%之间，另一半在50%～100%之间，最好出现0 %和100 %的剂量组。
一、剂量选择及分组1、剂量选择剂量设计是否合理是急性毒性试验能否成功的关键。
探求外源化学物的急性毒性，测定其LD 50或LC 50时，应首先广泛查阅文献资料，了解该化学物的化学结构和理化性质，如结构式、分子量、溶解度、挥发度、纯度及杂质含量等，其次确定测定LD 50的计算方法，然后设计剂量。
2、预试验：总的原则是先用少量动物，以较大的剂量间距染毒，求出粗略的致死剂量范围，即确定受试动物全部致死的最小剂量（b ）和全部不致死的最大剂量（a ），即求出待测化学物0 %~100 %的大致致死剂量范围，然后在这个剂量范围内按几何级数的间距设计5~7个剂量组，组间剂量呈等比级数（r ），其比值为1.2~1.5。
进行正式实验。
用于急性毒性试验时，动物的体重为：大鼠180~200g，小鼠18~22g，豚鼠200~250ｇ，家兔2~2.5kg，犬10~12 kg。
用于实验的同一批动物体重变异范围不得超过所用动物平均体重的20%。
仍然遵守雌雄各半或雌雄兼取的原则。
当预试中发现化学物的毒性有明显的性别差异时，则需要选用雌、雄两种性别的动物分别进行试验，求出各自的LD 50。
通过预试，找出受试化学物引起动物死亡的大致剂量范围，以此为依据设计正式试验的剂量和分组。
按下式设计剂量组：r =n ba式中：r —相邻两组剂量的比值，一般为1.2～1.5，b —最低全致死剂量量， a —最高不致死剂量， n —设计的组数。
分组恰当与否也是确保实验结果准确的条件之一。
因为组数过多，需要消耗较多的动物，还可能出现较大剂量组动物死亡率低于较小剂量组；组数过少，不能较精确求出LD 50。
3、根据公比(r)计算各组剂量各组剂量分别为：第一组：a 第二组：a r 第三组：a r2第四组：a r3 第五组：a r4 第六组：a r5二、受试物溶液配制1、溶剂的选择毒理学试验中，常用的剂型有液体剂型、固体剂型。
液体剂型中有溶液剂、混悬剂、乳化剂等。
选择溶剂的原则是不与受试物发生化学反应，不改变化学物的毒性，故应根据受试物的理化性质，选择适当的溶剂。
一般而言，水溶性化学物可选择蒸馏水或生理盐水，以水为溶剂，既经济、方便、易吸收，又无毒副作用。
脂溶性化学物多选用植物油，如花生油、橄榄油。
不溶于水而溶于油的化学物常用吐温-80或吐温-60配制成乳化剂。
既不溶于水又不溶于油脂的化学物可选择淀粉液、明胶液、羧甲基纤维素钠液（0.5-1% CMC ）等助悬剂配制成混悬液。
如用有机溶剂，实验动物应设溶剂对照组，有机溶剂所用比例不宜超过10%，溶解后，再用水稀释，必要时可加入增溶剂，如吐温-80、聚乙二醇等，以提高溶液剂的浓度。
2、配制方法将受试物配制成一种浓度，不同剂量组实验动物单位体重所给受试物的体积不同，剂量越高，所用的体积越大；剂量越低，所用的体积越小。
比如某受试物的试验剂量分别为100、200、400和800mg/kg，受试物配制成10 mg/ml，每组动物每10g 体重分别给与0.1、0.2、0.4和0.8 ml。
将受试物配制成不同浓度，不同剂量组实验动物单位体重所给受试物的体积相同，剂量越大，受试化学物配制的浓度越高。
上例中，若实验动物按0.2ml/10g b.w容量灌胃,则应配制成4个不同浓度, 即5mg/ml、10mg/ml、20mg/ml和40mg/ml。
灌胃体积依所选用的实验动物而定，一次灌胃的体积为：小鼠0.1～0.4ml/10g b.w，每只不超过1ml ；大鼠0.5～1ml/100g，每只不超过4ml; 家兔在5ml/kg之内; 犬不超过50ml/kg；为避免操作误差，等容量稀释的传统方法常采用1∶K 系列稀释法。
该法操作简便、浓度精确、节约受试化学物。
a 、确定各剂量组所需受试液浓度如已知最高剂量组剂量为2000mg/kg b.w.，小鼠按等容量方法给予受试药液，即0.2ml/10g b.w.，相当于20ml/1000g b.w.，故最高剂量组所需受试液的浓度（母液浓度）为2000mg/20ml，即10.0%（C 1）。
b 、确定每组所需受试液的量（m ml）按每只鼠体重25g 计算（将损耗也计算在内），给药量为0.2ml/10g b.w. ，则每组10只动物所需受试液的量为5ml ；c 、确定母液总量配制时，根据实验设计要求确定最高剂量组所需受试化学物的浓度和总体积，配制母液。
设母液浓度为C 1，各组所需要的量为m ml，母液应配制的总量M 用下述公式计算：M =m1-K式中， K为各组剂量的比值，K=1/r。
d 、配制母液选择适当的溶剂配制浓度为C 1的受试液，取M ml 作为母液，从母液中取出m ml 供最高剂量组染毒用；然后取m ml 溶剂加入剩余的母液中，混匀，稀释后的母液浓度为C 2（C 1 ：C 2=1：k= r ），即次高剂量组所要求的浓度，从中取出m ml供次高剂量组染毒用（第2组），然后再加入m ml溶剂，其稀释后的浓度为C 3（C 2 ：C 3=1.2），取出m ml 供第3组动物染毒用。
依此类推，可配制成按1∶K 递减的各剂量组不同浓度的试液。
三、染毒各组小鼠分别按等容量方法给予相应浓度的受试药液，即0.2ml/10g b.w.。
四、观察指标与试验期限急性中毒症状及出现时间，死亡数量、时间。
大体剖检变化。
试验期限为7-14天五、结果及LD50的计算采用寇氏法计算LD 50及其95%可信限 1、试验结果列表表试验结果2 计算LD 50当急性毒性试验的最大剂量死亡率为100%，最小剂量的死亡率为0%；各组动物数相等；各剂量组的组距等比或剂量对数等差时，用下述基本公式计算LD 50：LD 50=log -1[X m -i (∑p -0. 5)]3-P m -P n)] 4当不含0%和100%死亡率时，用下式计算LD 50：LD 50=log -1[X m -i (S x 50∑p -pq =in以上各式中：i —组距，即相邻两组剂量对数剂量之差X m —最大剂量对数P —各剂量组死亡率(死亡率均用小数表示) P m —最高死亡率q —各组剂量存活率，q=1-pP n —最低死亡率∑p —各剂量组死亡率之和 n —各组动物数 S x50—logLD 50的标准误LD 50 的95 %可信限=log-1(log LD50±1.96×S x50)改进Kärber 法的优点是计算简便、结果精确，实用性大。
我国《新兽药一般毒性试验技术要求》规定用此法计算新兽药的LD 50。
举例：给小鼠口服某药进行急性毒性试验，测定LD 50。
选择体重18~24g健康小鼠（雌雄各半），按随机方法将动物分为5个组，每组10只。
经预试找出死亡率在0~100%的剂量范围大约为300~600mg/kg b.w. 。
（1) 预试（略）（2）计算公比r =n ba（3）根据公比(r)计算各组剂量因而各组剂量分别为：第一组：a=300mg/kg b.w.第二组：a r =300⨯1. 2 = 360mg/kg b.w. 第三组：a r2 =300⨯1. 2 2 =432mg/kg b.w. 第四组：a r3 =300⨯1. 2 3 = 518mg/kg b.w. 第五组：a r4 =300⨯1.2 4 = 622mg/kg b.w.（4）受试液配制采用1：K 系列稀释法配制不同浓度的受试液。
（K ＝1/r）a 、确定各剂量组所需受试液浓度：已知最高剂量组剂量为622mg/kg b.w. ，小鼠按等容量方法给予受试药液，即0.2ml/10g b.w. ，相当于20ml/1000g b.w.，故最高剂量组所需受试液的浓度（母液浓度）为622mg/20ml，即3.11%（C 1）； b 、确定每组所需受试液的量按每只鼠体重25g 计算（将损耗也计算在内），给药量为0.2ml/10g b.w. ，则每组10只动物所需受试液的量为5ml ；c 、确定母液总量各组动物需用本组浓度受试液的用量为5 ml（m ）；各剂量组之比为0.833（k=1/ r），则母液应配制的总量为（ml ）：d 、配制母液选择适当的溶剂配制浓度为3.11%（C 1）的受试液，取30 ml作为母液，从母液中取出5ml 供第五组（最高剂量组）接毒用，然后取5 ml溶剂加入25ml 母液中混匀，稀释后的母液浓度为2.59%（C 2）（C 1 ：C 2=1：k=1.2），即第四组（次高剂量组）所要求的浓度，从中取出5 ml供第四组接毒用，然后再加入5 ml （ν ml）溶剂，其稀释后的浓度为2.16%（C 3）（C 2 ：C 3=1.2），即第三组所需的浓度。
依此类推，可配制第二组、第一组所需浓度的受试液，分别为1.80%、1.50%（5）接毒各组小鼠分别按等容量方法给予相应浓度的受试药液，即0.2ml/10g b.w.。
（6）观察指标（7）结果及LD50的计算采用寇氏法计算LD 50及其95%可信限 a 、将试验结果列入下表，按改良寇氏法进行计算；表试验结果b 、按下列公式计算：LD 50=log -1[X m -i (∑p -0. 5)]即：logLD 50=Xm-d （∑p -0.5）Xm=log622=2.7938 i=log 1.2=0.0792 p=0+0.2+0.5+0.7+1.0=2.4代入公式：logLD 50= 2.7938-0.0792（2.4-0.5）=2.6433 c 查反对数求出LD50=439.87 mg/kg b.w.。
d 计算LD 50的标准误（S ）：S x 50=ipqn=0.0792×0.249=0.0197e 计算LD 50的95%可信限：LD 50的95%可信限= log-1（logLD 50±1.96×S logLD 50）= log-1（2.6433±1.96×0.0197） = log-1（2.6433±0.0386）= log-1（2.6047~2.6819）=402.44~480.73 mg/kg b.w.。