淋巴细胞分离与计数
猪脾脏淋巴细胞分离
加入Hank‘s液后，要混匀
为了彻底洗涤淋巴细胞的分离液 残留，一般需要重复洗涤一次。
计数
取一滴细胞悬液与一滴0.2％台盼兰染液混合
• 先在低倍镜 下找到中方 格区域，再 在中倍镜下 进行细胞计 数。
五、注意事项
• 往分离液加组织液时，要沿着管壁，缓慢
加入，避免它们互混。
• 密度梯度离心后，弃去上层血浆时，要尽
量轻，切勿打破形成的分层。
• 细胞计数时，要等量加入细胞悬液和台盼 蓝染液，结果也要2倍。
• 整个实验操作要尽量快，避免细胞过度死 亡。
思考题
• 1、台盘蓝染液如何配置？
• 2、你认为本次试验成败的关键因素是什么 ？应该怎样把握？
文献分析。
猪脾脏淋巴细胞分离与细胞计数
华南农业大学生命科学学院微生ห้องสมุดไป่ตู้学教研室 张玲华课题组
一、实验目的
• 掌握密度梯度离心的原理及方法 • 掌握细胞计数板的工作原理及使用方法
二、实验原理
• 聚蔗糖(Ficoll)-泛影葡胺(Urografin)(F／H)分层液 (商品名为淋巴细胞分离液) ,比重 1.077±0.001 。
四、实验操作
• 破碎 • 分离 • 洗涤 • 计数
机械破碎（细胞筛） 密度梯度离心 Hank’s液多次离心 细胞计数板
破碎并过筛
• 剪一小块脾脏（先用Hank‘s液清洗掉表面 的杂物），置于细胞筛（放在平皿上）中， 用针头不断搓烂组织块，同时用Hank’s液 （5mL）将细胞洗到平皿中。
转移组织液
• 红细胞、粒细胞比重大，约为1.090，离心后沉于 管底；淋巴细胞和单核细胞的比重小于或等于分 层液比重，约为1.075，离心后漂浮于分层液的液 面上，也可有少部分细胞悬浮在分层液中；血小 板的比重最小，约为1.030，离心后浮于分层液上 面。
人外周血淋巴细胞分离、计数、活力测定临床免疫学实验报告
实验温度：18℃湿度：32% 实验时间：2012年11月8日实验八、人外周血淋巴细胞分离、计数、活力测定【实验目的】1.通过该实验掌握外周血淋巴细胞分离、计数的方法。
2.有助于观察机体免疫状态。
【实验原理】人外周血RBC、粒细胞比重为：1.092，单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞，比重为1.075，因此选用一种比重介于二者之间而近于等渗的淋巴细胞分离液（比重为1.077±0.001）进行密度梯度离心，离心后不同比重的血细胞在分离液中呈梯度分布，从而分离出单个核细胞（淋巴细胞）。
【实验材料】1．肝素溶液用生理盐水将肝素配成125～250 U/ml的溶液，置4℃下保存备用。
2．淋巴细胞分层液市售或自配，20℃时密度应为(1.077±0.001)g/L。
3．Hanks液pH 7.2～7.4。
4．完全RPMI-1640培养液。
5．15 ml或50 ml锥底离心管。
6．水平离心机，显微镜。
7．玻璃吸管，滴管，细胞计数板等。
8．2％台盼蓝染液。
【实验步骤】1.采集静脉血3ml，注入盛有肝素的无菌小瓶中（每ml全血加0.1 ml 肝素溶液），立即轻轻摇匀，使血液抗凝。
2.用吸管加入等量Hanks液，使血液等倍稀释。
3.吸取淋巴细胞分离液2ml置于离心管中，然后将上述稀释血液在距分离液界面上1cm处沿试管壁缓慢叠加至分离液表面。
应注意保持两界面清晰，勿使血液混入分层液内。
4.将离心管置水平式离心机内，在18～20℃下，以2000 r/min离心20min，离心后，管内分层如下图所示5.用毛细吸管轻轻插入灰白细胞层，沿管壁轻轻吸出该层单个核细胞，转入另一支离心管中。
6.将所得到的单个核细胞悬液用5倍体积的HanK’s洗涤2次，每次以1500 r/min 离心10 min，弃上清。
7.混悬细胞，沉淀加1640培养液1ml，摇匀。
8.计数细胞：取0.1ml细胞悬液，加WBC稀释液0.9ml，混匀，静止片刻，冲池，低倍镜下计数四大格细胞总数。
淋巴细胞实验报告
1. 了解淋巴细胞转化实验的基本原理和方法。
2. 掌握淋巴细胞转化实验的操作步骤。
3. 分析实验结果，探讨不同刺激条件对淋巴细胞转化能力的影响。
二、实验原理淋巴细胞转化实验是一种常用的细胞学实验方法，用于研究淋巴细胞的活性和功能。
在实验过程中，淋巴细胞受到有丝分裂原或抗原刺激后，会发生增殖和转化，从而增加细胞数量。
根据转化过程的不同，可分为自发转化和体外诱导转化两种形式。
本实验采用体外诱导转化方法，通过加入化合物或病毒等诱导剂刺激淋巴细胞，观察细胞转化情况。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 人外周血- RPMI-1640培养液- 细胞分离液- 淋巴细胞刺激剂（如植物血凝素、刀豆蛋白A等）- 台盼蓝染色剂- 流式细胞仪- 显微镜2. 实验仪器：- 移液器- 培养箱- 恒温水浴箱- 染色缸- 计数板1. 淋巴细胞分离：采集人外周血，用细胞分离液进行分层，收集淋巴细胞。
2. 细胞培养：将分离的淋巴细胞用RPMI-1640培养液稀释，接种于培养皿中，置于培养箱中培养。
3. 淋巴细胞转化：向培养皿中加入淋巴细胞刺激剂，培养一段时间后，收集细胞。
4. 细胞染色：将收集的细胞用台盼蓝染色，显微镜下观察细胞形态。
5. 流式细胞仪检测：将染色的细胞用流式细胞仪检测，分析细胞转化率。
五、实验结果与分析1. 细胞形态观察：显微镜下可见，未经刺激的淋巴细胞体积较小，呈圆形或椭圆形；经过刺激的淋巴细胞体积增大，呈多边形或不规则形。
2. 流式细胞仪检测：经过刺激的淋巴细胞转化率为60%，未经刺激的淋巴细胞转化率为20%。
3. 不同刺激条件对淋巴细胞转化能力的影响：- 植物血凝素（PHA）刺激：淋巴细胞转化率为70%。
- 刀豆蛋白A（ConA）刺激：淋巴细胞转化率为65%。
- 无刺激：淋巴细胞转化率为20%。
六、实验结论本实验通过淋巴细胞转化实验，观察到淋巴细胞在受到刺激后发生转化，转化率随刺激剂的不同而有所差异。
结果表明，植物血凝素和刀豆蛋白A对淋巴细胞转化能力具有显著的促进作用。
淋巴细胞培养方法
淋巴细胞培养方法引言：淋巴细胞是免疫系统中的重要组成部分，对于研究免疫学以及治疗免疫相关疾病具有重要意义。
淋巴细胞的培养是研究淋巴细胞功能和特性的关键步骤。
本文将介绍一种常用的淋巴细胞培养方法，以帮助读者了解淋巴细胞培养的基本原理和操作步骤。
一、材料准备1. 培养基：常用的淋巴细胞培养基包括RPMI 1640培养基、DMEM培养基等，可根据实验需要选择合适的培养基。
2. 补充物：培养基中常需添加胎牛血清(FBS)、人血清(HS)等，以提供细胞所需的营养和生长因子。
3. 抗生素：如青霉素、链霉素等，以防止细菌污染。
4. 受试者淋巴细胞：可以通过外周血或淋巴组织等方式获取。
二、淋巴细胞的分离1. 密度梯度离心法：将受试者淋巴细胞与离心管中的淋巴细胞分离液缓慢加入离心管中，离心分离液的密度逐渐由低到高，使淋巴细胞在不同密度的离心分离液之间分层离心。
离心后，淋巴细胞会沉积在特定密度的离心分离液上，可将淋巴细胞分离出来。
2. 磁珠分离法：利用表面标记有特定抗体的磁珠与淋巴细胞表面的特异抗原结合，通过磁场将目标淋巴细胞与其他细胞分离。
三、淋巴细胞的培养1. 细胞计数：使用细胞计数板或细胞计数仪准确计算淋巴细胞的数量。
2. 细胞密度调整：根据实验需求，将细胞悬浮液中的淋巴细胞浓度调整至适当的浓度，通常为1-2 × 10^6个细胞/mL。
3. 培养基配制：根据实验需要，将培养基加热至37℃后，加入适量的补充物和抗生素，混匀均衡。
4. 细胞培养：将细胞悬浮液与预先配制好的培养基按照适当的比例混合，转移到细胞培养瓶或培养皿中。
5. 培养条件：将细胞培养瓶或培养皿置于37℃恒温培养箱中，设置适当的CO2浓度和湿度，通常为5% CO2和95%湿度。
定期观察细胞形态和生长情况。
6. 培养周期：根据实验需求，定期更换新鲜的培养基，一般为2-3天一次，以保证细胞的正常生长和代谢。
四、细胞活性检测1. 活细胞计数：使用染色剂如Trypan blue染色，观察染色细胞和未染色细胞的比例，以评估细胞的存活率。
淋巴细胞的分离及鉴定
淋巴细胞的分离及鉴定离⼼分离技术与淋巴细胞分离及鉴定【实验⽬的】1.了解离⼼分离技术的原理与分类。
2.掌握应⽤密度梯度离⼼法分离单个核细胞及B淋巴细胞鉴定的⽅法。
【实验原理】1.利⽤离⼼⼒将悬浮液中的悬浮微粒快速沉降，借以分离⽐重不同的各种物质成分。
因此⽤⽐重与被分离细胞⽐重相近的细胞分离液则可通过密度梯度离⼼⽅法，在分离液界⾯上收集到所需要的单个核细胞。
2.⽤过氧化物酶标记的抗IgM，在⼀定条件下与淋巴细胞混合，标记的抗IgM抗体可以与B细胞表⾯的IgM结合，通过DAB显⾊，在普通光学显微镜下观察可见细胞膜上出现特定染⾊。
【实验步骤】⼀.细胞分离1.将⼩⿏⽤颈椎脱⾅法处死，解剖左侧腹腔靠上部位，将腹膜剪开，找到并取出脾脏。
2.将脾脏置于培养⽫内100⽬筛⽹上，加⼊8ml的⽣理盐⽔，⽤磨棒磨碎脾脏后过滤，即获得脾细胞混合悬液。
3.1500rpm,5min,离⼼细胞混合悬液，弃部分上清，调整体积⾄4ml,重悬细胞。
4.取盛有3ml细胞离⼼液（⽐重1.088）的试管⼀⽀，⽤移液器加⼊细胞混合液4ml。
5.将试管离⼼1800rpm，（上升和下降率为2）20℃30min。
6.离⼼后取出试管，观察细胞分层，底层为红⾊的红细胞，依次向上为细胞分离液和⽣理盐⽔，在此之间可见⼀层淡淡地⽩⾊细胞层。
7.⽤尖吸管⼩⼼取出中层间的细胞到另⼀洁净离⼼管，并加2ml PBS洗涤⼀次，1500rpm离⼼5min后去上清。
8.再将细胞均匀悬浮于0.1ml PBS中，取出10µl滴于黏附剂处理的载玻⽚上，⾃然⼲燥后，可进⾏细胞类型鉴定。
⼆.细胞鉴定1.分离出单个核细胞并取出10µl滴于黏附剂处理的载玻⽚左右各⼀滴涂⽚，⾃然⼲⽚2.在室温条件下，⽤甲醇固定细胞，⾃然⼲燥后⽤蜡笔标出细胞范围，蒸馏⽔洗三次。
3.配制封闭液。
室温浸泡30分钟，PBS洗3次。
4.滴加适当稀释（1:100）的过氧化物酶标记的兔抗⼩⿏IgM抗体于左侧涂⽚，滴加适量的封闭液于右侧涂⽚（做阴性对照），于37℃30分钟，PBS洗2分钟3次。
淋巴细胞计数的原理及实验步骤
淋巴细胞计数的原理及实验步骤淋巴细胞计数是一种常见的实验方法，用于血液学，免疫学和病理学研究。
淋巴细胞是免疫系统的重要组成部分，参与免疫应答和疾病的发展。
淋巴细胞计数可以帮助研究员了解免疫系统的状态和疾病的进展。
以下是淋巴细胞计数的原理及实验步骤。
原理淋巴细胞计数是通过显微镜观察和计数淋巴细胞的数量来完成的。
在制备血样涂片时，使用染色剂（如Wright染料）染色，以使淋巴细胞更容易被观察和计数。
对于每个血样片，必须计数100个淋巴细胞。
实验步骤1.采集血液样本：从患者、动物或健康受试者的静脉或尾静脉采集血液样本。
2.制备血样涂片：在玻璃片上制备血样涂片，使用染色剂染色。
3.显微镜观察和计数：使用显微镜观察和计数100个淋巴细胞。
根据计数结果，计算淋巴细胞的百分比。
淋巴细胞计数可以通过以下公式计算：淋巴细胞计数 = 计数的淋巴细胞数÷总计数的细胞数×100％4.数据处理：将淋巴细胞计数数据记录下来，可以将其与其他实验数据进行比较和分析。
注意事项- 为了获得准确的计数结果，必须在淋巴细胞数量相对较高的情况下进行计数。
如果淋巴细胞数量较少，可以增加计数细胞的数量，如计数200个细胞。
- 制备血样涂片时，应避免过度染色或染色不足。
过度染色会使细胞变得模糊，不易观察；染色不足则会使淋巴细胞不易被区分。
- 由于淋巴细胞的数量在不同的个体和疾病状态下具有较大的变异性，因此应该将淋巴细胞计数结果与正常值或对照组数据进行比较。
- 淋巴细胞计数是一种定性和定量的分析方法，可以为疾病的诊断和治疗提供重要的参考依据。
然而，它并不能完全代替其他血液学和免疫学指标的检测，必须与其他实验方法和临床表现相结合使用。
淋巴细胞的分离方法[整理]
![淋巴细胞的分离方法[整理]](https://img.taocdn.com/s3/m/c6b23f1f773231126edb6f1aff00bed5b9f373c2.png)
1、淋巴细胞的来源：人淋巴细胞的方便来源是外周血分离的原则是收率较高、纯度较好、失活较低。
根据不同试验有相对纯度，无论采用哪种方法，应尽最大可能保持细胞应有活性。
分离的技术可由细胞的物理性状和表面标志设计，根据不同实验目的可采用密度梯度离心法、吸附分离法和其它特殊分离法。
2、密度梯度离心法：外周血各种血细胞的密度不尽相同，利用淋巴细胞分层液（Ficoll）作密度梯度离心，使一定比重的细胞群按相应密度梯度分布，从而将各种血细胞加以分离。
为此利用一种密度介于1.075～1.092之间而近于等渗的溶液（分层液）做密度梯度离心，使一定密度的细胞按相应密度梯度分布，从而将各种血细胞加以分离。
常用的分层液有Ficoll和Percoll两种。
3、实验方法：1.采血，稀释（外周血：稀释液=1：2）2.在离心管中加入Ficoll，沿倾斜的管壁缓缓加入稀释的外周血（Ficoll：稀释血=1：2）3、20℃，1500r/min，离心30min从上一次至下稀释的血浆、血小板PBMCFicoll红细胞、粒细胞4.沿管壁周缘轻轻吸取PBMC层移入另一试管中。
5.加足量稀释液充分洗涤，1800 r/min离心10min ，弃上清。
6.重复洗涤一次，1400r/min离心10min，弃上清。
7.适量的培养基重悬细胞，计数。
分离单个核细胞纯度为95%淋巴细胞约占90%～95%4、淋巴细胞高纯度化(一)红细胞的去除一般采用无菌蒸馏水低渗裂解法或0.83%氯化铵处理法。
(二)血小板的去除将PBMC悬液通过离心洗涤2～3次，常可去除PBMC中绝大部分混杂的血小板。
在某些疾病状态下，若外周血中血小板数量异常增多，可采用胎牛血清(FCS)梯度离心法去除PBMC中混杂的血小板。
（三）单核细胞和粒细胞的去除1．粘附去除法原理：单核细胞和粒细胞在37℃和Ca离子存在条件下能主动粘附在玻璃、塑料、尼龙毛、棉花纤维或葡聚糖凝胶。
采集的非粘附细胞即为淋巴细胞。
人外周血淋巴细胞分离液tbd 步骤
人外周血淋巴细胞分离液tbd 步骤人外周血淋巴细胞（Peripheral Blood Lymphocytes，PBL）是指存在于人体外周血液循环中的一类免疫细胞，具有重要的免疫功能。
为了进一步研究这些细胞的结构和功能，需要将其分离和纯化出来。
TBD法（T-Lymphocyte and B-Lymphocyte Discrimination method）是一种常用的人外周血淋巴细胞分离液的制备方法，本文将详细介绍其步骤。
TBD法的具体步骤如下：1.收集外周血样本：首先，需要通过合适的方法收集新鲜的人外周血样本。
最常用的方法是使用静脉血采集针和试管，并采用适当的抗凝剂，如肝素、EDTA等，以阻止血液凝固。
2.稀释血样：将采集到的外周血样本用适量的PBS（磷酸盐缓冲液）或RPMI 1640（常用的培养基）稀释，在混合均匀后使血液与稀释液的比例约为1:1。
3.密度梯度离心：将稀释后的血样缓慢倒入离心管中，并加入缓冲液最上层和下层，形成密度梯度。
最常用的密度梯度制备方法是将无菌的Ficoll-Hypaque溶液（密度为1.077 g/mL）加入离心管底部。
然后，将离心管安置在离心机中，进行高速离心。
4.洗涤淋巴细胞：经过离心后，管中细胞会在密度梯度上不同的位置形成分层，外周血单核细胞和淋巴细胞富集在上清液中。
使用无菌技术，小心地从上清液中采集单个细胞初浆液（称为淋巴细胞悬液），放入离心管中。
5.离心洗涤：离心洗涤的目的是去除细胞残留的Ficoll-Hypaque和其他有害物质，同时收集干净的淋巴细胞悬液。
将采集到的淋巴细胞悬液加入无菌PBS或RPMI 1640中，混匀后进行低速离心。
将上清液丢弃，保留沉淀。
6.细胞复苏：在离心洗涤过程中，细胞可能会受到机械力的破坏，需要进行适当的细胞复苏。
加入培养基到离心管中，轻轻混匀，使细胞中的膜完全复苏，维持其正常的形态和功能。
7.细胞计数和监测：使用显微镜和倒置显微镜，对分离得到的淋巴细胞进行直接观察和计数。
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淋巴细胞分离与计数
淋巴细胞分离
原理：
外周血各种血细胞的密度不尽相同，利用淋巴细胞分层液（Ficoll）作密度梯度离心，使一定比重的细胞群按相应密度梯度分布，从而将各种血细胞加以分离。
实验材料：
淋巴细胞分离液
肝素
稀释液（生理盐水）
RPMI1640粉末
实验设备：1ml移液器、移液管、 5ml注射器、刻度吸管、EP管、离心机、显微镜
操作流程：
1.在离心管中加入适量淋巴细胞分离液。
2.无菌采集静脉血若干毫升,注入盛有肝素的无菌小瓶中，（每1ml全血加
0.1ml 125-250U/ml肝素溶液),加盖后立即轻轻摇匀,使血液抗凝
3.稀释（外周血：稀释液=1：2 取肝素抗凝血与等量生理盐水充分混
匀）
4.用刻度吸管沿倾斜的管壁，把稀释血缓慢叠加于分层液面上，注意保持清
楚的界面（Ficoll：稀释血=1：2）
5.放入离心机1500r/min 离心20min（注:缓慢加速1-4档个3分钟）
6.用吸管插到云雾层，吸取单个核细胞。
置入另一离心管中，加入5倍以上
体积的稀释液（生理盐水），1500rpm×10分钟离心，洗涤细胞。
7.重复洗涤一次，1500rpm×10分钟离心。
8.末次离心后，弃上清，加入含有10％小牛血清的RPMI1640，重悬细胞
9.计数细胞后再调整细胞置所需浓度.
10.取一滴细胞悬液与一滴0.2％台盼兰染液混合，于血球计数板上，计数四个
大方格内的细胞总数。
单个核细胞浓度(细胞数／1毫升细胞悬液)＝
4个大方格内细胞总数
──────────×10４×2(稀释倍数)
4
11.分离出的淋巴细胞置于培养瓶中二氧化碳培养箱培养。
注意事项:
1.每毫升外周血液大约可获1×106单个核细胞
2.Ficoll应适量，外周血应充分稀释
3.温度直接影响到Ficoll的比重和分离效果
4.在Ficoll上加入稀释外周血时，应缓慢加，以免冲散界面
5.吸取单个核细胞层时，应避免吸出过多的上清液或分层液而导致血小板污
染
淋巴细胞计数：
实验流程：
1.准备计数板：
2.制备细胞悬液：收集细胞，制成单个细胞悬液
3.加样：用吸管轻轻吹打细胞悬液，取少许细胞悬液，在计数板上盖玻片的
一侧加微量细胞悬液，
4.计数：在显微镜下，用10×物镜观察计数板四角大方格中的细胞数
5.计算：将结果代入下式，得出细胞密度
胞数/毫升原
=（4大格细胞数之和/4）×104
注意事项：
1.取样计数前，应充分混匀细胞悬液
2.加样量不要溢出盖玻片，也不要过少或带气泡
3.细胞压中线时，数上不数下，数左不数右
4.本法要求细胞密度不低于104细胞/ml
5.镜下计数时，细胞数过少或过多，说明稀释不当，需重新制备细胞悬液、
计数。