PCR详细
高三生物pcr知识点
高三生物pcr知识点PCR（聚合酶链反应）是一种重要的分子生物学技术，被广泛应用于基因检测、疾病诊断、DNA指纹分析等领域。
高三生物学生需要掌握PCR的相关知识点，下面将详细介绍PCR的原理、步骤和应用。
一、PCR原理PCR是一种体外的DNA复制技术，通过在一定温度条件下，利用酶的催化作用使DNA的复制反应反复进行。
PCR主要包括三个步骤：变性、退火和延伸。
1. 变性PCR反应开始时，将反应体系升温至94-96℃，使DNA双链解链成单链。
这一步骤中，DNA双链断裂，并且其中的氢键被破坏，使得DNA单链解开，形成两个模板链。
2. 退火在变性步骤完成后，将温度降至50-65℃，引入引物（寡核苷酸引物，即引导DNA复制的短链DNA）来与特定DNA序列互补结合。
引物结合于DNA模板的3'端，以提供起始点供DNA合成酶进行反应。
3. 延伸将温度调节至72℃，引入高温下活性较好的DNA合成酶（如Taq聚合酶），使DNA在引物的引导下进行延伸。
在这个步骤中，DNA合成酶从引物的3'端开始向5'端进行合成，合成一个新的DNA链。
通过不断重复这三个步骤，即可获得大量特定DNA片段的复制产物。
二、PCR步骤PCR通常需要以下步骤：1. 反应体系的制备将引物、DNA模板、dNTPs（四个脱氧核苷酸）、聚合酶、缓冲液等混合制备反应体系。
2. 变性升温至94-96℃，使DNA双链解链成单链。
3. 退火降温至50-65℃，引入引物与模板DNA互补结合。
4. 延伸升温至72℃，引入聚合酶使DNA链延伸。
5. 反应周期重复2-4步骤多次，通常需要进行25-35个循环，以获得足够的产物。
6. 终止和保存制备PCR产物后，通常会升温至70-80℃，使聚合酶停止合成反应，并保存PCR产物。
三、PCR应用PCR技术在生物学研究和医学诊断中具有广泛的应用。
1. 基因检测PCR可以被用于检测和分析DNA样本中的特定基因，以了解其表达和突变情况。
PCR技术原理与操作
PCR技术原理与操作PCR（Polymerase Chain Reaction，聚合酶链反应）是一种常用于分子生物学研究和诊断的技术。
它通过扩增目标DNA片段，从而使其在实验室中具有足够的量进行进一步的分析。
以下将详细介绍PCR技术的原理与操作。
1. 变性（Denaturation）：DNA双链被高温（通常为94-98℃）瞬间加热，使其变性成两条单链DNA。
高温能够在较短时间内破坏氢键，使DNA分子完全解旋。
2. 引物结合（Annealing）：实验室中已知序列的两个DNA引物（小片段），分别与目标DNA序列的两侧配对结合。
温度被调至50-65℃，使引物与目标DNA片段发生特异性结合。
引物仅与目标序列互补配对。
3. 延伸（Extension/elongation）：在DNA引物的3'端，即目标DNA片段的其中一侧，加入DNA聚合酶、dNTPs和缓冲液，温度保持在65-75℃。
DNA聚合酶及其他反应物共同使目标DNA片段的核苷酸链延伸。
此步骤通常需要1-2分钟。
这三个步骤一起组成了PCR的一个循环，每个循环会使DNA扩增一倍。
通过让PCR循环重复进行，DNA的数量可以快速倍增。
PCR操作步骤：1.实验室准备：-收集所有PCR所需的试剂：模版DNA、引物、dNTPs、聚合酶、缓冲液等。
-搭建一套无菌的实验室工作环境。
-定量测量所有试剂，确保使用正确的质量。
2.PCR反应混合物的制备：-准备PCR反应的混合物：一个典型的PCR反应液包含模版DNA、引物、dNTPs、聚合酶、缓冲液和水。
确保混合物中每种试剂的浓度符合反应所需。
-所有混合物都应在无菌条件下操作，以防止外部DNA污染。
3.PCR反应条件设置：-设置PCR反应条件，包括变性、引物结合和延伸的温度和时间。
这些条件应根据目标DNA片段的特性来确定。
-通常，PCR反应以94-98℃开始进行变性，然后降低温度以便引物结合，最后使温度上升以使延伸发生。
pcr四个步骤
pcr四个步骤PCR（聚合酶链反应）是一种常用的生物分子扩增技术，被广泛应用于基因组学、医学诊断、犯罪调查等领域。
PCR通常包括四个关键步骤：变性、退火、延伸和终止。
下面将详细介绍PCR的四个步骤及其在实验中的应用。
第一步：变性（Denaturation）变性是PCR的第一步，其目的是将DNA双链解开，得到两条单链DNA。
这一步通常在94-98℃的高温条件下进行，高温能够破坏DNA 的氢键，使DNA解开。
变性步骤在PCR中非常重要，因为它为后续步骤提供了单链DNA 模板。
在变性后，每个DNA模板都可以与引物（引导DNA扩增的短DNA片段）结合形成PCR产物。
第二步：退火（Annealing）退火是PCR的第二个步骤，其目的是使引物与DNA模板序列特异性结合。
在退火步骤中，温度降至50-65℃左右，使引物与DNA模板的互补碱基序列相互结合。
引物是为了扩增目标DNA序列而设计的短DNA片段，通常包含20-30个碱基。
引物的互补碱基序列与目标DNA序列的两个末端相对应，使引物能够与目标DNA序列的两个末端结合。
第三步：延伸（Extension）延伸是PCR的第三个步骤，其目的是通过DNA聚合酶酶活性，在引物的引导下合成新的DNA链。
在延伸步骤中，温度通常在65-75℃之间，取决于所使用的DNA聚合酶。
DNA聚合酶是一种酶，能够识别引物与DNA模板结合的区域，并在该区域上合成新的DNA链。
延伸步骤会在每个引物结合的DNA模板区域合成新的DNA链，形成两个新的DNA双链。
第四步：终止（Termination）终止是PCR的最后一个步骤，其目的是阻止DNA链的继续合成。
在终止步骤中，温度通常在72℃左右，这是DNA聚合酶的最佳工作温度。
终止步骤中使用的方法是在PCR反应体系中加入一种特殊的终止试剂，该试剂能够在DNA合成链上添加一个无法与其他核苷酸连接的特殊核苷酸。
这样，当DNA链合成到终止试剂所添加的核苷酸时，DNA聚合酶无法进一步合成，从而终止了DNA的扩增。
pcr实验原理
pcr实验原理PCR实验原理PCR（聚合酶链式反应）是一种在体外扩增DNA的技术，它可以在短时间内从微量的DNA样本中产生大量的DNA复制物。
PCR技术已经广泛应用于基因工程、医学诊断、法医学和生物学等领域。
本文将从以下几个方面详细介绍PCR实验的原理。
1. PCR反应体系PCR反应体系主要由模板DNA、引物、聚合酶、缓冲液和dNTPs等组成。
其中模板DNA是需要扩增的目标序列，引物是用来定位目标序列起始点和终止点的短链寡核苷酸，聚合酶是催化DNA合成的酶类，缓冲液提供了适宜pH值和离子强度来维持聚合酶活性，dNTPs是四种脱氧核苷三磷酸。
2. PCR扩增过程PCR扩增过程分为三个步骤：变性、退火和延伸。
（1）变性：将双链DNA加热至95℃左右使其解旋成两条单链模板。
（2）退火：降温至引物与模板相互结合的最佳温度，引物与模板的互补碱基序列结合形成双链DNA。
（3）延伸：在聚合酶的催化下，dNTPs与单链模板互补配对形成新的DNA链，引物向外延伸，产生两条新的单链DNA。
这个过程会不断重复，每次扩增会产生一倍的DNA片段。
3. PCR反应条件PCR反应条件包括温度、时间和反应体系组分浓度等因素。
其中最关键的是温度控制。
变性阶段需要高温95℃左右；退火阶段需要适当降温至引物与模板互补碱基序列结合的最佳温度；延伸阶段需要适宜的延伸时间和温度。
同时，反应体系组分浓度也需要控制在一定范围内。
4. PCR扩增产物PCR扩增产物是目标序列在PCR反应中被扩增出来的DNA片段。
其大小由引物长度和目标序列长度决定。
PCR扩增产物可以通过琼脂糖凝胶电泳等方法进行检测，并可用于后续实验。
5. PCR技术优点PCR技术具有快速、灵敏、特异性强、扩增量大等优点，可以从微量的DNA样本中扩增出足够多的DNA，可用于检测罕见基因突变和病原体等。
此外，PCR技术还可以进行定量PCR、实时PCR和逆转录PCR等不同类型的实验。
总结PCR技术是一种重要的分子生物学技术，其原理简单易懂，应用广泛。
pcr技术的原理和步骤
PCR技术的原理和步骤一、引言PCR（聚合酶链式反应）是一种重要的分子生物学技术，它在许多领域中具有广泛的应用。
PCR技术的核心原理是通过体外复制DNA，使得我们能够从微量DNA样本中扩增出足够的DNA量进行后续分析。
本文将详细介绍PCR技术的原理和步骤。
二、PCR技术的原理PCR技术的原理主要基于DNA的复制与扩增过程，它包含以下三个重要步骤：变性、退火和延伸。
1. 变性PCR反应开始时，DNA模板被加热到95°C，使其两个DNA链分离。
这一步骤被称为变性，它破坏了氢键，使DNA双链变为单链。
变性是PCR技术的起始步骤，确保反应中的DNA单链能够被其他反应物所利用。
2. 退火在变性之后，温度降至50-60°C，引物加入PCR反应体系中与单链DNA互补配对。
引物是短的寡聚核苷酸序列，其中一个与DNA模板的一个单链区段互补，另一个与DNA模板的相对应的区段互补。
引物在退火温度下与DNA单链形成氢键，稳定地结合在DNA模板上。
3. 延伸在退火的温度下，酶聚合酶（Taq polymerase）被加入反应中，它能以引物为起始点，在DNA模板上合成互补链。
Taq polymerase是从一种热水生产的细菌中分离得到的，它能耐受高温，因此可以在PCR反应过程中保持活性。
Taq polymerase能够扩增DNA，其DNA合成速度约为每分钟1000个核苷酸。
PCR技术涉及多个步骤，包括DNA提取、反应体系的准备、PCR反应的设置和PCR产物的分析。
1. DNA提取PCR反应需要DNA作为模板。
DNA可以从多种样本中提取，如血液、组织、细胞培养物等。
DNA提取的方法有多种，包括使用商业DNA提取试剂盒或自行制备DNA提取试剂。
2. 反应体系的准备PCR反应体系通常包括DNA模板、引物、聚合酶、缓冲液和二硫苏糖醇（DMSO）等。
引物的浓度通常为0.2-0.5 μM，聚合酶的浓度为1-2.5 U/μL。
PCR操作步骤及结果
PCR操作步骤及结果PCR（聚合酶链反应，Polymerase Chain Reaction）是一种体外放大特定DNA片段的技术，具有高效、快速和特异性的特点。
下面将详细介绍PCR的操作步骤及其结果。
一、PCR的操作步骤：1.模板DNA制备：-从样品中提取DNA，常见的提取方法包括CTAB法、盐溶法和商用DNA提取试剂盒等。
-根据实验需求，选择合适的DNA浓度作为PCR的模板。
2.PCR反应体系的配制：PCR反应体系由模板DNA、引物、dNTPs（四个单核苷酸）、缓冲液和聚合酶等组成。
-引物：引物是PCR反应中的两个短链DNA分子，分别与待扩增的目标DNA的两个互补区域序列相配对。
-dNTPs：dNTPs是脱氧核苷酸，包括A、T、C和G四种，供给聚合酶合成新DNA链使用。
-缓冲液：缓冲液用于提供合适的pH值和离子环境，维持PCR反应的正常进行。
-聚合酶：聚合酶是PCR反应的酶，能够识别引物，并在引物上逐个添加dNTPs，合成新的DNA链。
3.PCR循环反应：PCR反应主要包括三个步骤：变性、引物结合和延伸。
-变性：将PCR反应混合液加热至95°C，使模板DNA的双链解开，得到两条单链DNA。
-引物结合：将PCR反应体系降温至合适的温度（通常为45-65°C），使引物与单链DNA的互补区域结合。
-延伸：将PCR反应体系升温至聚合酶的最适温度（通常为65-75°C），聚合酶在引物的基础上合成新的DNA链，延伸特定的目标序列。
4.PCR循环程序：PCR的循环程序通常分为三个阶段：变性、引物结合和延伸。
-变性：95°C，持续时间为30秒至2分钟。
用于使DNA变性，并解开双链。
-引物结合：温度通常为45-65°C，持续时间为20秒至1分钟。
用于引物与模板DNA的互补区域结合。
-延伸：温度通常为65-75°C，持续时间为0.5-2分钟。
用于聚合酶在引物的基础上合成新的DNA链。
PCR使用说明范文
PCR使用说明范文PCR（聚合酶链反应，Polymerase Chain Reaction）是一种体外复制DNA的技术，通过PCR可以扩增目标DNA片段，从而大量生产足够的DNA 用于分析和研究。
PCR技术的应用广泛，包括基因突变检测、基因表达分析、遗传病诊断、DNA指纹鉴定等。
本文将详细说明PCR的原理、步骤和注意事项。
1.PCR的原理：PCR技术是通过不断重复三个步骤：变性、退火和延伸，来扩增DNA 样本中的特定片段。
具体原理如下：(1)变性：将DNA样本加热到高温（通常为94-98摄氏度），使DNA 双链解开成两条单链。
这一步骤使得DNA的碱基对断裂。
(2)退火：将温度降低至50-65摄氏度，加入一对引物（引物是用于扩增目标序列的短DNA片段），引物与目标DNA序列互补结合，作为扩增的起始点。
(3)延伸：将温度升高到72摄氏度，加入DNA聚合酶，它通过引物在DNA模板上进行延伸合成新的DNA链。
此步骤是PCR的最后一步，产生双链DNA。
PCR通过循环重复以上三步骤来扩增DNA。
每个PCR循环都会使DNA 的数量增加一倍，反复数次即可扩增目标DNA到足够多的数量。
2.PCR的步骤：(1)样本制备：将待测DNA从细胞或组织中提取出来，去除杂质，并用缓冲液将其稀释。
(2)反应混合液的制备：将模板DNA和引物，以及PCR反应液的其他成分（如引物浓度，聚合酶等）混合至PCR反应管中。
(3)PCR的循环：将反应管放入PCR仪中，依次进行变性、退火和延伸的循环，循环的次数根据待扩增DNA的数量进行调整。
(4)结果分析：通过凝胶电泳或实时荧光PCR等方法，对PCR反应结果进行分析和检测。
3.PCR的注意事项：(1)实验操作层级：为了避免PCR反应的污染，应分配操作区域，将样本制备区与PCR循环区分开，使用专门用品和设备。
(2)对于反应混合液的制备，应避免引物和循环酶的污染，严格按照实验方案中的要求制备，并进行质量控制。
pcr实验知识点总结
PCR实验的深度解析引言聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，简称PCR）是一种在分子生物学中广泛使用的体外核酸扩增技术。
自1983年由Kary Mullis首次提出以来，PCR技术已经在生物医学研究、临床诊断和法医鉴定等领域发挥了重要作用。
本文将详细阐述PCR实验的相关知识点，以期帮助读者深入理解并掌握这一关键技术。
一、PCR的基本原理PCR过程主要包括三个步骤：变性、退火和延伸。
在变性阶段，双链DNA被加热至90-95℃，使两条互补链分开；在退火阶段，温度降低至40-60℃，引物与模板DNA通过碱基配对结合；在延伸阶段，DNA聚合酶在适宜的温度下催化dNTPs加入到引物3'端，形成新的DNA链。
这三个步骤循环进行，使得目的基因得以指数级扩增。
二、PCR实验的主要步骤1. 设计引物：根据需要扩增的目标区域设计一对正反向引物，引物长度通常为18-25个核苷酸，Tm值一般在55-65℃之间。
2. 制备反应体系：包括模板DNA、引物、dNTPs、缓冲液和热稳定DNA聚合酶等成分。
3. PCR程序设置：设定各步的温度和时间，如变性95℃ 30s，退火55℃30s，延伸72℃ 1min，循环30-35次。
4. PCR产物检测：常用的方法有琼脂糖凝胶电泳和实时荧光定量PCR等。
三、影响PCR的因素1. 引物的设计：引物的特异性和亲和力直接影响PCR的效率和准确性。
2. 反应条件：包括Mg2+浓度、dNTPs浓度、引物浓度、模板浓度和循环次数等因素，需根据实际情况进行优化。
3. 污染控制：PCR实验对污染极为敏感，操作过程中应严格遵守无菌操作规程。
四、PCR的应用1. 基因克隆：通过PCR扩增特定基因片段，用于后续的基因克隆和表达。
2. 基因测序：通过PCR扩增目标基因，进行序列分析。
3. 病原体检测：利用PCR技术检测病毒、细菌等病原体。
4. 法医鉴定：利用STR分型技术进行个体识别。
pcr操作流程和步骤
pcr操作流程和步骤PCR（聚合酶链式反应）是一种用于复制DNA片段的技术，它在分子生物学和遗传学研究中被广泛应用。
PCR操作流程包括DNA模板的变性、引物的结合、DNA合成和扩增等步骤。
下面将详细介绍PCR的操作流程和步骤。
首先，准备PCR反应体系。
PCR反应体系包括DNA模板、引物、dNTPs（四种脱氧核苷酸）、聚合酶、缓冲液和水。
将这些试剂按照一定比例混合在一起，制备PCR反应混合液。
第二步是变性。
将PCR反应混合液加热至94-98摄氏度，使DNA双链解旋成两条单链。
这一步称为变性，它使DNA变性，使得引物可以结合到DNA模板上。
第三步是引物的结合。
将PCR反应混合液冷却至50-65摄氏度，使引物与DNA模板结合。
引物是一种短的DNA片段，它可以识别并结合到DNA模板的特定区域。
第四步是DNA合成和扩增。
将PCR反应混合液加热至72摄氏度，使聚合酶开始合成新的DNA链。
聚合酶是一种酶，它能够在引物的引导下合成新的DNA链。
通过多轮循环，可以扩增目标DNA片段。
最后，进行PCR产物的分析。
将PCR反应产物进行电泳分析，可以检测扩增的DNA片段是否符合预期。
通过PCR反应，可以快速、高效地复制目标DNA片段，为分子生物学和遗传学研究提供了重要的工具。
总的来说，PCR操作流程包括准备PCR反应体系、变性、引物结合、DNA合成和扩增等步骤。
掌握PCR技术可以帮助科研人员在实验室中快速、准确地复制DNA片段，为科学研究提供了重要的支持。
PCR技术的发展不仅在基础研究中发挥着重要作用，还在医学诊断、法医学和生物工程等领域有着广泛的应用前景。
PCR技术的不断完善和发展将进一步推动生命科学领域的发展。
PCR技术详细步骤6页
PCR技术详细步骤6页实验步骤：一、样品RNA的抽提1.取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。
2.两相分离每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。
手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。
4℃下12000rpm 离心15分钟。
离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。
RNA全部被分配于水相中。
水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。
3.RNA沉淀将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。
加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12000rpm离心10分钟。
此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。
4.RNA清洗移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA沉淀。
混匀后，4℃下7000rpm 离心5分钟。
5.RNA干燥小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。
6.溶解RNA沉淀溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。
二、RNA质量检测1.紫外吸收法测定先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。
然后取少量RNA溶液用TE稀释（1:100）后，读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，测定RNA溶液浓度和纯度。
（1）浓度测定A260下读值为1表示40μgRNA/ml。
样品RNA浓度(μg/ml)计算公式为：A260×稀释倍数×40μg/ml。
具体计算如下：RNA溶于40μlDEPC水中，取5μl，1:100稀释至495μl的TE中，测得A260=0.21RNA浓度=0.21×100×40μg/ml=840μg/ml或0.84μg/μl取5ul用来测量以后，剩余样品RNA为35μl，剩余RNA总量为：35μl×0.84μg/μl=29.4μg（2）纯度检测RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度，比值范围1.8到2.1。
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30 s
30 s 1 kb/min 5 min 25-35个循环
备注：* 比两条引物的Tm值低5~10℃。
PCR产物电泳鉴定
凝胶准备 ① 称1g琼脂糖置三角瓶中，加100ml 1×TAE；
② 微波炉加热大约2分钟，熔化琼脂糖；
③ 熔化的琼脂糖自然冷却到60～70℃时，加入EB 5μl，并轻轻混匀。 胶床准备
dNTP（dATP,dTTP,dCTP,dGTP） 在PCR反体系中dNTP终浓度高于50mM会抑 制Taq酶的活性，使用低浓度dNTP可以减 少在非靶位臵启动和延伸时核苷酸错误掺 入，高浓度dNTPs易产生错误掺入，而浓 度太低，势必降低反应物的产量。PCR常 用的浓度为50～200μM，不能低于10～ 15μM。四种dNTP的浓度应相同，其中任 何一种浓度偏高或偏低，都会诱导聚合酶 的错误掺入，降低合成速度，过早终止反 应。
PCR缓冲液: 用于PCR的标准缓冲液为10～50mM的Tris – HCl缓冲液（pH8.3）和1.5mM MgCl2。在 72℃时，反应体系的pH值将下降1个单位， 接近于7.2。二价阳离子的存在至关重要， 影响PCR的特异性和产量。实验表明，Mg2+ 优于Mn2+，而Ca2+无任何作用。Mg2+过量易 生成非特异性扩增产物，Mg2+不足易使产量 降低。首次使用靶序列和引物结合时，都 要把Mg2+浓度调到最佳，其浓度变化范围为 1～10mmol/L。
修复机制，所以，在PCR产物扩增以后，仍要分析其与模板DNA的是否完全一致。
最好的方法是将PCR产物测序，将测序结果与数据库作序列比对分析。
/Blast.cgi
核酸序列比对
BLAST分析界面
输入测序结果
结果界面之一
结果界面之二
Taq DNA聚合酶: Taq DNA聚合酶最早是从嗜热水生菌中提 纯出来的。典型PCR反应混合物中，常用 范围为1～4U/100μl。由于DNA模板的不 同和引物不同，以及其它条件的差异， Taq DNA聚合酶的用量亦有差异，酶量过多 会导致非特异产物的增加。
模板
模板的种类：单、双链DNA或RNA都可以作为PCR 的样品。若起始材料是RNA，须先通过逆转录得 到第一条cDNA 对于模板的用量: 基因组DNA：50-100 ng 质粒DNA: 5-10 ng
PCR反应系统的组成
PCR反应系统的组成主要包括：
模板DNA、引物、dNTP、Taq DNA聚 合酶、缓冲液。
引物：
要扩增模板DNA，首先要设计两条引物,实 际上就是两段与待扩增靶DNA序列互补的 寡核苷酸片段，两引物间距离决定扩增片 段的长度，两引物的5’端决定扩增产物的 两个5’末端位臵。由于引物是决定PCR扩 增片段长度、位臵和结果的关键， 因此， 引物设计也就更为重要。
引物设计软件primer premier 5.0的使用
可通过两个方法将序列输入软件中
打开原有的序列文件
在表中粘贴序列
选择序列文 件所在位置
在对话框中输入待扩增序列 点击左上角的“Primer”按钮
引物设计界面
对正向和反向引物进行编辑
正向和 反向引 物的互 换 正向和反向 引物的信息 正向和反向 引物的评价
实验操作
2×Taq PCR MasterMix 10 µ l P1 (10 µM ) 1 µl P2 (10 µM) 1 µl 无菌水 7µ l pPIC9-NGAL 1µ l 反应体系：20 µl 混匀，稍加离心并标记。
下面为一个典型的PCR循环参数设置：
94℃ 5 min
Hale Waihona Puke 94℃X ℃* 72℃ 72℃
观看测序结果的软件Chromas
软件运行界面
打开一个测序结 果
峰型排列良好，无高大杂峰，说明测序结果可靠
将测序结果输出为文本文件
目的基因序列分析
虽然现在的PCR技术使PCR扩增有很高的真实性，即PCR产物与模板DNA的一致性
很高，但由于PCR扩增毕竟是在试管内进行的DNA复制，没有类似细胞内DNA错配
增加的酶切位点序列和其他序列。引物长度以18～24 bp为佳。
（3）引物3’末端的碱基。引物3’末端是延伸的始端，碱基错配会影响延伸效率。当最后一个 碱基是A时，容易发生错配，所以引物3’末端最好不要为A； （4）引物的G+C含量一般为40％～60％，过高或过低都不利于引发反应；
（5）两条引物不能形成稳定的二聚体，或引物自身不能形成稳定的二级发夹结构，这些都
目的基因的PCR扩增 及其扩增产物的鉴定分析
实验原理
PCR用于扩增位于两段已知序列之间的DNA区段。每 个循环包个三个步骤，即，首先加热到94 -95℃使模板 DNA变性,接着将反应液冷却到某一温度,使引物与它的靶 序列发生退火,此后,退火引物在DNA聚合酶作用下得以延 伸。如此反复进行变性、退火和延伸这一循环。由于一轮 扩增产物又充当下一轮扩增的模板，所以每完成一个循环 ，就使目的DNA产物增加一倍。
(1) 变性阶段 加热使模板 DNA 在高温下 （90℃-95）变性，双链解链； (2)退火阶段 降低溶液温度，使合成引 物在低温（35－70℃,一般低于模板Tm 值的 5℃左右），与模板 DNA 互补退火 形成部分双链； (3) 延伸阶段 溶液反应温度升至中温 (72℃) ，在 Taq 酶作用下，以 dNTP 为 原料，引物为复制起点，模板DNA的一 条双链在解链和退火之后延伸为两条 双链。
① 将梳子垂直插入到胶床的小凹槽内，梳齿底端和床面有1mm的间隙；
② 将胶床放在调整好的水平台上； 铺胶：将冷却致60℃的凝胶倒入准备好的胶床内，凝胶厚度约5 mm；
室温下静置30分钟左右，凝胶固化。将带凝胶 的胶床置于电泳槽中，并使样品
孔位于电场负极；
向电泳槽中加入1×TAE电泳缓冲液，越过凝胶表面即可；
PCR循环次数 常规PCR循环次数一般为25～40个周期。一 般是循环次数过多，非特异性背景严重， 复杂度增加。当然循环反应的次数太少， 则产率偏低。所以，在保证产物得率前提 下，应尽量减少循环次数。
PCR扩增过程
在微量离心管中加入适量缓冲液、微量 模板 DNA 、四种脱氧单核苷酸（ dNTP ） 和耐热 Taq 聚合酶及两个合成 DNA引物， 并有 Mg2+ 存在。其循环的温度取决于引 物的 Tm值、模板的种类以及聚合酶的耐 热性。
模板变性温度是决定PCR反应中双链DNA解链 的温度，达不到变性温度就不会产生单链 DNA模板，PCR也就不会启动。变性温度低则 变性不完全，DNA双链会很快复性，因而减 少产量。一般取90～95℃。样品一旦到达此 温度宜迅速冷却到退火温度。DNA变性只需 要几秒种，不需要时间过久；反之，在高温 时间应尽量缩短，以保持DNA聚合酶的活力， 加入Taq DNA聚合酶后最高变性温度不宜超 过95℃。
琼脂糖凝胶电泳预期结果：
560 bp
500 bp
PCR产物测序鉴定
PCR产物的直接测序：从琼脂糖凝胶中回收PCR产物后测序。 PCR产物连接到载体后测序：从琼脂糖凝胶中回收PCR产物，利用连接酶将PCR 产物连接到载体如pGEM-T后，转化大肠杆菌提取质粒后测序。
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会影响引物与模板的结合。 （6）两条引物的融解温度Tm值尽量不要相差太大，引物的Tm值粗略计算公式为Tm = 4 （G+C）+2（A+T）； （7）引物的5'端对扩增特异性没有影响，因此可以被修饰而不影响扩增的特异性，引物5′端 修饰包括加酶切位点、标记生物素和荧光等，引物3'端是延伸的开始，不能进行任何修 饰。
用键盘输入了5个碱基
改动后引物的信息
引物的信息
引物在PCR反应中的浓度一般在0.1～ 1μM之间。浓度过高易形成引物二聚体 且产生非特异性产物。一般来说用低浓 度引物经济、特异，但浓度过低，不足 以完成30个循环的扩增反应，则会降低 PCR的产率。
引物退火温度决定PCR特异性与产量；温度高特 异性强，但过高则引物不能与模板牢固结合， DNA扩增效率下降；温度低产量高，但过低可造 成引物与模板错配，非特异性产物增加。一般 可根据引物的（G+C）%含量进行推测，一般试 验中退火温度Ta(annealing temperature) 比扩 增引物的融解温度Tm(melting temperature)低 5℃，可按公式进行计算： Ta = Tm - 5℃= 4(G+C) + 2(A+T) -5℃ 其中A，T，G，C分别表示相应碱基的个数。
PCR引物设计
引物决定了PCR产物的长度和特异性。目前有多种引物设计软件，如primer premier5、
Internet免费引物设计网站有primer 3，Primerfinder等。
引物设计有以下几个原则：
（1）引物的特异性。引物应根据目的序列进行设计，引物与非靶序列之间不要超过
70％的同源性或连续8个的碱基互补，减少非特异产物； （2）引物的长度。一般指引物中能与模板序列互补结合的部分，不包括在5’端额外
轻轻拔出固定在凝胶中的梳子； 样品准备：向核酸样品中加入约为样品体积1/6的上样缓冲液，用加样器轻轻混匀 上样：用加样器吸取样品，轻轻的加入到凝胶的样品孔中，加样量为10μl 盖上电泳槽，接通电源，开始电泳； 电泳条件：电压80v；时间20～25分钟； 电泳结束后，切断电源，取出凝胶； 电泳结果分析： ① 紫外检测仪直接观察电泳条带 ② 摄影记录
Hairpin: 引物自身是否会形成发夹结构 Dimer: 同一种引物是否会形成二聚体 False primiring: 引物在待扩增序列中其他位置是否有配对