ELISA IL-6(人白介素) 操作流程
绵羊白介素6IL-6酶联免疫分析ELISA
绵羊白介素6(IL-6)酶联免疫分析（ELISA）试剂盒使用说明书本试剂仅供研究使用目的：本试剂盒用于测定其它血清，血浆及相关液体样本中白介素6(IL-6)的含量。
实验原理：本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中绵羊白介素6(IL-6)水平。
用纯化的绵羊白介素6(IL-6)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入白介素6(IL-6)，再与HRP标记的白介素6(IL-6)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。
TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。
颜色的深浅和样品中的白介素6(IL-6)呈正相关。
用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中绵羊白介素6(IL-6)浓度。
样本处理及要求：1. 血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。
2. 血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。
3. 尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。
胸腹水、脑脊液参照实行。
4. 细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。
离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清。
检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。
通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。
离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清。
保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。
5. 组织标本：切割标本后，称取重量。
加入一定量的PBS，PH7.4。
用液氮迅速冷冻保存备用。
标本融化后仍然保持2-8℃的温度。
Human IL-6 ValukineTM ELISA操作手册说明书
PRODUCT INFORMATION&MANUAL Human IL-6Valukine TM ELISAVAL102For the quantitative determination of natural and recombinant human Interleukin6(IL-6)concentrationsFor research use only.Not for diagnostic or therapeutic procedures.Bio-Techne China Co.LtdP:+86(21)52380373P:8009881270F:+86(21)52381001**********************Please refer to the kit label for expiry date.Novus kits are guaranteed for3months from date of receiptVersion202209.5TABLE OF CONTENTSI.BACKGROUND (2)II.OVERVIEW (3)III.ADVANTAGES (4)IV.EXPERIMENT (7)V.KIT COMPONENTS AND STORAGE (8)VI.PREPARATION (10)VII.ASSAY PROCEDURE (12)VIII.REFERENCES (13)I.BACKGROUNDInterleukin6(IL-6)is a pleiotropicα-helical22-28kDa phosphorylated and variably glycosylated cytokine that plays important roles in the acute phase reaction, inflammation,hematopoiesis,bone metabolism,and cancer progression(1-5).Mature human IL-6is183amino acids(aa)in length and shares41%aa sequence identity with mouse and rat IL-6(6).Alternate splicing generates several isoforms with internal deletions,some of which exhibit antagonistic properties(7-10).Cells known to express IL-6include CD8+T cells,fibroblasts,synoviocytes,adipocytes,osteoblasts, megakaryocytes,endothelial cells(under the influence of endothelins),sympathetic neurons,cerebral cortex neurons,adrenal medulla chromaffin cells,retinal pigment cells,mast cells,keratinocytes,Langerhans cells,fetal and adult astrocytes,neutrophils, monocytes,eosinophils,colonic epithelial cells,B1B cells,and pancreatic islet beta cells(2,7,10-33).IL-6production is generally correlated with cell activation and is normally kept in control by glucocorticoids,catecholamines,and secondary sex steroids (2).Normal human circulating IL-6is in the1pg/mL range,with slight elevations during the menstrual cycle,modest elevations in certain cancers,and large elevations after surgery(34-38).IL-6induces signaling through a cell surface heterodimeric receptor complex composed of a ligand binding subunit(IL-6R)and a signal transducing subunit(gp130).IL-6binds to IL-6R,triggering IL-6R association with gp130and gp130dimerization(39).Gp130 is also a component of the receptors for CLC,CNTF,CT-1,IL-11,IL-27,LIF,and OSM (40).Soluble forms of IL-6R are generated by both alternative splicing and proteolytic cleavage(3).In a mechanism known as trans-signaling,complexes of soluble IL-6and IL-6R elicit responses from gp130-expressing cells that lack cell surface IL-6R(1,3). Trans-signaling enables a wider range of cell types to respond to IL-6,as the expression of gp130is ubiquitous,while that of IL-6R is predominantly restricted to hepatocytes,monocytes,and resting lymphocytes(1-3).Soluble splice forms of gp130 block trans-signaling from IL-6/IL-6R but not from other cytokines that use gp130as a co-receptor(3,41).IL-6,along with TNF-αand IL-1,drives the acute inflammatory response,is almost solely responsible for fever and the acute phase response in the liver,and is important in the transition from acute inflammation to either acquired immunity,or chronic inflammatory disease(1-4).It contributes to chronic inflammation in conditions such as obesity,insulin resistance,inflammatory bowel disease,inflammatory arthritis and sepsis when dysregulated,often involving IL-6trans-signaling(1,2).It also plays an important role in the differentiation of naive T cells to Th17inflammatory cells in the presence of TGF-β.IL-6modulates bone resorption and is a major effector of inflammatory joint destruction in rheumatoid arthritis through its promotion of Th17T cell activity(1).It contributes to atherosclerotic plaque development and destabilization(2). However,IL-6can also have anti-inflammatory effects,such as in skeletal muscle where it is secreted in response to exercise(2).It promotes hematopoiesis by being a growth factor for hematopoietic stem cells,induces B cell maturation to plasma cells and perpetuates multiple myeloma(1,42).IL-6also promotes,but probably does not initiate,other types of inflammation-associated carcinogenesis,such as colitis-associated cancer(1).II.OVERVIEWA.PRINCIPLE OF THE ASSAYThis assay employs the quantitative sandwich enzyme immunoassay technique.A monoclonal antibody specific for IL-6has been pre-coated onto a microplate.Standards and samples are pipetted into the wells and any IL-6present is bound by the immobilized antibody.After washing away any unbound substances,an enzyme-linked polyclonal antibody specific for IL-6is added to the wells.Following a wash to remove any unbound antibody-enzyme reagent,a substrate solution is added to the wells and color develops in proportion to the amount of IL-6bound in the initial step.The color development is stopped and the intensity of the color is measured.B.LIMITATIONS OF THE PROCEDURE♦FOR RESEARCH USE ONLY.NOT FOR USE IN DIAGNOSTIC PROCEDURES.♦This kit is suitable for cell culture supernate,serum and plasma.♦The kit should not be used beyond the expiration date on the kit label.♦Do not mix or substitute reagents with those from other lots or sources.♦If samples generate values higher than the highest standard,dilute the samples with Diluent and repeat the assay.♦Any variation in operator,pipetting technique,washing technique,incubation time or temperature,and kit age can cause variation in binding.III.ADVANTAGESA.PRECISIONIntra-assay Precision(Precision within an assay)Three samples were tested twenty times on one plate to assess intra-assay precision. Inter-assay Precision(Precision between assays)Three samples were tested in twenty separate assays to assess inter-assay precision.Intra-assay Precision Inter-assay PrecisionSample123123Mean(pg/mL)20.677.817523.983.3177Standard Deviation 1.20 3.517.33 4.2013.325.5CV% 5.8 4.5 4.217.615.914.4B.RECOVERYThe recovery of human IL-6spiked to levels throughout the range of the assay in various matrices was evaluated.Sample Type Average%Recovery RangeCell culture media(n=4)9581-104%Serum(n=3)9380-99%Plasma(n=4)9681-109%C.SENSITIVITYThe minimum detectable dose(MDD)of IL-6is typically less than1.56pg/mL.The MDD was determined by adding two standard deviations to the mean optical density value of twenty zero standard replicates and calculating the corresponding concentration.D.CALIBRATIONThis immunoassay is calibrated against highly purified E.coli-expressed recombinant human IL-6produced at R&D Systems.The NIBSC/WHO1st International Standard for IL-6(89/548),which was intended as a potency standard,was evaluated in this kit.The NIBSC/WHO standard is a CHO cell-derived recombinant human IL-6.The dose response curve of the International Standard(89/548)parallels the Valukine standard curve.To convert sample values obtained with the Valukine Human IL-6kit to approximate NIBSC89/548units,use the equation below.NIBSC(89/548)approximate value(IU/mL)=0.109×Valukine Human IL-6value (pg/mL)E.LINEARITYTo assess the linearity of the assay,samples were spiked with high concentrations of human IL-6in various matrices and diluted with Diluent1×to produce samples with values within the dynamic range of the assay.Dilution Cell culture media(n=4)Serum(n=3)Plasma(n=4)1:2Average%of Expected11210299 Range(%)105-117101-10289-106 1:4Average%of Expected111106101 Range(%)104-119102-11195-107 1:8Average%of Expected9710899 Range(%)91-105103-11693-104 1:16Average%of Expected8910998 Range(%)81-98102-11790-107 F.SAMPLE VALUESCell Culture Supernates-Human peripheral blood mononuclear cells(1×106cells/mL) were cultured in RPMI supplemented with10%fetal calf serum,50μM β-mercaptoethanol,2mM L-glutamine,100U/mL penicillin,and100μg/mL streptomycin sulfate and stimulated for3days with10μg/mL PHA.An aliquot of the cell culture supernate was removed,assayed for levels of natural IL-6,and measured6640 pg/mL.Serum-Three human serum samples were evaluated for the presence of human IL-6 in this assay.All samples measured ranged from20.5to62.5pg/mL with an average of 48.0pg/mL.Plasma-Four human plasma samples were evaluated for the presence of human IL-6 in this assay.All samples measured ranged from73.5to105pg/mL with an average of 88.6pg/mL.G.SPECIFICITYThis assay recognizes both natural and recombinant human IL-6.The following factors were prepared at50ng/mL and assayed for cross-reactivity.Preparations of the following factors at50ng/mL in a mid-range rhIL-6control were assayed for interference.No significant cross-reactivity or interference was observed.Recombinant human Recombinant mousesgp130IL-6IL-6sRIL-6sR/sgp130IV.EXPERIMENTEXAMPLE STANDARDThe standard curve is provided for demonstration only.A standard curve should be generated for each set of samples assayed.V.KIT COMPONENTS AND STORAGEA.MATERIALS PROVIDEDParts Description SizeHuman IL-6 Microplate 96well polystyrene microplate(12strips of8wells)coated with a mouse monoclonal antibodyagainst human IL-61plateHuman IL-6 Conjugate Solution of polyclonal antibody againsthuman IL-6conjugated to horseradishperoxidase1vialHuman IL-6 Standard recombinant human IL-6in a buffered proteinbase;lyophilized1vialCalibrator Diluent(5×)a5×concentrated buffered protein base1vialWash BufferConcentrate(25×)a25×concentrated solution of buffered surfactant1vial TMB Substrate TMB ELISA Substrate Solution2vials Stop Solution2N sulfuric acid1vial Plate Sealers adhesive strip3stripsB.STORAGEUnopened Kit Store at2-8°C.Do not use past kit expiration date.Opened/ Reconstituted Reagents Diluted Wash BufferMay be stored for up to1month at2-8°C.*Stop SolutionDiluent1×ConjugateTMB SubstrateStandardAliquot and store for up to1month at-20°C in a manual defrost freezer.*Avoid repeated freeze-thaw cycles. Microplate WellsReturn unused wells to the foil pouchcontaining the desiccant pack,resealalong entire edge of zip-seal.May bestored for up to1month at2-8°C.**Provided this is within the expiration date of the kit.C.OTHER SUPPLIES REQUIRED♦Microplate reader capable of measuring absorbance at450nm,with the correction wavelength set at540nm or570nm.♦Pipettes and pipette tips.♦Deionized or distilled water.♦Squirt bottle,manifold dispenser,or automated microplate washer.♦500mL graduated cylinder.D.PRECAUTIONThe Stop Solution provided with this kit is an acid solution.Wear eye,hand,face,and clothing protection when using this materialVI.PREPARATIONA.SAMPLE COLLECTION AND STORAGECell Culture Supernates-Remove particulates by centrifugation and assay immediately or aliquot and store samples at≤-20°C.Avoid repeated freeze-thaw cycles. Samples may require dilution with Calibrator Diluent1×.Serum-Use a serum separator tube(SST)and allow samples to clot for30minutes at room temperature before centrifugation for15minutes at1000x g.Remove serum and assay immediately or aliquot and store samples at≤-20°C.Avoid repeated freeze-thaw cycles.Plasma-Collect plasma using EDTA,heparin,or citrate as an anticoagulant. Centrifuge for15minutes at1000x g within30minutes of collection.Assay immediately or aliquot and store samples at≤-20°C.Avoid repeated freeze-thaw cycles.B.SAMPLE PREPARATIONSerum samples require a5-fold dilution.A suggested5-fold dilution is40μL of sample +160μL of Diluent(1×).Plasma samples require a2-fold dilution.A suggested2-fold dilution is100μL of sample+100μL of Diluent(1×).C.REAGENT PREPARATIONNote:Bring all reagents to room temperature before use.Wash Buffer-If crystals have formed in the concentrate,warm to room temperature and mix gently until the crystals have completely dissolved.Dilute20mL of Wash Buffer Concentrate(25×)into deionized or distilled water to prepare500mL of Wash Buffer. Diluent1×-Add20mL of Calibrator Diluent Concentrate5×into80mL of deionized or distilled water to prepare100mL of Diluent1×.IL-6Standard-Refer to the vial label for reconstitution volume*.This reconstitution produces a stock solution of300pg/mL.Allow the standard to sit for a minimum of15 minutes with gentle agitation prior to making dilutions.*if you have any question,please seek help from our Technical Support.Pipette667μL of Diluent1×into the100pg/mL tube.Pipette500μL of Diluent 1×into each remaining e the stock solution to produce a dilution series (below).Mix each tube thoroughly before the next transfer.The undiluted standard serves as the high standard(300pg/mL).The Diluent1×serves as the zero standard(0 pg/mL).D.TECHNICAL HINTS●When mixing or reconstituting protein solutions,always avoid foaming.●To avoid cross-contamination,change pipette tips between additions of eachstandard level,between sample additions,and between reagent additions.Also, use separate reservoirs for each reagent.●It is recommended that the samples be pipetted within15minutes.●To ensure accurate results,proper adhesion of plate sealers during incubationsteps is necessary.●TMB Substrate should remain colorless until added to the plate.Keep SubstrateSolution protected from light.Substrate Solution should change from colorless to gradations of blue.●Stop Solution should be added to the plate in the same order as the SubstrateSolution.The color developed in the wells will turn from blue to yellow upon addition of the Stop Solution.Wells that are green in color indicate that the Stop Solutionhas not mixed thoroughly with the Substrate Solution.VII.ASSAY PROCEDURENote:Bring all reagents and samples to room temperature before use.It is recommended that all samples and standards be assayed in duplicate.1.Prepare all reagents and working standards as directed in the previous sections.2.Remove excess microplate strips from the plate frame,return them to the foil pouchcontaining the desiccant pack,and reseal.3.Add100μL of Standard,sample,or control per well.Cover with the adhesive stripprovided.Incubate for2hours at room temperature.A plate layout is provided for a record of standards and samples assayed.4.Aspirate each well and wash,repeating the process three times for a total of fourwashes.Wash by filling each well with Wash Buffer(400μL)using a squirt bottle, manifold dispenser,or plete removal of liquid at each step is essential to good performance.After the last wash,remove any remaining Wash Buffer by aspirating or decanting.Invert the plate and blot it against clean paper towels.5.Add200μL of human IL-6Conjugate to each well.Cover with a new adhesive strip.Incubate for2hours at room temperature.6.Repeat the aspiration/wash as in step4.7.Add200μL of TMB Substrate to each well.Incubate for20minutes at roomtemperature.Protect from light.8.Add50μL of Stop Solution to each well.The color in the wells should change fromblue to yellow.If the color in the wells is green or if the color change does not appear uniform,gently tap the plate to ensure thorough mixing.9.Determine the optical density of each well within10minutes,using a microplatereader set to450nm.If wavelength correction is available,set to540nm or570nm.If wavelength correction is not available,subtract readings at540nm or570nm from the readings at450nm.This subtraction will correct for optical imperfections in the plate.Readings made directly at450nm without correction may be higher and less accurate.10.CALCULATION OF RESULTS：Average the duplicate readings for each standard,control,and sample and subtract the average zero standard optical density.Createa standard curve by reducing the data using computer software capable ofgenerating a four parameter logistic(4-PL)curve-fit.As an alternative,construct a standard curve by plotting the mean absorbance for each standard on the y-axis against the concentration on the x-axis and draw a best fit curve through the points on the graph.The data may be linearized by plotting the log of the IL-6 concentrations versus the log of the O.D.and the best fit line can be determined by regression analysis.This procedure will produce an adequate but less precise fit of the data.If samples have been diluted,the concentration read from the standard curve must be multiplied by the dilution factor.VIII.REFERENCES1.Naugler,W.E.and M.Karin(2008)Trends Mol.Med.14:109.2.Schuett,H.et al.(2009)Thromb.Haemost.102:215.3.Jones,S.A.(2005)J.Immunol.175:3468.4.Hodge,D.R.et al.(2005)Eur.J.Cancer41:2502.5.Rose-John,S.et al.(2006)J.Leukoc.Biol.80:227.6.Van Snick,J.et al.(1988)Eur.J.Immunol.18:193.7.Kestler,D.P.et al.(1995)Blood86:4559.8.Kestler,D.P.et al.(1999)Am.J.Hematol.61:169.9.Bihl,M.P.et al.(2002)Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.27:48.10.Alberti,L.et al.(2005)Cancer Res.65:2.11.May,L.T.et al.(1986)A83:8957.12.Sad,S.et al.(1995)Immunity2:271.13.Cichy,J.et al.(1996)mun.227:318.14.Miyazawa,K.et al.(1998)Am.J.Pathol.152:793.15.Fried,S.K.et al.(1998)Endocrinology83:847.16.Ishimi,Y.et al.(1990)J.Immunol.145:3297.17.Jiang,S.et al.(1994)Blood84:4151.18.Xin,X.et al.(1995)Endocrinology136:132.19.Marz,P.et al.(1998)A95:3251.20.Ringheim,G.E.et al.(1995)J.Neuroimmunol.63:113.21.Gadient,R.A.et al.(1995)Neurosci.Lett.194:17.22.Kuppner,M.C.et al.(1995)Immunology84:265.23.Gagari,E.et al.(1997)Blood89:2654.24.Cumberbatch,M.et al.(1996)Immunology87:513.25.Fujisawa,H.et al.(1997)J.Interferon Cytokine Res.17:347.26.Lee,S.C.et al.(1993)J.Immunol.150:2659.fortune,L.et al.(1996)J.Neuropathol.Exp.Neurol.55:515.28.Ericson,S.G.et al.(1998)Blood91:2099.29.Melani,C.et al.(1993)Blood81:2744.cy,P.et al.(1998)Blood91:2508.31.Jung,H.C.et al.(1995)J.Clin.Invest.95:55.32.Spencer,N.F.L.and R.A.Daynes(1997)Int.Immunol.9:745.33.Campbell,I.L.et al.(1989)J.Immunol.143:1188.34.D’Auria,L.et al.(1997)Eur.Cytokine Netw.8:383.35.Yamamura,M.et al.(1998)Br.J.Haematol.100:129.36.Angstwurm,M.W.A.et al.(1997)Cytokine9:370.37.Mouawad,R.et al.(1996)Clin.Cancer Res.2:1405.38.Sakamoto,K.et al.(1994)Cytokine6:181.39.Murakami,M.et al.(1993)Science260:1808.40.Muller-Newen,G.(2003)Sci.STKE2003:PE40.41.Mitsuyama,K.et al.(2006)Clin.Exp.Immunol.143:125.42.Cerutti,A.et al.(1998)J.Immunol.160:2145.产品信息及操作手册人IL-6Valukine TM ELISA试剂盒目录号：VAL102适用于定量检测天然和重组人白介素6（IL-6）的浓度科研专用，不可用于临床诊断Bio-Techne China Co.LtdP:+86(21)52380373P:8009881270F:+86(21)52381001**********************有效期详见试剂盒包装标签Novus试剂盒确保在你收货日期3个月内有效目录I.背景 (18)II.概述 (19)III.优势 (20)IV.实验 (23)V.试剂盒组成及储存 (24)VI.实验前准备 (26)VII.操作步骤 (28)VIII.参考文献 (29)白细胞介素-6（IL-6）是一个具有α螺旋结构、22-28kDa的磷酸化和不同程度糖基化的多功能细胞因子，它在疾病急性期反应、炎症、造血、骨代谢以及癌症恶化等方面起重要作用（1-5）。
小鼠白介素6试剂盒的实验原理和操作步骤
小鼠白介素6试剂盒的实验原理和操作步骤实验原理：试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。
往预先包被白介素6(IL-6)捕获抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并洗涤。
用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。
颜色的深浅和样品中的白介素6(IL-6)呈正相关。
用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度（OD 值），计算样品浓度。
操作步骤：1. 从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。
2. 设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；3. 样本孔中加入待测样本50μL；空白孔不加。
4. 除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。
5. 弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（350μL），静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。
6. 每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。
7. 每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。
注意事项1. 严格按照规定的时间和温度进行温育以保证准确结果。
所有试剂都必须在使用前达到室温20-25℃。
使用后立即冷藏保存试剂。
2. 洗板不正确可以导致不准确的结果。
在加入底物前确保尽量吸干孔内液体。
温育过程中不要让微孔干燥掉。
3. 消除板底残留的液体和手指印，否则影响OD值。
4. 底物显色液应呈无色或很浅的颜色，已经变蓝的底物液不能使用。
5. 避免试剂和标本的交叉污染以免造成错误结果。
6. 在储存和温育时避免强光直接照射。
7. 平衡至室温后再打开密封袋以防水滴凝聚在冷板条上。
8. 任何反应试剂不能接触漂白溶剂或漂白溶剂所散发的强烈气体。
任何漂白成分都会破坏试剂盒中反应试剂的生物活性。
ELISA操作规程
ELISA操作规程引言概述ELISA（酶联免疫吸附试验）是一种常用的实验技术，用于检测特定蛋白质或其他分子在生物样本中的存在和浓度。
本文将详细介绍ELISA的操作规程，包括实验前的准备工作、样本处理、试剂配制、板上实验步骤和结果分析等内容。
一、实验前的准备工作1.1 样本准备：收集样本时应注意避免污染和交叉污染，避免冻融次数过多。
样本应在规定时间内处理，避免长时间存放。
1.2 试剂准备：根据实验方案准备所需的试剂，如稀释缓冲液、洗涤缓冲液、底物液等，确保试剂的质量和稳定性。
1.3 仪器准备：准备好ELISA板阅读器和洗板机等设备，确保仪器的正常运行和校准。
二、样本处理2.1 样本稀释：根据实验需求将样本进行适当的稀释，以确保浓度在标准曲线的线性范围内。
2.2 样本处理：对于血清或血浆样本，应先离心去除悬浮物，避免干扰因子的影响。
2.3 样本保存：处理完样本后，应储存于-20℃或更低的温度下，避免多次冻融。
三、试剂配制3.1 稀释缓冲液：根据实验方案准确称取试剂，按照比例稀释，确保最终浓度符合实验要求。
3.2 洗涤缓冲液：配制洗板机所需的洗涤缓冲液，保证洗板的干净程度。
3.3 底物液：根据实验方案配制底物液，确保底物液的质量和稳定性。
四、板上实验步骤4.1 包被：将包被抗体加入到板上，孵育一定时间后洗涤，使包被抗体固定在板上。
4.2 加样本：加入样本和标准品，孵育一定时间后洗涤，去除未结合的物质。
4.3 加底物：加入底物液，孵育一定时间后停止反应，加入停止液终止反应。
五、结果分析5.1 读板：使用ELISA板阅读器测定吸光度值，绘制标准曲线并计算样本的浓度。
5.2 数据处理：根据实验方案进行数据处理，包括样本浓度的计算和结果的统计分析。
5.3 结果解释：根据实验结果进行数据解释，得出结论并撰写实验报告。
总结：ELISA操作规程是一项重要的实验技。
四正柏生物 小鼠IL-6 ELISA试剂盒说明书
REV20190712仅供研究，不用于临床诊断。
客服热线: 400-7060-959﹡技术支持邮箱: **************公司官网: 目录简介 ........................................................................................................................................................... - 3 -检测原理 ................................................................................................................................................... - 3 -试剂盒组分 ............................................................................................................................................... - 4 -储存条件 ................................................................................................................................................... - 5 -其他实验材料(不提供，但可协助购买) : ............................................................................................. - 5 -注意事项 ................................................................................................................................................... - 5 -样本收集处理及保存方法 ....................................................................................................................... - 6 -试剂准备 ................................................................................................................................................... - 6 -操作步骤 ................................................................................................................................................... - 8 -操作流程图 ............................................................................................................................................... - 8 -操作要点提示 ........................................................................................................................................... - 9 -结果判断 ................................................................................................................................................... - 9 -结果重复性 ............................................................................................................................................. - 10 -灵敏度 ..................................................................................................................................................... - 10 -特异性 ..................................................................................................................................................... - 10 -参考文献 ................................................................................................................................................. - 10 -该产品由北京四正柏生物科技有限公司研制。
用ELISA试剂盒检测人白介素6IL-6的浓度
双抗体夹心ELISA法检测样本中IL-6的浓度人IL-6简介：白介素6（IL-6）是一类多功能的蛋白，在宿主防御，急性期反应，免疫反应，造血功能，神经系统等方面起到重要的作用。
白介素6根据来源不同是分子量从21到28kDa不同的单链蛋白。
白介素6在多种细胞中都有表达，如T细胞、巨噬细胞、纤维原细胞、肝细胞、血管内皮细胞等。
由于IL-6具有不同的活性，所以IL-6也被称为干扰素β2(IFN-β2)、B细胞刺激因子-2(BSF-2)、杂交瘤细胞生长因子、肝细胞刺激因子、毒性T细胞分化因子、巨噬细胞粒细胞诱导因子(MGI-2A)。
白细胞介素6在B-细胞向Ig分泌细胞的转化过程起到重要的作用，参与了淋巴细胞和单核细胞的分化，诱导神经细胞在B-细胞，T-细胞，肝细胞，造血干细胞以及中枢神经系统的分化作用。
此外，肌肉运动收缩作用后白细胞介素6会被释放到血液中，进而能促进脂肪的分解并改善机体的胰岛素耐受性。
检测原理:本试剂盒采用双抗体夹心ELISA法检测样本中IL-6的浓度。
IL-6捕获抗体已预包被于酶标板上，当加入标本或参考品时，其中的IL-6会与捕获抗体结合，其它游离的成分通过洗涤的过程被除去。
当加入生物素化的抗人IL-6抗体后，抗人IL-6抗体与IL-6接合，形成夹心的免疫复合物，其它游离的成分通过洗涤的过程被除去。
随后加入辣根过氧化物酶标记的亲合素。
生物素与亲合素特异性结合，亲合素连接的酶就会与夹心的免疫复合物连接起来；其它游离的成分通过洗涤的过程被除去。
最后加入显色剂，若样本中存在IL-6将会形成免疫复合物，辣根过氧化物酶会催化无色的显色剂氧化成蓝色物质，在加入终止液后呈黄色。
通过酶标仪检测，读其450nm处的OD值，IL-6浓度与OD450值之间呈正比，通过参考品绘制标准曲线，对照未知样本中OD值，即可算出标本中IL-6浓度。
标本收集:1.标本的收集请按下列流程进行操作：A.细胞上清标本离心去除悬浮物后即可；B.血清标本应是自然凝固后，取上清，避免在冰箱中凝固血液；C.血浆标本，推荐用EDTA的方法收集；D.若待测样本不能及时检测，标本收集后请分装，冻存于－20℃，避免反复冻融。
不同方法学白介素6标准
不同方法学白介素6标准白介素6检测的不同方法学探讨白介素6（IL-6）是一种多功能细胞因子，在免疫调节、炎症反应以及多种疾病的发生和发展过程中起着重要作用。
因此，准确检测白介素6的含量对于基础研究和临床应用具有重要意义。
本文将探讨几种不同的白介素6检测方法，并分析其优缺点。
1. 酶联免疫吸附法（ELISA）酶联免疫吸附法是一种常用的检测白介素6的方法，其原理是利用酶标记的抗体与待测样本中的白介素6结合，形成酶-抗体-抗原复合物，然后通过底物显色反应来定量检测白介素6的含量。
这种方法具有灵敏度高、特异性强、操作简便等优点，适用于大批量样本的检测。
但是，ELISA方法也存在一些局限性，如操作过程中容易受到温度、时间等因素的影响，导致结果的不稳定性。
2. 放射免疫分析法（RIA）放射免疫分析法是一种利用放射性同位素标记的抗体来检测白介素6的方法。
这种方法具有灵敏度高、准确性好的特点，尤其适用于微量白介素6的检测。
然而，由于RIA方法涉及到放射性物质的操作和处理，对实验条件和操作人员的要求较高，且存在一定的安全隐患，因此在一般实验室中的应用受到一定限制。
3. 化学发光免疫分析法（CLIA）化学发光免疫分析法是一种基于化学发光原理来检测白介素6的方法。
该方法利用化学发光物质标记的抗体与白介素6结合后产生的化学发光信号进行定量检测。
CLIA方法具有灵敏度高、线性范围宽、操作简便等优点，且无需使用放射性物质，因此在实际应用中得到了广泛推广。
但是，CLIA方法的试剂成本相对较高，且发光信号的稳定性可能受到多种因素的影响。
4. 荧光免疫分析法（FIA）荧光免疫分析法是一种利用荧光标记的抗体来检测白介素6的方法。
该方法通过荧光信号的强弱来定量检测白介素6的含量，具有灵敏度高、特异性好的特点。
同时，FIA方法还可以实现多色荧光的同时检测，适用于复杂样本中多种细胞因子的同时测定。
但是，FIA方法需要专业的荧光检测设备，且荧光信号可能受到光漂白等因素的影响。
人白介素IL试剂盒的操作说明书
人白介素I L试剂盒的操作说明书Document serial number【UU89WT-UU98YT-UU8CB-UUUT-UUT108】人白介素6（IL-6）试剂盒的操作说明书人白介素6（IL-6）试剂盒的操作说明书本试剂盒仅供研究使用。
检测范围：96T0-8ng/L使用目的：本试剂盒用于测定人血清、血浆及相关液体样本中白介素6（IL-6）含量。
实验原理本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人白介素6（IL-6）水平。
用纯化的人白介素6（IL-6）抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入白介素6（IL-6），再与HRP标记的白介素6（IL-6）抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。
TMB在 HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。
颜色的深浅和样品中的白介素6（IL-6）呈正相关。
用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中人白介素6（IL-6）浓度。
试剂盒组成130倍浓缩洗涤液20ml×1瓶7终止液6ml×1瓶2酶标试剂6ml×1瓶8标准品（16ng/L）0.5ml×1瓶3酶标包被板12孔×8条9标准品稀释液1.5ml×1瓶4样品稀释液6ml×1瓶10说明书1份5显色剂A液6ml×1瓶11封板膜2张6显色剂B液6ml×1/瓶12密封袋1个标本要求1．标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。
若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融2．不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。
操作步骤1.标准品的稀释：本试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照下列图表在小试管中进行稀释。
8ng/L5号标准品150μl的原倍标准品加入150μl标准品稀释液4ng/L4号标准品150μl的5号标准品加入150μl标准品稀释液2ng/L3号标准品150μl的4号标准品加入150μl标准品稀释液1ng/L2号标准品150μl的3号标准品加入150μl标准品稀释液0.5ng/L1号标准品150μl的2号标准品加入150μl标准品稀释液2.加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准孔、待测样品孔。
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人白介素6（IL—6）酶联免疫吸附测定试剂盒
使用说明书
产品编号：1910231
本试剂盒仅供体外研究使用、不用于临床诊断！
预期应用
ELISA法定量测定人血清、血浆、细胞培养上清或其它相关生物液体中IL—6含量。
实验原理
用纯化的IL-6抗体包被微孔板，制成固相载体,往微孔中依次加入标本或标准品、生物素化的IL-6抗体、HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物（TMB）显色。
TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。
颜色的深浅和样品中的IL—6呈正相关.用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（值），计算样品浓度.
试剂盒组成及试剂配制
1、酶标板：一块(96孔)
2、标准品（冻干品)：2瓶，请临用前15分钟内配制。
每瓶以样品稀释液稀释至1ml，盖好
后室温静置大约10分钟，同时反复颠倒/搓动以助溶解,其浓度为10,000 pg/ml,将其稀释为500 pg/ml后，再做系列倍比稀释（注：不要直接在板中进行倍比稀释），分别配制成500 pg/ml，250 pg/ml,125 pg/ml，62.5 pg/ml，31。
2 pg/ml，15。
6 pg/ml,7。
8 pg/ml，样品稀释液直接作为空白孔 0 pg/ml.如配制500 pg/ml标准品：取0.5ml （不要少于
0.5ml ）500 pg/ml的上述标准品加入含有0。
5ml样品稀释液的Eppendorf管中,混匀即
可，其余浓度以此类推.
3、样品稀释液:1×25ml.
4、人白介素6:1×25ml。
5、HRP,100X：1×150/瓶(1:100）.临用前以HRP1：100稀释（如：10 HRP / 990 HRP稀释
液)，充分混匀，稀释前根据预先计算好的每次实验所需的总量配制（100/孔），实际配制时应多配制0。
1-0。
2ml。
6、HRP稀释剂：1×12ml。
7、浓洗涤液:1×50ml/瓶。
使用时每瓶用蒸馏水稀释10倍。
8、底物溶液：1×12ml/瓶，
9、终止液：1×12ml/瓶(2 mol/L H2SO4）。
10、覆膜：4张
11、使用说明书：1份
自备物品
1、酶标仪（建议仪器使用前提前预热）
2、微量加液器及吸头,EP管
3、蒸馏水或去离子水，滤纸
标本的采集及保存
1、血清：全血标本请于室温放置2小时或4过夜后于1000g离心20分钟，取上清即可检测，
或将上清置于—20或—80保存，但应避免反复冻融.
2、血浆：可用EDTA或肝素作为抗凝剂,标本采集后30分钟内于 1000g离心15分钟，取上
清即可检测，或将上清置于-20或-80保存，但应避免反复冻融.
3、细胞培养物上清或其它生物标本:请1000g离心20分钟，取上清即可检测，或将上清置
于—20或-80保存，但应避免反复冻融。
注：以上标本均应密封保存，4保存应小于1周，-20不应超过1个月，-80不应超过2个月;
标本溶血会影响最后检测结果,因此溶血标本不宜进行此项检测。
操作步骤
实验开始前,各试剂均应平衡至室温，试剂不能直接在室温溶解；试剂或样品配制时,均需充分混匀，混匀时尽量避免起泡。
实验前应预测样品含量，如样品浓度过高时，应对样品进行稀释，以使稀释后的样品符合试剂盒的检测范围，计算时再乘以相应的稀释倍数。
1、加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。
空白孔加样品稀释液100，余孔分别加标准
品或待测样品100，注意不要有气泡，加样时将样品加于酶标板底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，酶标板加上盖或覆膜,室温温育2小时。
为保证实验结果有效
性,每次实验请使用新的标准品溶液。
2、洗涤：弃掉板孔中的液体，加满洗涤液，静止放十秒,洗四次，最后在毛巾或吸水纸上拍干
板子：
3、每孔加HRP（临用前配制）100，加上覆膜,室温温育1小时。
4、洗涤：同第二步.
5、每孔加底物溶液100，酶标板加上覆膜室温避光显色(反应时间控制在15-30分钟,当标准
孔的前3—4孔有明显的梯度蓝色，后3—4孔梯度不明显时，即可终止）。
6、每孔加终止溶液100，终止反应，此时蓝色立转黄色.终止液的加入顺序应尽量与底物液
的加入顺序相同，立即渎数。
7、立即用酶标仪在450nm波长测量各孔的光密度（值）。
注：
1、试剂准备:所有试剂在使用前应平衡至室温，使用后请立即按照说明书要求保存试剂。
实
验操作中请使用一次性的吸头，避免交叉污染。
2、加样：加样或加试剂时,第一个孔与最后一个孔加样之间的时间间隔如果太大,将会导致不同
的“预温育”时间，从而明显地影响到测量值的准确性及重复性。
一次加样时间（包括标准品及所有样品）最好控制在10分钟内。
推荐设置复孔进行实验.
3、温育：为防止样品蒸发,实验时将加上盖或覆膜的酶标板置于湿盒内，以避免液体蒸发；
洗板后应尽快进行下步操作，任何时侯都应避免酶标板处于干燥状态；同时应严格遵守给定的温育时间和温度。
4、洗涤：洗涤过程中反应孔中残留的洗涤液应在滤纸上拍干,勿将滤纸直接放入反应孔中吸
水,同时要消除板底残留的液体和手指印，避免影响最后的酶标仪读数。
5、反应时间的控制：加入底物后请定时观察反应孔的颜色变化（比如，每隔10分钟）,如颜
色较深,请提前加入终止液终止反应，避免反应过强从而影响酶标仪光密度读数。
6、底物:底物请避光保存,在储存和温育时避免强光直接照射.
洗板方法
1、手工洗板方法：将推荐的洗涤缓冲液至少0.4ml注入孔内，浸泡1—2分钟,吸去（不可
触及板壁）或甩掉酶标板内的液体，在实验台上铺垫几层吸水纸，酶标板朝下用力拍几次；根据需要，重复此过程数次。
2、自动洗板：如果有自动洗板机，应在熟练使用后再用到正式实验过程中。
特异性
本试剂盒可同时检测重组或天然的人IL-6，且与其它相关蛋白无交叉反应.
计算
各标准品及样本值扣除空白孔值后作图(七点图），如设置复孔，则应取其平均值计算。
以标准品的浓度为纵坐标（对数坐标），值为横坐标（对数坐标），在对数坐标纸上绘出标准曲线.推荐使用专业制作曲线软件进行分析，如curve expert1。
3，根据样品值，由标准曲线查出相应的浓度，乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与值计算出标准曲线的回归方程式，将样品的值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度.
检测范围：7。
8 pg/ml - 500 pg/ml，绘制标准曲线请取用以下浓度值：500 pg/ml,250 pg/ml，125 pg/ml，62。
5 pg/ml，31。
2 pg/ml,15。
6 pg/ml，7。
8 pg/ml.
最低检测限:7.8 pg/ml。