实验二经口急性毒性试验
经口急性毒性试验方法改良寇氏法
急 性 毒 性 试 验 方 法――改良寇氏法Kärber 法由Kärber 于1931提出，后经Finney 改进，顾汉颐作过改进，1963年孙瑞元教授对该法进一步改进，改进后的计算方法称为点斜法或孙氏法，增加了不含0%和100%死亡率的校正式，所得LD 50及全部有关参数与正规概率单位法相近。
改良寇氏法（Käber）试验设计的原则是：各组剂量按等比级数；各组动物数相等：大致有一半组数的动物死亡率在10%～50%之间，另一半在50%～100%之间，最好出现0 %和100 %的剂量组。
一、剂量选择及分组1、剂量选择剂量设计是否合理是急性毒性试验能否成功的关键。
探求外源化学物的急性毒性，测定其LD 50或LC 50时，应首先广泛查阅文献资料，了解该化学物的化学结构和理化性质，如结构式、分子量、溶解度、挥发度、纯度及杂质含量等，其次确定测定LD 50的计算方法，然后设计剂量。
2、预试验：总的原则是先用少量动物，以较大的剂量间距染毒，求出粗略的致死剂量范围，即确定受试动物全部致死的最小剂量（b ）和全部不致死的最大剂量（a ），即求出待测化学物0 %~100 %的大致致死剂量范围，然后在这个剂量范围内按几何级数的间距设计5~7个剂量组，组间剂量呈等比级数（r ），其比值为1.2~1.5。
进行正式实验。
用于急性毒性试验时，动物的体重为：大鼠180~200g ，小鼠18~22g ，豚鼠200~250ｇ，家兔2~2.5kg ，犬10~12 kg 。
用于实验的同一批动物体重变异范围不得超过所用动物平均体重的20%。
仍然遵守雌雄各半或雌雄兼取的原则。
当预试中发现化学物的毒性有明显的性别差异时，则需要选用雌、雄两种性别的动物分别进行试验，求出各自的LD 50。
通过预试，找出受试化学物引起动物死亡的大致剂量范围，以此为依据设计正式试验的剂量和分组。
按下式设计剂量组：1n ab r -= 式中：r —相邻两组剂量的比值，一般为1.2～1.5，b —最低全致死剂量量，a —最高不致死剂量，n —设计的组数。
《食品毒理学》经口急性毒性试验
《食品毒理学》经口急性毒性试验一、实验目的和要求掌握给药方法；了解一次或24小时内多次给予受试化学物后，动物所产生的急性毒性反应及其严重程度，中毒死亡的特征以及可能的死亡原因，观察受试动物毒性反应与剂量的关系，求出半数致死量。
二、主要仪器设备实验动物：成年昆明系实验小鼠（SPF级别）。
器材：注射器（0.25，1，2，5ml）、吸管（0.1，0.2，0.5，1，2，10ml）、容量瓶（10，25，50ml）、烧杯（10，25，50ml）、滴管、灌胃针12号、动物体重秤、解剖剪刀、镊子、手术手套，口罩。
试剂：受试化合物（氯化钡溶液，20mg/mL）。
三、实验原理氯化钡是强电解质，可完全电离出钡离子，导致钡离子在小鼠血液内部引发急性低钾血症，故小鼠会出现肌无力和发作性软瘫，心肌应激性减低，各种心律失常和传导阻滞，由于肌无力，严重中毒的小鼠还会出现呼吸困难乃至死亡等症状。
四、实验内容1．健康动物的选择和性别鉴定。
2．实验动物称重、编号和随机分组。
3．受试化学物溶液的配制。
4．小鼠灌胃操作技术。
（1）预实验，取小白鼠、称重、随机分为5组，每组3只，以灌胃的方式给予等体积、不同剂量的氯化钡溶液，摸索小鼠接近100%和0%死亡的剂量范围。
（2）小鼠随机分为5组，每组3只，以灌胃的方式给予等体积、不同剂量的氯化钡溶液。
小鼠灌胃法：将钝头的12号注射针（适用于小鼠），安装在适当容积的注射器上，吸取所需的受试物溶液，左手抓住动物双耳后至背部的皮肤（小鼠仅抓住耳后、颈部的皮肤，用无名指、小手指和大鱼际肌将其尾根部压紧），将动物固定成垂直体位，腹部面向操作者。
注意使动物的上消化道固定成一直线。
右手持注射器，将针头由动物口腔侧插入，避开牙齿，沿咽后壁缓缓滑人食管。
若遇阻力，可轻轻上下滑动探索，一旦感觉阻力消失，即可深入至胃部。
如遇动物挣扎，应停止进针或将针拔出，千万不能强行插入，以免操作穿破食管，甚至误人气管，导致动物立即死亡。
经口急性毒性试验.
大小鼠标记方法（单色法n>10）
双 色 法
大小鼠标记方法（双色法n<10）
红色表示十位数： 头部染红色为10
左前肢为20
左腰部为30 黄色表示个位数。 大小鼠标记方法（双色法n>10）
其它标记方法
烙印编号法：
体内埋号编号法：
耳孔编号法：
挂牌编号法：
实验动物的随机分组
表1 动物随机分组表 动物号 随机数字 除6余数 分组 动物号 随机数字 除6余数 分组 1 97 1 A 16 27 3 C 2 74 2 B 17 7 1 A 3 24 0 F 18 36 0 F 4 67 1 A 19 7 1 A 5 62 2 B 20 51 3 C 6 42 0 F 21 24 0 F 7 81 3 C 22 51 3 C 8 14 2 B 23 79 1 A 9 57 3 C 24 89 5 E 10 26 2 B 25 73 1 A 11 42 0 F 26 16 4 D 12 53 5 E 27 76 4 D 13 32 2 B 28 62 2 B 14 37 1 A 29 27 3 C 15 32 2 B 30 66 0 F
组 别 A B C D 1 2 7 26 4 5 9 27 14 8 16 鼠 号 17 10 20 19 13 22 23 15 29 25 28
E
F
12
3
24
6 11 18 21 30
具体方法如下：继续抄下随机数字分别除以A、B、C、F组的现有动物数，即： 56/7(7为A组现动物数)整除，余数为0，将A组第7只动物(25号)调配给D组；下一 个：50/6(6为A组现有动物数)余2，将A组第2只动物(4号)调配给D组；接下来 26/6(6为C组现有动物数)余2，将C组第2只动物(9号)给D组。余类推，最后调整
急性经口毒性试验 上下增减剂量法
附件12急性经口毒性试验上下增减剂量法Acute Oral Toxicity Test Up-and Down Procedure1 范围本方法规定了急性经口毒性试验上下增减剂量法（上下法）的基本原则、要求和方法。
本方法适用于化妆品原料安全性毒理学检测。
2 试验目的急性经口毒性试验是评估化妆品原料毒性特性的第一步，通过短时间经口染毒可提供对健康危害的信息。
试验结果可作为化妆品原料毒性分级和标签标识以及确定亚慢性毒性试验和其他毒理学试验剂量的依据。
3 定义3.1 急性经口毒性acute oral toxicity一次或在24 h内多次经口给予实验动物受试物后，动物在短期内出现的健康损害效应。
3.2 经口半数致死量（LD50）oral medium lethal dose经口一次给予受试物后，引起实验动物总体中半数死亡的毒物的统计学剂量。
以单位体重接受受试物的重量(mg/kg或g/kg)来表示。
3.3 延迟死亡delayed death设定的给药间隔（通常为48 h）内不引起受试动物死亡或出现濒死状态，但在14 d的观察期间内出现死亡。
3.4 剂量级数因子dose progression factor也称为剂量步进因子。
是指主试验中，当前剂量的一只动物存活或死亡时，下一只动物染毒剂量增加或降低倍数。
剂量级数因子建议为1/（估计的剂量-反应曲线斜率）的反对数。
默认的剂量级数因子为3.2，即0.5（1/2）的反对数。
3.5 限值剂量limit dose受试动物进行急性经口毒性试验的上限剂量（2000 mg/kg或5000 mg/kg）。
3.6 逆转reversal是指在某个染毒剂量下观察动物无反应，在下一个染毒剂量下观察动物有反应的现象，反之亦然（也就是前一个动物发生反应，后一个动物无反应）。
因此，一对不同的动物染毒反应情况产生一个逆转。
3.7 名义受试动物量nominal sample size是指受试动物的总数量按下列规则减去一定量动物数：（1）减去染毒序列开始时出现相同反应的最后1只动物之前的受试动物数量，（2）或减去第一次发生逆转的一对动物之前受试动物的数量。
实验二-经口急性毒性试验-Acute-Oral-Toxicity
实习内容
试验动物的选择和性别鉴定。
试验动物的称重、编号以及随机分组方法。 急性毒性试验常用染毒途径和方法。
急性毒性反应的观察和LD50计算。
实验材料
(一) 实验动物：健康成年小鼠或大鼠若干只。
(二) 器材 注射器(O.25，1，2，5ml)、吸管(0.1，0.2，0.5，1，2，
10m1)、容量瓶(10，25，50ml、烧杯(10，25，50ml)、滴管、
灌胃针(大鼠、小鼠适用)、电子天平(感应量1/10000g)、动物 体重秤、外科剪刀、镊子。
(三) 试剂
受试化学物为氟化钠(NaF，分析纯)，苦味酸酒精饱和液 或其它染色剂。
实验动物的选择(提问)
实验动物的性别鉴定
♀
♂
分组成表3所示。雌性动物也按上法分组，然后将雌、雄动物合组进行试验。
表3 调配后30只动物随机分组
组别 A 1 14 鼠号 17 19 23 组别 D 4 9 鼠号 25 26 27
B
C
5
7
8
16
10
20
13
22
15
29
E
F
2
3
6
11
12
18
24
21
28
30
实验动物染毒途径和方法（示教）
常用的染毒途径： 经口染毒 经呼吸道染毒
面向自己,沿着门牙左 边滑入
气管
By LASCO
食道
经皮染毒
注射途径染毒
吸收速率：
静脉注射>吸入染毒>肌肉注射>腹腔注射>皮下注射> 经口染毒>皮内注射>其他染毒途径如经皮等
受试物的配制
实验二 经口急性毒性LD50测定
实验二经口急性毒性LD50测定实验二经口急性毒性LD50测定一、试验目的1. 熟悉急性毒性LD50测定的剂量设计2. 掌握小鼠灌胃技术3. 掌握改进寇氏法计算LD50的方法二、试验原理选择健康的实验动物，依据LD50计算的设计原则，将实验动物随机分成数个染毒组和一个阴性对照组。
一次或24小时内多次给予实验组受试物后，观察动物所产生的急性毒性反应及其严重程度，中毒死亡的特征以及可能的死亡原因。
根据受试物毒性反应与剂量的关系，求出半数致死剂量(LD50)，并根据LD50值将受试物进行急性毒性分级。
三、材料和试剂1. 实验动物:健康成年小鼠60只，雌雄各半2. 器材:灌胃针(小鼠适用)、注射器、吸管、容量瓶、烧杯、滴管、分析天平、台秤、外科手术剪、镊子3. 受试物:(敌百虫或克佰威)4. 染色剂:苦味酸酒精饱和溶液、0.5%品红溶液四、实验内容1. 实验动物称重、编号和随机分组2. 染毒剂量设计及试剂配制3. 小鼠灌胃染毒技术4. 毒性反应的观察及LD50计算五、试验方法(一)预实验1. 探索剂量范围先找出100%与0%的致死量(或阳性反应的剂量)为实验的上、下限剂量(Dmax和Dmin)。
据经验或文献定出一个估计量，取动物若干，每4只一组，按估计量给药，如出现4/4死亡时，下一组剂量降低，当出现3/4死亡时，则上一剂量为Dmax;如降低一档剂量出现的死亡率2/4或1/4时，应考虑到4/4死亡剂量组在正式实验时可能出现死亡率低于70%，为慎重起见可将4/4死亡剂量乘以1.4倍，作为Dmax。
以次类推，找出Dmin。
2. 剂量分组一般染毒组数(G)以5-8组为宜，组间剂量比值为r。
在确定组数后，按下列公式计算r。
1/(G-1)r = (Dmax/Dmin) 3. 受试物溶液的配制配制等比浓度的敌百虫溶液，并使每只动物在给药容量上相等(如0.5ml/20g)。
剂量按等比级数增减，相邻两剂量比值1:0.6,0.9，设5个剂量组。
实验二经口急性毒性试验
实验⼆经⼝急性毒性试验实验⼆经⼝急性毒性试验 The Standardization Office was revised on the afternoon of December 13, 2020毒理学实验⼆经⼝急性毒性试验⼀、实验⽬的1、掌握实验动物分组⽅法2、测定LD50的试验设计原则3、⼩⿏的经⼝灌胃技术⼆、试剂和材料1、实验动物：（1）动物品种：健康成年ICR⼩⿏，体重18g～22g（2）样品来源：⾸都医科⼤学实验动物部2、器材：注射器（1ml）、灌胃针头、烧杯、吸管、容量瓶、烧杯、棉签、动物秤。
3、试剂：敌敌畏（1400mg/ml）、苦味酸染液（标记⽤）。
三、实验内容1、健康实验动物的选择和性别鉴定选择健康的雄性⼩⿏（健康标准：⽑顺、⽑顺、⽆分泌物、反应敏锐。
动物出现圆圈动作可能为中⽿炎，废弃。
）肛门与⽣殖孔距离：⼤者为雄性，⼩者为雌性2、实验动物称重、编号和随机分组选择体重在18-22 g 的⼩⿏，采⽤随机分组的⽅法（动物按体重分为⼏个体重段，再从每个体重段分出各组动物），每组10只⼩⿏，⽤黄⾊的苦味酸饱和液标号1~9,10号⼩⿏不标记。
3、受试化学物溶液的配制（1）确定灌胃量：0.1ml/10g（2）确定最⾼给药量，计算溶液浓度，估计给药总体积（3）药品称量及稀释4、⼩⿏灌胃技术左⼿固定，右⼿持灌胃器，插⼊动物⼝腔，沿咽后壁徐徐插⼊⾷道，深度为⼝腔⾄剑突的距离。
5、毒性体征的观察和LD50计算（1）毒性体征的观察：染毒后注意观察⼩⿏中毒的发⽣、发展过程及死亡数和死亡时间按表格记录动物体征及出现时间，记录死亡情况及时间，观察期为30 min（2）LD50的计算：a 、实验各组剂量的确定：设5组，每组雌雄动物各10只。
剂量组距 d 为：1lg lg d 0100--=组数LD LD组数：各组死亡率：数相邻两组对数剂量之差：最⼤剂量的对数 P d :X )P P (d 21X lg 150i i k i i k LD ∑++-=)lg 96.1(lg lg 95%:1)P 1(P dlg 50501-50LD S LD ni ni LD S i i ±--=∑可信区间：实验动物数。
毒理学实验
实习一实验动物的一般操作技术一、目的和意义毒理学研究需要用实验动物来进行各种实验，通过对动物的实验观察和分析来研究毒作用，获得毒物的毒性、剂量-反应关系、毒作用机制等方面的资料，因此动物实验是毒理学研究中重要的手段之一。
通过本次实习学习毒理学实验中有关动物实验的基本操作技术，掌握实验动物的选择、动物抓取、染毒方法和生物材料的采集等技术。
二、内容（一）健康动物的选择无论选择哪种种属品系的动物进行实验，均要求选择健康的实验动物。
健康动物检查时要求达到：外观体型丰满，被毛浓密有光泽、紧贴体表，眼睛明亮，行动迅速，反应灵活，食欲及营养状况良好。
选择时重点检查以下项目：1.眼睛明亮，瞳孔双侧等圆，无分泌物。
2.耳耳道无分泌物溢出，耳壳无脓疮。
3.鼻无喷嚏，无浆性粘液分泌物。
4.皮肤无创伤、无脓疮、疥癣、湿疹。
5.颈部要求颈项端正，如有歪斜提示可能存在内耳疾患，不应选作实验动物。
6.消化道无呕吐、腹泻，粪便成形，肛门附近被毛洁净。
7.神经系统无震颤、麻痹。
若动物（大鼠、小鼠）出现圆圈动作或体位倒置呈圆圈摆动，应该放弃动物。
8.四肢及尾四肢、趾及尾无红肿及溃疡。
（二）实验动物的性别鉴定动物性别不同对毒物的敏感性也不同，这可能与性激素、肝微粒体羟基化反应有关，也随受试物而异。
因此，要根据实验要求选择性别，一般实验如对性别无特殊要求者，宜选用雌雄动物各半。
1.大鼠、小鼠主要依肛门与生殖孔间的距离区分，间距大者为雄性，小者为雌性。
成年雄鼠卧位可见到睾丸，雌性在腹部可见乳头。
2.豚鼠用在一只手抓住豚鼠颈部，另一只手把开靠近生殖器孔的皮肤，雄性动物在圆孔中露出性器官的突起，雌性动物则显出三角形间隙，成年雌性豚鼠胸部有两个乳头。
3.家兔将家兔头轻轻夹在实验者左腋窝下，左手按住腰背部，右手拉开尾巴并将尾巴夹在中指和无名指中间，然后用拇指和食指稍稍把生殖器附近的皮肤扒开。
雄兔即可见一圆孔中露出圆锥形稍向下弯曲的阴茎（但幼年雄兔看不到明显的阴茎，只能看到圆孔中有凸起物，即是阴茎）。
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毒理学实验二经口急性毒性试验
一、实验目的
1、掌握实验动物分组方法
2、测定LD50的试验设计原则
3、小鼠的经口灌胃技术
二、试剂和材料
1、实验动物：
(1)动物品种：健康成年ICR小鼠，体重18g〜22g
(2)样品来源：首都医科大学实验动物部
2、器材：注射器(1ml)、灌胃针头、烧杯、吸管、容量瓶、烧杯、棉签、动物
秤。
3、试剂：敌敌畏(1400mg/ml)、苦味酸染液(标记用)。
三、实验内容
1、健康实验动物的选择和性别鉴定
选择健康的雄性小鼠(健康标准：毛顺、毛顺、无分泌物、反应敏锐。
动物出现圆圈动作可能为中耳炎，废弃。
)
肛门与生殖孔距离：大者为雄性，小者为雌性
2、实验动物称重、编号和随机分组
选择体重在18-22 g的小鼠，采用随机分组的方法(动物按体重分为几个体重段，再从每个体重段分出各组动物)，每组10只小鼠，用黄色的苦味酸饱和液
标号1~9,10号小鼠不标记。
3、受试化学物溶液的配制
(1)确定灌胃量：0.1ml/10g
(2)确定最高给药量，计算溶液浓度，估计给药总体积
(3)药品称量及稀释
4、小鼠灌胃技术
左手固定，右手持灌胃器，插入动物口腔，沿咽后壁徐徐插入食道，深度为口腔至剑突的距离。
5、毒性体征的观察和LD50计算
(1)毒性体征的观察：
染毒后注意观察小鼠中毒的发生、发展过程及死亡数和死亡时间
按表格记录动物体征及出现时间，记录死亡情况及时间，观察期为30 min
(2) LD50的计算：
a 实验各组剂量的确定：设 5组，每组雌雄动物各10只 剂量组距d 为：
lg LD 100 一 lg LD 0
组数-1
d 为相邻两个剂量组剂量对数之差
利用lgLD0依次加d ,取反对数，即可得出各组剂量
b 、LD50的计算(见附件)：
1
lg LD 50 = X k d' (P i P i 1)
Xk:最大剂量的对数
d :相邻两组对数剂量之差 数
Pi :各组死亡率
i :组数
C 、求半数致死量的95%可信区间
标准误公式：
S lg LD 50 = d ni :实验动物数。
・1 lg (lg LD 50 - 1 .96 S lg LD 50 )
四、实验过程
1、人员分工：本次实习同学分两个大组(A 组和B 组)，分别在不同实验室。
每大
组分5个小组，分别处理雌雄动物，每小组 10只动物。
集体活动：1、2、3、4、5组各1人，进行受试物配制。
P i (1 - P i )
ni - 1
95% 可信区间:
各小组活动：
每小组1人（共4人），进行动物标记。
（1-10号）
每小组1人（共4人），进行体重记录。
（1-10号）
每小组1人（共4人），进行灌胃。
（1-10号）
每小组1人（共4人），根据体重吸取受试物（0.1ml/10g ）
五、剂量设计及受试物配制表
见附件
六、实验结果
1、 急性经口毒性试验原始记录（见附件）
2、 LD50计算表（见附件）
3、 结果计算（按照ppt 中所给的剂量设计及受试物配制表计算）
1
lgLD 50 二X k -一d' (P i P i 1)
2
=2.1747-1/2 X(( 0+0.35 ) + (0.35+0.2 ) +
(0.2+0.65 ) + (0.65+1 )) =1.8777
95%可信区间：lg -1
(lg LD 50 -1.96Slg LD 50) ■ ■ 1
95%可信区间：lg -
(1.8777 -1.96 X 0.0316) 即：65.4335~87.0162mg/Kg
七、实验结论与分析
1、 毒性物质敌敌畏为中等毒性，体重在18~22g 之间的雄性健康成年ICR 小鼠（来 源于首都医科大学实验动物部）经口急性染毒的
LD 50为
65.4335~87.0162mg/Kgo lg LD 100 一 lg LD 0
组数-1
=(lg500-lg100H= (0.6990-2 )詔=0.1747 P i (1 - P i ) ni -1 =0.1747 X 0.62 20-1 =0.0316 S lg LD
50 = d
2、毒性特征：小鼠在经口染毒后短时间内出现抽搐，躁动不安，麻痹，肌张力松弛，反应减弱，同时伴有呼吸加快，口吐白沫，鼻孔溢液，尿失禁，腹泻等症状，然后在10分钟左右死亡。
3、本组小鼠为径口染毒的最低剂量，没有出现死亡小鼠，观察过程中，6号小鼠出现亢奋，8号小鼠出现腹泻症状。
4、经过上述症状，可以看出敌敌畏急性毒性包括中枢神经系统与躯体感觉和运动系统毒性，呼吸系统毒性，消化系统毒性，泌尿毒性。
lg LD ioo -lg LD o
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