荧光原理
荧光的原理及应用
荧光光谱的测量 步骤
荧光光谱的应用 领域
荧光光谱在生物医学领域的应用：通过荧光光谱技术对生物分子进行检测和分析， 可用于疾病诊断、药物研发和生物成像等方面。
荧光光谱在环境科学领域的应用：通过荧光光谱技术对水体、土壤等环境样品中 的有机污染物进行检测和分析，可用于环境监测和污染治理等方面。
荧光光谱在化学分析领域的应用：通过荧光光谱技术对化学物质进行定性和定量 分析，可用于化学分析、材料科学和药物化学等领域。
激发态的稳定性：激发态不稳定，电子会释放能量回到基态
荧光发光过程：质吸收能量后，电子从基态跃迁至激发态，再回到基态时释放能量， 发出荧光光子
荧光物质吸收能量 电子从基态跃迁至激发态 电子从激发态返回基态时释放能量 发出荧光
PART FOUR
荧光颜色与物质组成：荧光颜色与物质组成密切相关，不同物质具有不同的荧光颜色。
激发态不稳定：激 发态不稳定，会释 放能量回到基态
释放能量：释放能 量以荧光的形式释 放
荧光物质：荧光物 质需要具有吸收能 量和释放能量的能 力
PART THREE
荧光物质吸收能量
电子从基态跃迁至激发态
激发态不稳定，释放能量 回到基态
释放能量以光的形式表现
激发态的形成：电子吸收能量从基态跃迁至激发态
PART SIX
高灵敏度：荧光技术具有高灵敏度， 能够检测到微量的荧光物质。
快速：荧光技术通常具有快速检测 的优点，可以在短时间内完成大量 样本的检测。
添加标题
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特异性：荧光技术具有特异性，能 够针对特定的目标进行检测。
方便：荧光技术通常使用简单的设 备和操作流程，方便用户使用。
荧光颜色与物质结构：物质结构对荧光颜色也有影响，如共轭体系的存在会导致荧光颜色发 生变化。
荧光材料原理
荧光材料原理
荧光材料是一种具有荧光特性的材料，其原理是通过吸收能量后发出可见光。
具体而言，荧光材料的原理可以归纳为以下几个方面：
1. 激发过程：荧光材料能够吸收外部能量，激发其内部的电子或分子从低能级跃迁至高能级。
这些能量可以来自于光照射、电子束、电磁场等。
2. 能级结构：荧光材料的能级结构中包含基态和激发态能级。
基态是材料处于平衡状态时的能级，激发态是材料被外界能量激发后的能级。
3. 荧光发射：当荧光材料处于激发态时，其激发态能级的电子或分子会经过非辐射跃迁返回基态。
在这个过程中，荧光材料会发出能量差与光子能量相等的光子，也就是可见光。
这个过程被称为荧光发射。
4. 能量差：荧光材料激发态能级与基态能级之间的能量差决定了所发出的荧光光子的波长，从而决定了光的颜色。
不同的荧光材料具有不同的能级结构，因而会发射不同波长的光。
5. 光衰减：荧光材料的发光强度会随着时间的推移逐渐衰减，这是因为在荧光发射过程中，有一部分能量会以非辐射的方式转化为热能。
衰减速率取决于材料的性质以及外部环境的条件。
通过对荧光材料的设计和合成，可以控制其能级结构和能量差，
从而实现不同颜色的荧光发射。
荧光材料在荧光显示器、荧光笔、荧光染料等领域有着广泛的应用。
荧光法原理
荧光法原理一、引言荧光法是一种广泛应用于生命科学、化学和物理学等领域的分析方法，它基于物质在受到激发后发出荧光的原理，通过测量荧光强度来确定样品中所含物质的浓度或性质。
本文将详细介绍荧光法的原理及其应用。
二、荧光现象1. 荧光定义当某些物质受到能量激发后，会发生从低能级到高能级的跃迁，并随即从高能级向低能级跃迁时放出辐射，这种辐射称为荧光。
与磷光不同，荧光是在吸收外部能量后立即放出的辐射。
2. 荧光特性荧光具有以下特性：（1）波长长：通常波长范围在200-700 nm之间；（2）持续时间短：持续时间通常在10-9秒至10-6秒之间；（3）强度低：通常比吸收强度低几个数量级；（4）受环境影响大：如溶剂极性、温度、pH值等。
三、激发和发射1. 激发荧光分析中，样品通常通过吸收紫外线、可见光或其他形式的电磁辐射来激发。
当吸收的能量与物质的电子跃迁到高能级时，就会激发荧光现象。
2. 发射激发后，物质在返回基态时会放出辐射，即荧光。
荧光具有一定的波长范围和强度，可以通过荧光仪来测量。
四、荧光仪测量1. 荧光仪构造荧光仪由以下部分组成：（1）激发源：产生激发波长的灯或激光器；（2）样品室：容纳待测样品；（3）检测器：检测样品放出的荧光；（4）滤波器：挑选特定波长的荧光信号。
2. 测量原理荧光信号经过滤波器后被检测器检测到，并转换为电信号。
然后经过放大和处理后输出到计算机或记录装置上。
根据不同实验要求可以选择不同的滤波器和检测器。
五、应用领域1. 生命科学荧光法在生命科学中应用广泛，如荧光定量PCR、荧光原位杂交、蛋白质分离和检测等。
2. 化学分析荧光法在化学分析中应用较多，如气相色谱、液相色谱、毒素检测等。
3. 材料科学荧光法在材料科学中也有应用，如纳米材料的表征等。
六、总结荧光法是一种灵敏度高、选择性好的分析方法。
它广泛应用于生命科学、化学和物理学等领域。
通过测量样品放出的荧光信号，可以确定样品中所含物质的浓度或性质。
荧光原理技术介绍
样品处理要求高
对于某些荧光物质，需要进行复杂的样品处理和分离，才能进行检测， 这可能会增加检测的复杂性和时间成本。
05 荧光技术的发展趋势
高灵敏度荧光检测技术
总结词
高灵敏度荧光检测技术是荧光技术的重要发展方向，通过提高检测的灵敏度和特异性， 能够更准确地检测生物分子和细胞活性。
详细描述
荧光生物成像在生命科学研究领域应用广泛，如细胞生物学、神经科学、药理学等，可用于研究细胞 结构、细胞功能、基因表达和蛋白质相互作用等。
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04 荧光技术的优缺点
优点
高灵敏度
选择性
荧光技术具有很高的灵敏度，可以检测到 非常微量的物质，因此在生物医学、环境 监测等领域有广泛应用。
荧光物质可以选择性地与某些物质结合， 从而实现选择性检测，有助于区分不同的 物质。非破坏性Fra bibliotek可视化
荧光检测通常不会对样品造成破坏，可以 用于对样品进行原位检测。
检测。
荧光染料有多种分类方式，如根 据激发波长、发射波长、荧光颜 色等进行分类，以满足不同应用
需求。
荧光蛋白
荧光蛋白是一类具有生物活性的荧光物质，常用于生物标记、示踪和成像等研究领 域。
荧光蛋白具有高亮度、稳定性好、易于基因编码等优点，能够实现活体细胞和组织 的高灵敏度荧光标记。
荧光蛋白有多种类型，如绿色荧光蛋白（GFP）、红色荧光蛋白（RFP）等，可根据 实验需求选择不同波长的荧光蛋白。
总结词
多色荧光成像技术是荧光技术的重要发展方向之一，通过同时检测多种荧光信号，能够实现多参数、多维度的生 物分子和细胞活性分析。
荧光物质发光原理
荧光物质发光原理
荧光物质发光原理是指当某些物质受到激发能量后，能够吸收能量并在一定条
件下发出可见光的现象。
荧光物质是一种特殊的物质，它们在受到激发后能够发出特定波长的光，这一现象被称为荧光发光。
荧光物质的发光原理是通过激发态和基态之间的能量转换来实现的。
首先，当荧光物质受到外部能量激发时，其电子会跃迁至一个较高的能级，形
成激发态。
这个激发态的存在是短暂的，因为电子会很快返回到基态。
在电子返回到基态的过程中，它会释放出能量，这些能量以光的形式发射出来，形成荧光发光。
荧光物质发光的原理可以通过量子力学来解释。
在量子力学中，电子的能级是
离散的，即电子只能在特定的能级上存在。
当荧光物质受到激发能量时，电子会跃迁至一个高能级，形成激发态。
然后，电子会很快返回到低能级，释放出能量。
这个能量的差值对应着特定的波长，因此荧光物质会发出特定波长的光。
荧光物质发光原理的应用非常广泛。
在日常生活中，荧光物质被广泛应用于荧
光灯、荧光笔、荧光涂料等产品中。
在科学研究和工业生产中，荧光物质也扮演着重要的角色，例如在荧光显微镜、标记技术、荧光染料等领域都有着重要的应用。
总的来说，荧光物质发光原理是一种特殊的能量转换现象，它通过电子的跃迁
和能级之间的能量差来实现。
荧光物质发光原理不仅在科学研究和工业生产中有着重要的应用，而且也给我们的日常生活带来了诸多便利。
对于荧光物质发光原理的深入研究，不仅有助于我们更好地理解自然界的现象，而且也为新材料的研发和应用提供了重要的理论基础。
荧光基本概念和原理
荧光基本概念和原理⼀、简介 某些物质被⼀定波长的光照射时，会在较短时间内发射出波长⽐⼊射光长的光（⼊射光的⼀部分能量被该物质吸收，使得发射出来的光较原来的光能量低、波长长），这种光就称为荧光。
1852年，Stokes阐明了荧光发射的机制，认为荧光是由于物质吸收了光能⽽重新发出的波长不同的光，并由⼀种能发荧光的矿物-----萤⽯(fluospar)⽽定名为荧光。
我们通常所说的荧光，是指物质在吸收紫外光后发出的波长较长的紫外荧光或可见荧光，以及吸收波长较短的可见光后发出波长较长的可见荧光。
除了紫外荧光和可见荧光，还有红外荧光、X射线荧光等。
荧光光谱有两个主要优点：第⼀是灵敏度⾼。
由于荧光辐射的波长⽐激发光波长长，因此测量到的荧光频率与⼊射光的频率不同。
另外，由于荧光光谱是发射光谱，可以在与⼊射光成直⾓的⽅向上检测，这样，荧光不受来⾃激发光的本底的⼲扰，灵敏度⼤⼤⾼于紫外-可见吸收光谱。
第⼆，荧光光谱可以检测⼀些紫外-可见吸收光谱检测不到的过程。
紫外和可见荧光涉及的是电⼦能级之间的跃迁，荧光产⽣包括两个过程：吸收以及随之⽽来的发射。
每个过程发⽣的时间与跃迁频率的倒数是同⼀时间量级(⼤约10-15秒)，但两个过程中有⼀个时间延迟，⼤约为10-9秒，这段时间内分⼦处于激发态。
激发态的寿命取决于辐射与⾮辐射之间的竞争。
由于荧光有⼀定的寿命，因此可以检测⼀些时间过程与其寿命相当的过程。
例如，⽣⾊团及其环境的变化过程在紫外吸收的10-15秒的过程中基本上是静⽌不变的，因此⽆法⽤紫外吸收光谱检测，但可以⽤荧光光谱检测。
⼆、荧光的产⽣ 吸收外来光⼦后被激发到激发态的分⼦，可以通过多种途径丢失能量，回到基态，这种过程⼀般称为弛豫。
在很多情况下，分⼦回到基态时，能量通过热量等形式散失到周围。
但是在某些情况下，能量能以光⼦发射的形式释放出来。
由电⼦态基态被激发到第⼀电⼦激发态中各振动能级上的分⼦，⼀般会以某种形式(统称为内转换)丢失它们的部分能量，从第⼀电⼦激发态的不同振动能级以⾄从第⼆电⼦激发态等更⾼的电⼦激发态返回第⼀电⼦激发态的最低振动能级。
荧光物体的发光原理
荧光物体的发光原理荧光物体的发光原理是通过荧光效应实现的。
荧光效应是指物质在吸收外部能量后，通过发射辐射能量的方式发光。
在荧光物体中，发光的过程可以分为三个主要步骤：吸收能量、激发和发射。
首先，荧光物体会吸收外部能量，通常是光线或电磁波的能量。
这些能量会被物质中的特定分子或原子吸收，使得它们进入激发态。
激发态是分子或原子处于高能量状态，它们的电子轨道处于激发态。
接下来，激发态的分子或原子会经历非辐射跃迁。
这是指分子或原子在短暂的时间内从激发态回到基态，但并不发射光线能量。
在这个过程中，分子或原子中的电子会经历一系列跃迁，从初始激发态经过中间态逐渐回到基态。
最后，分子或原子从基态发射光线能量的过程称为辐射跃迁。
这是指电子从较高能级跃迁到较低能级的过程中释放出能量，并以光的形式发射出来。
这发射出的光线的能量与电子跃迁前后的能级差有关，也就是说发射的光线的颜色是由能级差决定的。
荧光物体之所以可以发出比吸收的光线波长长的光线，是因为在非辐射跃迁的过程中，其中的一部分能量通过振动和转动等方式转化为热能而消耗掉了，只有一部分能量以光的形式发出。
荧光物体的发光原理可以通过能级的观念来解释。
分子或原子的能级是指其电子处于不同能量状态时的状态。
当分子或原子处于基态时，电子处于最低能级。
当外部能量被吸收，分子或原子的电子被激发到更高的能级中，这些能级之间的差异可以表示为能级图。
荧光物体的分子或原子中存在着能级间隔较小的激发态，因此它们可以吸收较低能量的光线，比如紫外线或蓝光。
当吸收的光线能量被转化为激发态的能量后，分子或原子会经历非辐射跃迁，释放出部分能量，然后再通过辐射跃迁释放出光线。
这个跃迁的过程是非常快速的，通常在纳秒级别。
荧光物体和其他发光物体（如发光二极管或LED）的区别在于，荧光物体通过吸收外部光线能量进行发光，而LED则是通过半导体材料的电子跃迁来实现发光。
总结起来，荧光物体的发光原理是通过外部能量的吸收，使分子或原子进入激发态，然后经过非辐射和辐射跃迁，最终以光线的形式发射出能量。
荧光的原理及应用
➢3.发射荧光的激发态多为（π，π*）态，这种激发态较基态 时有更大的极性，因此将在更大程度上为极性溶剂所稳定，使 激发态的能量进一步降低。
反斯托克位移
不过，有时在高温下也可观察到反斯托克位移现象，即荧光光谱移向
吸收光谱的短波方向。这是由于高温使更多的激发态分子处于高振动 能级，荧光主要从激发态的高振动能级发出所致。
既没发生斯托克位移也没发生反斯托克位移的荧光称共振荧光。
镜像规则
荧光发射是光吸收的逆过程。荧光发射光谱与吸收光谱有类似镜影 的关系。但当激发态的构型与基态的构型相差很大时，荧光发射光 谱将明显不同于该化合物的吸收光谱。
分子能级与跃迁
分子能级比原子能级复杂； 在每个电子能级上，都存在振动、转动能级；
激发： 基态(S0)→激发态(S1、S2激发态振动能级)：吸收
特定频率的辐射；量子化；跃迁一次到位；
失活： 激发态 →基态：多种途径和方式(见能级图)；速
度最快、激发态寿命最短的途径占优势；
第一、第二、…电子激发单重态 S1 、S2… ； 第一、第二、…电子激发三重态 T1 、T2 … ；
荧光光谱与磷光光谱
荧光光谱
固定激发光波长物质发射的荧光强度与发 射光波长关系曲线，如右图中曲线II。 荧光本身则是由电子在两能级间不发生自 旋反转的辐射跃迁过程中所产生的光。
磷光光谱
固定激发光波长物质发射的磷光强度与 发射光波长关系曲线，如右图中曲线III。 磷光本身则是由电子在两能级间发生自旋 反转的辐射跃迁过程中所产生的光。
寿命和这些过程的速率常数有关，总的失活过程的速率常数k可以
用各种失活过程的速率常数之和来表示:
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陶 亮
中山医学院药理学教研室
光的基本知识
一、光的本质：光是一种可见的电磁波，是能量的辐射形式 光的波长越长，光子的能量越小 光波 γ射线 X线 远紫外 紫外 可见光 红外 远红外 微波 无线电波 波长 10-5～10-3nM 10-4～0.1nM 10 ～20nM 200～400nM 400～760nM 0.76～50μM 50～1000μM 0.1～100cM 1～100M
二. 细胞骨架荧光探针
F-肌动蛋白荧光探针— BONIPY FL, BONIPY 558/568 G-肌动蛋白荧光探针—DNase I+荧光素 Alexa Fluor 488 Oregon Green 488 Texas Red
微管蛋白荧光探针 —
秋水仙减+荧光素 DAPI DCVJ Bis-ANS Flutax-2 BODIPY FL Placlitaxel BODIPY 564/570 Placlitaxel
GFP的应用：
GFP, CFP, BFP, YFP商品化质粒
1. 转基因动物: Green mouse
2. 外源基因的报告基因: 将外源基因与GFP DNA 相连, 可实时监测外源基因的表达.
3. 检测细胞能否表达某一基因: 将待测基因的启动子与 GFP DNA 相连, 可实时监测细胞能否表达兴趣基因.
二. 光的性质：
粒子性 —— 光子（光量子） 波动性 —— 光沿直线传播，在与它前进方向垂直的平面内呈波形振动 波长 — 光的颜色 振幅 — 光的亮度
波长
波长长（频率低）— 光子能量小 波长短（频率高）— 光子能量大
振 幅
三. 光的吸收
光进入某物质后，部分或全部的光能可被物质的分子或原子 所吸收。 物质吸收能量后进入激发态，当物质从激发态回到基态时， 以电磁辐射的形式（或热）放出所吸收的能量——发射光。
Emission Spectrum
λ
EX
Wavelength
λ
EM
激发光谱和发射光谱的用途
激发光谱—确定荧光素适宜的激发波长的依据
最大激发波长 λEX
发射光谱—确定荧光素检测波长的依据
最大发射波长λEM
激发光谱和发射光谱可用来鉴别荧光物质 — 每一种荧光物质都有其特定的激发光谱和发射光谱
（3）荧光强度
化学荧光在有生命的生物体中产生 — 生物发光
无论那种荧光，其发光机理是相同的
3.荧光素(荧光物质，荧光染料，荧光探针)
—
能够产生荧光的化合物
发射荧光的光量子数 荧光效率= —————————— 吸收光的光量子数 反应物质将吸收的光能转变成荧光的效率—越大越好
荧光素的荧光效率>0.35
斯托克斯位移（Stokes shift）
荧光染料的发展简史
1838年 1852年 1903年 1911年 1935年 Brewster首次描述了荧光现象 Stokes发现并描述荧光物质（荧光染料） Wood设计出可选择透过紫外光的滤光片 Reicherl发明荧光显微镜 Haitinger 将荧光物质用于固定的细胞和 组织，活细胞染色
新的荧光探针，新的检测技术不断出现
微管选择性紫杉醇探针—
三.研究钙调节和活性的荧光探针
钙调蛋白荧光探针 — 钙的类似物三氯化忒
PKC荧光探针—用BODIPY标记的佛波酯或乙酰辅酶A荧光探针 Quin-2-AM 紫外光激活 Fura-2-AM Fura-3-AM — 可见光激活
钙离子荧光探针
三.核酸荧光探针
能以非共价键与DNA/RNA结合，用于DNA/RNA的定性、定量分析 SYTO AO Hoechst DAPI EB和PI PO-PRO和BO-PRO AAD ACMA
荧光强度 —— 荧光素发射荧光的光量子数
决定荧光素检测的灵敏度
荧光素的荧光效率决定其荧光强度
（4）荧光寿命
荧光寿命（激发态寿命）—电子在激发态的平均停留时间
荧光寿命长 — 检测特异性和灵敏度高
（5）荧光漂白
荧光物质受激发时，其发射荧光的能力逐渐下降并最终丧失
—— 漂白 （6）自发荧光
组织或细胞中的某些成份受激发时可发出荧光 — 自发荧光
发射光波长 > 激发光波长
根据荧光素的激发光波长和发射光波长选择光源和滤光片
（2）激发光谱和发射光谱
荧光素的激发光谱和发射光谱反映了该荧光素的光化学性质
激发光谱 — 荧光素的荧光发射强度随激发光波长变化的光谱 吸收光谱
发射光谱 — 荧光素的荧光发射强度随发射光波长变化的光谱
Excitation Spectrum
3.流式细胞仪（FCM）
对处在快速直线流动细胞状态中的细胞或生物颗粒进
行快速定量分析和分选；用于把指定参数参量的细胞
亚群从整群细胞中分选出来。
4.小动物活体成像系统
对荧光素标记的生物分子和细胞在整体水平进行检测
活细胞内离子动态变化测量
可变换波长的荧光分光光度计 可变换波长的荧光显微镜 激光共聚焦显微系统
荧光技术已用于整体、器官、细胞、分子水平生命现象的研究
常用的荧光染料（探针）
一. 细胞器荧光探针
—— 能渗透到细胞内，选择性地与细胞器结合的荧光物质。 可用于固定和活细胞细胞器的染色 线粒体荧光探针——JC-1, Rhodamine 123 溶酶体荧光探针——DAMP，Neutral Red 内质网荧光探针—— Dioc6(3),Dioc5（3）,Dioc16(3) 高尔基体荧光探针—— NBD Ceramide, BODIPY Ceramide
4. GFP-蛋白融合技术: 将结构蛋白基因与GFP DNA 相 连可实时监测结构蛋白的表达亚细胞结构的形成
荧光检测仪器
1. 荧光分光光度计
用于大容积样本（ul,ml)的测量
2. 荧光显微镜（激光共聚焦荧光显微镜）
用于具有三维立体形状的样本（如细胞、组织切片等）的测量 荧光显微镜
激光共聚焦荧光显微镜
光的吸收具有选择性 — 一定能量的光量子辐射只能被一定结构的物质吸收
滤光片— 吸收一定波长范围的光，允许特定波长的光通过
三.荧光的基本知识
（一）荧光 — 物质中的电子吸收光的能量由低能状态转变为 高能状态，再回到低能状态时释放出的光
荧光是冷光，颜色为蓝、绿、红和黄色
2. 荧光产生的原理
由光激发的荧光 — 光致荧光 由化学反应引起的荧光 — 化学荧光 由X射线引起的荧光 — X射线荧光 由激光引起的荧光 — 激光荧光
• 物质在激发过程中吸收的能量，要高于荧光发射的能量。
• 荧光素的发射波长总是大于其激发波长。 • 两者的差值 — 斯托克斯位移（Stokes shift）； — 激发到发射过程中存在能量损失
hvEX— hvEM = 荧光效率
利用斯托克斯位移现象，分离激发光和发射光
4. 荧光素的性质
（1）激发光波长和发射光波长 激发光波长——近紫外区域，可见光区域 荧光素 发射光波长——可见光区域
蓝色荧光
GFP
绿色荧光
GFP的特性与优点
GFP的特性： 1.GFP的光谱特性 — 最大激发波长— 460-490 nm 发射波长 — 500-550 nm 2. GFP的分子量小（20kDa）—当与其它蛋白组成融合蛋白 时，不影响结合蛋白的功能 GFP的优点： 1.可溶性蛋白，性质稳定 2.荧光强，易加工到其它蛋白质序列上 3.无进入细胞问题，标记可靠 4.表达GFP融合物的细胞，可在生活状态下进行实验和检测 5.对细胞无毒
KCL诱导的细胞外Ca++内流测量
KCL
KCL
胞膜透过性核酸荧光探针 — 用于细胞染色
非透过性核酸荧光探针—用于DNA琼脂凝胶电泳
受体 酶
四. 其它荧光探针…
绿色荧光蛋白（GFP）及其衍生物
1.GFP的发现：60年代，Shimomura等首先从水母中分离出一
种水母发光蛋白 (aequoren)，该蛋白与钙和
肠腔素结合后可产生蓝色荧光。 Ca2+ Aequoren + 肠腔素 然而水母整体提取的颗粒都呈绿色，后经证实在水母体内还存在 另外一种发光蛋白即绿色荧光蛋白（green fluorescent protein GFP）