PCR 测量指南
PCR实验技术指南
PCR实验技术指南PCR（聚合酶链反应）是分子生物学中常用的一种技术，它能够迅速增加目标DNA序列的数量，以便进行后续的分析和研究。
下面是PCR实验技术的一些指南和注意事项。
1.质量控制-使用高质量的试剂和辅助材料，如酶、引物等。
-确保试剂的保存条件符合要求，如远离光照、避免冻结等。
-对实验所需的各种试剂和辅助材料进行验收，并记录相关信息。
-定期检查仪器设备的运行状况，例如温控台和热循环仪等。
2.引物设计-引物应与目标DNA序列的两个端点具有互补性。
-引物的长度通常在18-24个碱基对之间。
-避免引物之间出现互补性，以及引物与自身的互补性。
-引物的GC含量应在40-60%之间。
3.PCR反应体系PCR反应体系应包含以下组分：-模板DNA：可以是基因组DNA、cDNA或其他DNA片段。
-引物：两个引物，一个用于扩增目标DNA的正向引物，一个用于逆向引物。
- 酶：通常使用Taq聚合酶或其他热稳定的DNA聚合酶。
-缓冲液：包含适当的离子浓度和pH值。
-dNTPs：四种脱氧核苷酸三磷酸盐，即dATP、dCTP、dGTP和dTTP。
-辅助材料：如BSA、MgCl2等，可以增加PCR反应的特异性和效率。
4.温度循环程序PCR的温度循环程序通常包含三个步骤：变性、退火和延伸。
具体的温度和时间可以根据引物的Tm值和目标DNA片段的长度进行优化。
以下是一个常用的温度循环程序：-变性：95℃，3-5分钟，将DNA变性为单链。
-退火：通常在55-65℃之间，时间根据引物的Tm值和目标PCR产物的长度进行优化。
- 延伸：72℃，根据PCR产物的长度和缺失/插入突变的可能性进行优化，通常设置为1分钟/1000bp。
5.试验记录和数据分析-记录PCR反应体系中每个组分的浓度和体积。
-记录PCR反应的温度循环程序以及每个步骤的时间。
-每次实验前后对仪器进行标定和校准，以确保数据的准确性。
-分析PCR反应产物的电泳图，确认目标PCR产物的存在与否。
pcr检测 流程
pcr检测流程PCR（聚合酶链反应）是一种常用的遗传物质检测方法，可以快速、准确地检测出目标物质的存在与否。
下面将详细介绍PCR检测的流程。
一、实验准备在进行PCR检测之前，需要准备相应的实验试剂和设备。
实验试剂包括模板DNA、引物、聚合酶、缓冲液等。
设备包括PCR仪、离心机、电泳仪等。
确保实验室环境干净整洁，仪器设备无故障。
二、PCR反应体系的配制根据实验需求，按照一定的比例将所需试剂加入PCR反应管中。
通常，反应体系包括模板DNA、引物、聚合酶、缓冲液和去离子水。
确保各种试剂按照正确的比例加入，避免出现浓度偏差。
三、PCR反应的程序设置根据实验需求和所使用的PCR仪型号，设置PCR反应的程序。
程序设置包括温度和时间的设定。
一般情况下，PCR反应包括三个步骤：变性、退火和延伸。
变性温度通常在94-98℃之间，退火温度根据引物的Tm值确定，延伸温度通常在72℃左右。
四、PCR反应的进行将配制好的PCR反应体系放入PCR仪中进行反应。
反应过程中，PCR仪会按照预设的程序进行温度的升降，从而使DNA的变性、退火和延伸反应发生。
反应时间一般为数十分钟到数小时不等，具体根据实验需求而定。
五、PCR产物的分析PCR反应结束后，可以通过多种方法对PCR产物进行分析。
常用的方法包括琼脂糖凝胶电泳、荧光定量PCR、实时定量PCR等。
这些方法可以直观地观察PCR产物的大小、数量和纯度，从而判断PCR 反应的结果是否符合预期。
六、PCR结果的解读根据PCR产物的分析结果，可以对目标物质的存在与否进行判断。
如果PCR产物在琼脂糖凝胶电泳中出现了预期大小的条带，说明目标物质存在；如果没有出现预期大小的条带，说明目标物质不存在。
荧光定量PCR和实时定量PCR可以更精确地测量PCR产物的数量，从而判断目标物质的含量。
七、PCR结果的验证为了确保PCR结果的准确性和可靠性，通常需要进行结果的验证。
验证的方法包括重复实验、平行实验和阳性对照实验等。
荧光定量PCR实验指南
荧光定量PCR实验指南荧光定量PCR（qPCR）是一种能够对DNA或RNA的特定序列进行定量分析的技术。
它结合了PCR技术和荧光检测技术，能够检测出非常低浓度的靶分子。
本文将为您提供一份荧光定量PCR实验的指南，以帮助您完成这一实验。
实验前的准备工作：1.设计引物和探针：引物和探针是荧光定量PCR实验的核心组成部分，因此需要确保它们与目标序列特异性结合。
同时，还需选择合适的荧光染料和探针的浓度。
2.准备实验材料：包括引物、探针、荧光染料、模板DNA或RNA、逆转录酶酶、dNTP、聚合酶、缓冲液、MgCl2等。
3.准备质量控制样品：根据需要制备相应的阳性对照样品，并准备阴性对照样品。
实验步骤：1.反应体系的准备：根据PCR试剂盒使用说明或自行优化，将引物、探针、荧光染料、逆转录酶酶、dNTP、聚合酶、缓冲液、MgCl2等加入PCR管（注意按顺序添加，避免污染）。
2.加入模板：将模板DNA或RNA加入PCR管中，注意保持反应体系的稳定。
3.PCR条件设定：根据目标序列的特性和PCR试剂盒的要求设定PCR反应的温度、时间和周期数。
4.PCR反应：将PCR管密封，然后置于热循环仪中进行PCR反应。
5.数据分析：使用荧光定量PCR软件分析PCR反应产生的荧光信号，得到目标序列的定量结果。
注意事项：1.严格控制实验室的污染，使用无核酸污染的试剂和器材，避免引物和探针的降解。
2.对于荧光定量PCR的标准曲线方法，可以使用标准品系列的不同浓度来制作标准曲线，并根据荧光信号的强度进行定量。
3.在实验过程中，建议进行阳性和阴性对照样品的实验，以确保实验结果的准确性。
4.合理选择PCR管的容量，适量调整反应体系的配比，以保证实验的稳定性和可重复性。
总结：荧光定量PCR是一种非常强大的技术，能够在基因表达调控、感染病原体检测、突变检测等多个领域发挥重要作用。
在进行荧光定量PCR实验时，我们需要设计特异性的引物和探针，并合理选择荧光染料和探针的浓度。
荧光定量PCR实验指南
荧光定量PCR实验指南〔一〕一、根本步骤：1、目的基因〔DNA和mRNA〕的查找和比对；2、引物、探针的设计；3、引物探针的合成；4、反响体系的配制；5、反响条件的设定；6、反响体系和条件的优化；7、荧光曲线和数据分析；8、标准品的制备；二、技术关键：1、目的基因〔DNA和mRNA〕的查找和比对；从网点的genbank中下载所需要的序列。
下载的方式有两种：一为翻开*个序列后，直接点击"save〞，保存格式为".t*t〞文件。
保存的名称中要包括序列的物种、序列的亚型、序列的注册号。
然后，再翻开DNAstar软件中的Editseq软件，点击"file〞菜单中的"import〞，翻开后点击"save〞，保存为".seq〞文件。
另一种直接用DNAstar软件中的Editseq软件，点击"file〞菜单中的"open entrez sequence〞，导入后保存为".seq〞文件，保存的名称中要包括序列的物种、序列的亚型、序列的注册号。
然后要对所有的序列进展排序。
用DNAstar软件中的Seqman软件，点击"sequence〞菜单中的"add〞，选择要比拟的".seq〞的所有文件，点击"add〞或"add all〞，然后点击"Done〞导入要比拟的序列，再点击"assemble〞进展比拟。
横线的上列为一致性序列，所有红色的碱基是不同的序列，一致的序列用黑色碱基表示。
有时要设定比拟序列的开场与结尾。
有时因为参数设置的原因，可能分为几组(contig)，假设想全部放在一组中进展比拟，就调整"project〞菜单下的"parameter〞，在"assembling〞内的"minimum math percentage〞默认设置为80，可调低即可。
聚合酶链反应(pcr)检验实验室检查要点指南
聚合酶链反应(pcr)检验实验室检查要点指南
聚合酶链反应（PCR）是一种广泛应用的技术，用于检测和鉴定特定基因，排查遗传病和可疑病例等。
在实验室检查过程中，实验人员应当根据以下指导原则对PCR检测实验进行管理：
一、正确鉴别样本。
样本应在接收后立即登记，鉴别样本类型，判断检测是否可行。
二、合理使用试剂。
PCR实验所使用的试剂应有充足的用量，且试剂质量满足需求。
三、时间安排合理。
实验进行中应确保操作步骤有条不紊进行，同时对结果也进行及时解读及记录。
四、保持技术质量。
检测过程中应当控制室温及湿度，确保正确的实验条件；使用全自动PCR仪器及品质优良的融合蛋白。
五、定期复查及维护仪器。
在使用PCR仪器时，应定期复查及维护仪器，以防止设备出现故障，并确保结果准确。
六、记录实验数据。
检测结果应及时记录在实验记录本中，以便进行复查。
七、环境保护。
在实验过程中应尽量减少致病菌的接触，通过保护技术和安全技术保护实验室环境，确保检测结果准确可靠。
此外，针对PCR衍生基因疾病的检测，还可以在实验室进行其他实验方法的检测，以确保检测数据的准确真实，把控制系统可能承受的风险。
完成上述指导方针后，实验室应定期组织专业人员来检查实验技术质量，维护实验室状态，以确保实验数据的准确可靠性。
PCR实验检测标准操作规范
PCR检测实验室操作规范一、PCR实验室的设置及管理i•目的：建立实验室的合理设置和科学管理，防止实验污染，保证检测结果的可靠性。
2•适用范围：本程序适用于分子诊断室的设置、工作流程和日常管理等。
3•负责人：4.细则：4. 1流感实验室为急传所的专业实验室，从事临床标本的基因扩增检测及相关科研工作等。
4. 2本实验室采用实时荧光定量（定性）PCR技术作为病毒基因诊断的主要手段，实验室分为三个区：试剂准备区（第一区）、标本处理区（第二区）、扩增分析区（第三区）。
每一工作区配备专用的设备、仪器、辅助设施、耗材、清洁用品、办公用品、专用工作服，并有明显的区分标识。
标本的接收则在检验科标本接收处进行。
4. 3各工作区专用的仪器设备、办公用品、工作服、实验耗材和清洁用具等，不可混用。
4. 4各工作区配置、功能和内务管理见各相关SOP文件。
4. 5严格遵守从“试剂准备区T标本处理区T扩增分析区”的单一流向制度，不得逆向进入前一工作区。
4. 6非本实验室工作人员，未经许可不得入内；进修、实习或其他科室人员因科研活动需要，进入实验区域（试剂准备区、标本处理区、扩增分析区）需首先熟悉本程序的各项规定并严格遵守执行，在本实验室人员监督指导下进行。
4. 7实验完毕后做好清洁消毒工作。
1、PCR实验室工作制度1.目的：保持良好的工作环境，以确保检测结果的可靠性，防止交叉污染，防止差错、事故及纠纷的发生。
2.适用范围：所有本实验室人员。
3.负责人：4.细则：4. 1本实验室进行临床基因扩增检测及相关实验工作，不得进行其它实验操作。
4. 2各区的用品不得混用。
4. 3在各区的实验操作过程中，操作者必须戴手套和帽子，严格按照操作规程。
4. 4试剂准备区只能进行试剂的贮存及配制等相关操作（见相关SOP文件）。
4. 5标本处理区只能进行临床标本的保存，核酸提取、保存及其加入至扩增反应管和测定RNA时cDNA的合成（见相关SOP文件）。
PCR检验实验室检查要点指南
PCR检验实验室检查要点指南PCR是聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction）的缩写，是一种高灵敏度、高特异性的DNA扩增技术。
它在医学、生物学、犯罪学等领域得到广泛应用。
PCR检验实验室检查要点如下：1.实验室环境：PCR实验室应设有相应的负压水平，以防止污染的扩散。
实验室应具备空气过滤系统和紫外灭菌设备，以确保环境的洁净度。
2.试剂和材料：PCR试剂应由可靠的供应商提供，且应在正确的温度下储存。
试剂的携带和保存必须符合安全规范。
实验室应定期检查试剂的有效期和浓度，确保其质量。
3.实验室设备：PCR实验室应配备专门的PCR仪和相关设备，确保实验的准确性和稳定性。
设备的运行和维护要按照厂家的指导手册进行。
4.实验操作：PCR实验操作过程应严格按照标准程序进行，包括样品的提取、DNA的纯化、试剂的准备和试剂的加入顺序等。
实验人员应经过专门培训，严格遵守操作规程，如戴好手套、使用滤液器等，以减少污染的风险。
5.核酸提取：在PCR检验前，核酸提取是必要的步骤。
为了确保提取的DNA质量和浓度，实验室应使用可靠的商业试剂盒进行核酸提取。
6.反应条件：PCR反应的条件包括温度、时间和缓冲液成分等。
这些条件对PCR反应的效率和特异性至关重要。
实验室应严格按照PCR试剂盒说明书中的条件进行反应。
7.防污染措施：PCR反应非常敏感，很容易受到外部环境中的DNA污染。
因此，实验室应采取一系列的措施来减少污染的风险，如分离不同试剂的操作区域，使用滤液器和消毒液等。
8.内部质量控制：PCR实验室应定期进行内部质量控制。
这包括使用正、负对照，以确保PCR反应的准确性和可靠性。
对于需要定量的PCR反应，还应建立标准曲线，以确保定量结果的准确性。
9.结果分析和解释：PCR反应完成后，实验室应正确分析和解释结果。
这需要对PCR产物进行检测和鉴定，以确认目标基因或序列是否存在。
10.结果报告和文件存档：PCR实验室应将实验结果详细记录在实验记录表中，并进行审核和存档。
PCR检验实验室检查要点指南
PCR检验实验室检查要点指南PCR（聚合酶链反应）是一种检测基因序列的实验技术。
PCR技术的应用范围广泛，包括疾病诊断、病原体检测、基因突变分析等。
本文将介绍PCR检验实验室的检查要点指南。
一、实验室环境要求1.实验室应保持干净整洁，避免灰尘和杂质的干扰。
2.实验室设备应经常进行检修和清洁，保证设备正常运行。
3.实验室应有稳定的温度和相对湿度，以适应PCR反应需要。
4.实验室应有充足的通风系统，以防止PCR反应中产生的挥发性化合物对实验结果的影响。
二、核酸提取1.核酸提取前，实验人员应佩戴手套、口罩等防护用品，避免外源性核酸的干扰。
2.核酸提取试剂及工具应进行无菌处理，以确保提取的核酸质量。
3.核酸提取前应核对样本标识与登记信息是否一致，避免样本混淆。
三、PCR反应体系准备1.PCR试剂的储存和使用应符合说明书要求，防止试剂变性或受到污染。
2.PCR反应体系的配制应准确无误，包括引物、模板DNA和酶等成分的比例。
3.PCR反应管等试剂器皿应进行无菌处理，避免外源性DNA干扰实验结果。
四、实验仪器使用1.PCR仪的温度控制和均匀性应进行验证。
2.电泳仪的供电、反应液浓度和电泳条件应进行调试，确保能够得到清晰的条带。
五、质控措施1.引物应经过合成和验证，确保特异性和灵敏度。
2.采用阳性对照和阴性对照，以验证PCR反应体系的准确性和可靠性。
3.反应阴性对照应添加，以检测试剂和实验过程中的污染情况。
4.实验过程中的操作人员应定期参加技能培训和质量控制培训，提高实验操作技术和质量意识。
六、实验记录1.对每个样本和控制试剂的操作过程进行详细记录，包括样本条码、操作时间、反应体系等信息。
2.实验人员应填写实验记录表格，并对异常情况进行说明。
3.实验数据和结果进行保留，并按照实验室规定的期限进行归档。
七、结果解释与报告1.PCR结果的分析应由专业人员进行，确保结果准确可靠。
2.PCR结果应进行解读，并结合临床资料进行分析和判断。
实时荧光定量PCR测定基因表达量
实时荧光定量PCR测定基因表达量一．实验目的1、了解实时荧光定量PCR的测定原理，并与一般PCR比较。
2、掌握实验方法和荧光定量PCR仪的使用方法。
2、用实时荧光定量PCR测定基因表达量并进行结果讨论二．实验原理1、基本原理：实时荧光定量PCR技术是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定性及定量分析的方法。
2、荧光定量PCR的重要参数和曲线：（1）扩增曲线：荧光信号的变化量的对数与PCR反应循环数的关系，指数期很明显，在确定阈值线时具有简单明了的特点，所以很多软件都采用上图的形式，当然，这两种实时扩增曲线可以根据实验的需要相互转换。
（2）阈值线：在荧光定量PCR扩增的指数期，画一条线，在此直线上，所有样品的荧光强度与其本底荧光强度的差值全部相同。
（3）Ct值：是指每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数。
在扩增曲线中（循环数为横坐标，荧光强度为纵坐标），存在一段对数增加区，在这段对数区中设一个阈值，对于不同的起始拷贝数的样品，Ct值不同。
拷贝数越多，Ct值越小。
3、荧光定量PCR的数学原理理想的PCR反应：X=X0*2n非理想的PCR反应：X=Xo(1+Ex)nn ：扩增反应的循环次数X：第n次循环后的产物量X0：初始模板量Ex：扩增效率在扩增产物达到阈值线时：X Ct=X0（1+Ex)Ct=M (1)XCt：荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量在阈值线设定以后，它就是一个常数，我们设为M方程式（1）两边同时取对数得：LogM=logX0（1+Ex)Ct (2)整理得：logX0=-log（1+Ex)*Ct+logM (3)绝对定量：先用已经不同拷贝数梯度的标准样品得到一条LogX0与Ct值的标准曲线，再将样品的Ct值代入求得样品的拷贝数X0。
相对定量：通过比较两个或多个处理的样本之间的基因表达差异，来研究处理的效果。
PCR测定的技术要点
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采集及运输容器
标本采集要采用一次性材料，运 输要求为密闭一次性装置。如需 使用抗凝剂，一般采用EDTA或枸 橼酸盐，因肝素对PCR反应有很强 的抑制作用，且在核酸提取过程 中难以去除
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标本采集中的防污染
采集过程中操作者应注意防范， 避免在标本中混入操作者的毛发、 表皮细胞、痰液
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标本的处理
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膜上杂交技术检测结果
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微孔板杂交技术
类似于ELISA技术中的双抗体夹心法。 首先通过微孔板孔壁上包被的捕获探 针来捕获PCR产物。然后再用带有标 记的检测探针与产物另一区域杂交， 经过漂洗显色即可判断结果。 可用酶标仪判读，用于半定量测定。 但整个操作过程不是全封闭的，易造 成扩增产物污染。
第三循环
70~75℃ 延伸 ℃
5' 3' 3' 5' 5' 3' 5' 3' 目的DNA 目的
第二循环
模板变性、 模板变性、退火
延伸
总扩增产物： 总扩增产物：2n倍增加 长片段序列： 倍增加 长片段序列：2n倍增加 目的DNA： 2n -2n 倍增加 目的 ：
8
PCR反应的基本成分 反应的基本成分 及其对结果的影响
特异性强
主要由引物特异性决定，对于一个20nt的引物其非特异性配对 的概率为1/4 20。PCR可以克服血清学诊断中存在的交叉反应
可早诊断
可在免疫学诊断窗口期就早期诊断
不受患者免疫状态的影响 PCR可对病原体进行定量分析并可对病原体进 行基因分型，指导临床用药和治疗。
40
不足之处：
操作复杂，技术不易被熟练掌握 价格昂贵 存在假阳性和假阴性结果
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PCR 测量指南 PCR 测量－是什么问题？如何解决？
利用节目时钟，可使数字TV 接收机的解码视频输出锁定于编码器输入端的视频信号源。
有关PCR 的测量常被人误解。
这篇短文将从技术上介绍影响PCR 的一些因素以及如何进行正确的测量。
法。
随后实际系统的操作实践，要求对PCR 测量作进一
步的阐述 — 从而形成了ETR290、TR101 290
的修订版本。
本文拟简要介绍新的
PCR 测量方法。
还对另外的三项测量方法加以说明，这三项测量一起对整个系统性能提供十分清楚而又重要的图解显示，并可作为对原先测量的补充。
技术简介
图1 解码器/复用器中的PCR插入
数据包头包含的PCR如图2所示。
图中，6个字节用作时
间基准。
复用器应当保证插入在TS中的PCR值反映它在
TS中的最终时间定位。
在接收器中，由TS和计数器数值中恢复的PCR值同由本
地产生的计数器数值之间的差值就可用来驱动一个相位
锁定环路 (PLL) 以控制本地时钟。
很明显，时钟间的差
值大小会引起本地时钟或多或少的变化，PLL的特性反映
了这种实际变化。
PLL可以跟踪低频的少量变化，但不能
跟踪高频端的变化。
接收机本地产生的27MHz时钟可用
来再生其输出端的视频。
该时钟频率的任何变化均可传
送到其输出视频信号，作为该视频信号中的等效定时损
伤信息。
某些器件例如用户TV显示也许能接收到这些信
息，其它器件例如专业重编码器也许接收不到，导致系
统失锁而丢失节目。
图2 含有PCR 的传输码流包结构
为了消除DVB 系统中节目素材中的接收错误，PCR 是必不可少的。
然而，PCR 中的定时损伤又会引起节目的丢失。
PCR 测量指南
技术简介
PCR 精度(PCR_AC)的测量中,将△t PCR 的测量结果与△t b 相比较，二者间的差值与复用器或再复用器的精度有关，而且不受传输损伤的影响。
在PCR 总抖动(PCR_OJ)的测量中，将△t PCR 的测量结果与△t b 相比较，二者间的差值包含了实际到达解码器/再复用器的PCR 值的时间变量，因而包含了由网络引起的所有传输损伤以及精度误差。
由网络引起的损伤和精度误差之间，在这里并无差异，因此命名为为总抖动(Overall jitter)。
这是一种由解码器/再复用器发现的总抖动，它可能是产生问题的主要原因。
图3 TS 中的嵌入时钟图示
PCR 测量指南
技术简介。