DEAE Sephadex A-50使用说明
sephadex知识剖析
【操作步骤】
（1）A-50经酸碱处理，平衡至中性后，浸泡于0.1mol/L， pH7.4 PB中，置4℃冰箱储存备用。 （2）装柱：同DE52。 （3）平衡：松开出水口螺旋夹，以PB平衡，控制流速为 15滴/min，• 待洗脱液与流出液之pH值达到一致时，停止 平衡。 （4）加样、洗脱、收集与浓缩：基本上同DE52，以 0.1mol/L PB洗脱。 用过的DEAE-Sephadex A-50可用0.5mol/L Na2HPO4洗 脱回收。洗至流出液中无蛋白（OD280nm<0.04）后再用 蒸馏水洗至中性，加入0.02％叠氮钠于4℃保存备用。
Sephadex系统知识
葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶系列是当今生物大 分子分离、提取、纯化的重要分离材料， 按性能分包括 凝胶过滤、 离子交换、 疏水层析、 亲和层析，
主要用于蛋白质、核酸、多肽、多糖、酶的脱盐 与分离纯化中。 葡聚糖凝胶为葡聚糖和环氧氯丙烷交联而成的 珠状产品，化学性能稳定，在潮湿、中型ph、高 压120度，灭菌30min情况下，不影响色谱性能， 适用于柱色谱操作。用于蛋白质脱盐及不同分子 量蛋白在凝胶分离范围内的分离纯化，可在酶、 多糖、核酸和其它生物大分子的纯化中广泛应用。
葡聚糖凝胶LH
用途：分离水不溶物质。 葡聚糖凝胶LH-20/Sephadex LH-20 分离中 等大小生物分子，球蛋白分离范围100～ 4000 葡聚糖凝胶LH-60/Sephadex LH-60 分离 100～20000
葡聚糖凝胶C阳离子交换剂，吸附碱 性蛋白：
羧甲基葡聚糖凝胶C-25/CM葡聚糖凝胶C-25/CM Sephades C-25 应用：MW＞20000；载量4-5mmol/g 羧甲基葡聚凝胶C-50/CM葡聚糖凝胶C-50/CM Sephades C-50 应用：中等大小生物分子（30－200KD）；载量45mmol/g SP葡聚糖凝胶C-25/SP Sephades C-25 应用：MW>200 KD；载量：2.0-2.6mmol/g SP葡聚糖凝胶C-50/SP Sephades C-50 应用：中等大小 生物分子（30－200KD）；载量：2.0-2.6mmol/g
鸡软骨Ⅱ型胶原蛋白的提纯与鉴定
鸡软骨Ⅱ型胶原蛋白的提纯与鉴定目的探讨可溶性Ⅱ型胶原蛋白(CⅡ)的提纯方法。
方法以雏鸡胸软骨为原材料,酸性条件下经胃蛋白酶消化,离心后,应用DEAE-Sephadex A-50进行离子交换层析,透析,盐析,得到纯化的CⅡ。
结果自提的CⅡ样品与CⅡ标准品采用SDS-PAGE电泳显示条带一致。
结论本法提纯CⅡ具有材料丰富,操作简便,重复性好等优点。
标签：Ⅱ型胶原蛋白提取纯化胶原蛋白是结缔组织的重要成分之一,分20余种,其中CⅡ主要存在于软骨基质,占软骨干重的一半以上,研究表明类风湿关节炎(RA)的发病与CⅡ的自身免疫反应有关,国内外均于口服CⅡ诱导免疫耐受治疗RA的相关报道[1～3],该方法有可能成为安全、简便、有效的新型治疗方法。
因此,CⅡ的提纯是我们研究此方法的重要前提,目前国内外文献的报道中多采用盐酸胍来粗提胶原蛋白[4～5],盐酸胍是一种蛋白质变性剂且有一定的毒性,如果在提纯的过程中不能被完全清除,在一定程度上会限制CⅡ的临床应用。
本试验参照Trentham[6]及Miller[7]等方法,用胃蛋白酶法提取,操作简便,重复性好,且提取的CⅡ安全性大。
1临床资料1.1一般资料鸡胸软骨:取材于孵化场17d的雏鸡。
CⅡ:Sigma公司(来源于鸡),5mg/瓶。
1.2主要仪器离心机(日立高速冷冻离心机);层析柜(LKB2023,BROMMA minicoldlab)。
1.3主要试剂胃蛋白酶(Sigma 5g/瓶);DEAE-Sephadex A 50(Amersham);Tris(sigma 100g/瓶)。
1.4CⅡ的粗提将新鲜干净的鸡胸软骨捣碎成糊状,用缓冲液和蒸馏水分别洗涤2遍,然后将其悬浮于0.5mol/L的醋酸中(调pH为2.5),加入胃蛋白酶,4℃下消化72h,低温离心,取上清液-20℃保存。
沉淀物再次悬浮于0.5mol/L醋酸中,同样条件下胃蛋白酶重复消化,离心2次。
将3次上清液混匀,用pH7.6,0.05mol/L Tris-Hcl,0.2mol/LNaCl 溶液充分透析。
多糖的纯化实验报告
一、实验目的1. 掌握多糖纯化的基本原理和方法。
2. 学习并运用DEAE-Sephadex A-50柱层析技术对多糖进行纯化。
3. 通过比色法测定纯化前后多糖的浓度，评价纯化效果。
二、实验原理多糖是一类重要的生物大分子，具有广泛的生物活性。
然而，天然多糖往往伴随着一些蛋白质、脂肪和色素等杂质，这些杂质会干扰多糖的结构鉴定和活性分析。
因此，对多糖进行纯化是研究多糖生物活性的关键步骤。
多糖的纯化主要包括以下步骤：1. 提取：采用热水浸提法或超声波辅助提取法等从植物、动物或微生物中提取多糖。
2. 净化：去除提取液中的蛋白质、脂肪和色素等杂质。
3. 纯化：利用DEAE-Sephadex A-50柱层析技术对多糖进行纯化。
4. 测定：通过比色法测定纯化前后多糖的浓度，评价纯化效果。
三、实验材料1. 实验药品：DEAE-Sephadex A-50柱层析材料、氨水、盐酸、无水乙醇、葡萄糖标准品等。
2. 实验仪器：层析柱、紫外可见分光光度计、离心机、移液器、容量瓶等。
四、实验方法1. 提取：称取一定量的多糖样品，加入适量蒸馏水，用超声波辅助提取法提取多糖。
提取液离心分离，取上清液作为待纯化样品。
2. 净化：将待纯化样品加入适量的氨水，调节pH值至7.0，静置一段时间。
离心分离，取上清液作为待纯化样品。
3. 纯化：将DEAE-Sephadex A-50柱层析材料预处理后，装入层析柱。
将待纯化样品上柱，用蒸馏水进行梯度洗脱。
收集洗脱液，利用紫外可见分光光度计检测洗脱液中的多糖含量。
4. 测定：配制葡萄糖标准溶液，绘制标准曲线。
将纯化后的多糖样品按照比色法进行测定，计算纯化前后多糖的浓度。
五、实验结果1. 提取：超声波辅助提取法提取多糖，提取率约为70%。
2. 净化：氨水处理去除蛋白质、脂肪和色素等杂质，纯化率约为90%。
3. 纯化：DEAE-Sephadex A-50柱层析纯化，纯化率约为95%。
4. 测定：纯化前后多糖浓度分别为1.5 mg/mL和0.7 mg/mL，纯化效果良好。
DEAE sephadex A50
DEAE-Sephadex A-50柱层析纯化免疫球蛋白撰稿欧阳笑梅原理试剂和器材操作步骤注意事项(一) 原理DEAE-SephadexA-50(二乙基氨基乙基-葡聚糖A-50)为弱碱性阴离子交换剂。
用NaOH将CL-型转变为OH-型后，可吸附酸性蛋白。
血清中的γ球蛋白属于中性蛋白(等电点为PH6.85～7.5)，其余均属酸性蛋白。
在PH7.2～7.4的环境中，酸性蛋白均被DEAE-Sephadex A-50吸附，只有γ球蛋白不被吸附。
因此，通过柱层析γ球蛋白便可在洗脱中先流出,而其他蛋白则被吸附在柱上,从而便可分离获得纯化的IgG。
DEAE-sephadexA-50柱层析是离子交换层析的一种。
(二)试剂和器材1、试剂:(1)盐析提取的人γ球蛋白；(2)0.5N NaOH，0.5N HCl 2M NaCl，10％NaN3；(3)DEAE-Sephadex A-50，聚乙二醇(PEG)；(4)0.1M, PH7.4 PB(配制见盐析部分)；2、器材:(1)层析玻璃柱(1.3×40cm)，滴定铁架，自由夹，螺旋夹，尼龙纱(200目)；(2)普通冰箱，751桮型紫外分光光度计，电导仪、抽滤装置(包括抽气机、干燥瓶、布氏漏斗、橡皮垫圈、抽滤瓶)，PH计；(3)透析袋、座标纸、滤纸、PH精密试纸；(4)量筒、烧杯、试管、吸管、滴管、灭菌小瓶等。
(三) 操作步骤1、DEAE-Sephadex A-50预处理称DEAE-Sephadex A-50(下称A-50)5克，悬于500ml蒸馏水，1小时后倾去上层细粒。
按每克A-50加0.5N NaOH 15ml的比例，将A-50浸泡于0.5N NaOH中，搅匀，静置30分钟，装入布氏漏斗(垫有2层滤纸)中抽滤，并反复用蒸馏水抽洗至PH呈中性；再以0.5N HCl同上操作过程处理，最后以0.5N NaOH再处理一次。
处理完后，将A-50浸泡于0.1M，PH 7.4 PB中过夜。
植物多糖分离纯化方案
多糖提取物 的分离纯化
在多糖提取物中，常会有无机盐、蛋白质、色 素及小分子物质等杂质，必须分别除去．一般 是先脱除非多糖组分，再对多糖组分进行分级 ．
? . 除蛋白
? 蛋白的分离方法较多，如Sevag法、三氯乙酸沉淀法、ZnS04沉淀法、酶法等。 Sevag法为实验常用法，谚法以正丁醇与氯仿按4：l混合，再行革取。蛋白酶除蛋 白是目前认为较好方法，将蛋白水解，再透析除去。
取上清， 70°C减压浓缩 加3倍体积95％ 乙醇沉淀，至醇含量在 80％以上，不断搅拌
离心收集沉淀，将沉淀置于布氏漏斗中，分别用无水甲醇、丙醇和乙 醚洗涤，以除去水分和杂质 冷冻干燥，得粗多糖
多糖不同的植物中，有着不同的含量和 贮存位置，因此针对不同的植物有着不 同的分离方法。
溶剂提取法 水提 法
? 按图 2 所示 流程对 CGP 进行分离纯化。DEAE Cellulose 装柱 (1.6 cm×40 cm),0.02 mol/L PBS 平衡后上样 CGP 30 mg,进行洗脱收集。 流速 1.0 mL/min,每 10 min 收集一管;用过的 DEAE Sephadex A-50 柱经 再生处理后用 0.02 mol/L PBS 平衡,完毕后上样 CGP-c1 10 mg, 进一步分离纯化,流速 0.2 mL/ min,每 15 min 收集一管。
凝胶色谱法鉴定纯度
多糖取2mg溶于水，上Sephadex G一200(15 mm X 80 cm)凝胶柱层析 ，以蒸馏水洗脱，体积流量l ml／10 min，按2ml每管分部收集，洗脱液 用0．1％蒽酮一硫酸法显色，紫外测定吸光度值，依吸光度对洗脱液体 积作图。
纸色谱 (PC)初步结构鉴定
酸水解：称取l0mg多糖RP置25 ml具塞试管中，加入6％硫酸3ml，封管，在 120°C烘箱中水解6 h，用CaCO3 中和至中性，过滤，用蒸馏水洗涤滤渣3～4次 ，每次3～5ml，滤液浓缩后点样于层析纸，并用标准单糖葡萄糖、D一半乳糖、D 一阿拉伯糖、D一木糖、D一甘露糖作对照，展开剂为乙酸乙酯一啶．冰乙酸．水 (5：5：1：2)，显色剂为苯胺．邻苯二甲酸，在1l0 喷雾显色10 min。
DEAE sephrose FF说明及使用
DEAE琼脂糖凝胶FF的详细资料：英文名称：DEAE Sepharose FFCAS号：57407-08-6级别：BR凝胶类型：离子交换填料，弱碱型结构成分：6%交联琼脂糖粒径： 45-165μm配基基团：diethylaminoethyl （二乙氨乙基）蛋白质吸附量：110mgHSA/ml凝胶总离子交换量：0.11-0.16mmol/ml凝胶交换载量：3.1mg Thyroglobulin/ml drained medium；110 mg HSA/ml drained medium；100mg α-lactalbumin/ml drained medium流速：300~600 cm/h;最大流速750 cm/h工作PH值：2-9工作温度：4-40℃PH稳定性：1~14 (短时间,在位清洗);2~12 (长时间）耐压：0.3MPa性状：白色微球,凝胶状、含20%乙醇，底部为乳白色胶体用途：生化研究、适用于各种带负性电荷生物大分子的浓缩纯化等、利用离子交换作用，应用于蛋白等生物分子的快流速高产量纯化等保存：2～8℃包装：100毫升/瓶，500毫升/瓶、1升/瓶等离子交换层析分离蛋白质【实验目的】通过分离蚓激酶的实验，学习和掌握离子交换层析法的工作原理和离子交换介质的选择；了解离子交换树脂的处理及转型；学习该实验方法的筛选和基本操作技术。
【实验原理】离子交换层析是一种吸附层析，利用不同蛋白质表面电荷的差异而达到分离、纯化蛋白质的目的。
阴离子交换剂的电荷基团带正电，反离子带负电,因此这种交换剂可以与溶液中的负电荷化合物或阴离子进行交换反应；阳离子交换剂则反之。
【实验材料】0.05M Tris-HCl pH7.5、1M NaCl 0.05M Tris-HCl pH7.5、蚓激酶粗提物、20%乙醇、1MNaOH、DEAE-Sepharose Fast Flow柱、AKTA purifier 液谱纯化系统、高速离心机、电子天平、试管、一次性滤器、2ml注射器、2ml Eppendorf管、冲洗瓶、玻璃滤器【实验方法】1离子交换介质：选用Hitrap DEAE-SepharoseFF阴离子交换层析柱。
DEAE_sephadex处理方法
(一) 原理DEAE-SephadexA-50(二乙基氨基乙基-葡聚糖A-50)为弱碱性阴离子交换剂.用NaOH将CL-型转变为OH-型后,可吸附酸性蛋白.血清中的γ球蛋白属于中性蛋白(等电点为PH6.85~7.5),其余均属酸性蛋白.在PH7.2~7.4的环境中,酸性蛋白均被DEAE-Sephadex A-50吸附,只有γ球蛋白不被吸附.因此,通过柱层析γ球蛋白便可在洗脱中先流出,而其他蛋白则被吸附在柱上,从而便可分离获得纯化的IgG.DEAE-sephadexA-50柱层析是离子交换层析的一种.(二)试剂和器材1、试剂:(1)盐析提取的人γ球蛋白;(2)0.5N NaOH,0.5N HCl 2M NaCl,10%NaN3;(3)DEAE-Sephadex A-50,聚乙二醇(PEG);(4)0.1M, PH7.4 PB(配制见盐析部分);2、器材:(1)层析玻璃柱(1.3*40cm),滴定铁架,自由夹,螺旋夹,尼龙纱(200目);(2)普通冰箱,751桮型紫外分光光度计,电导仪、抽滤装置(包括抽气机、干燥瓶、布氏漏斗、橡皮垫圈、抽滤瓶),PH计;(3)透析袋、座标纸、滤纸、PH精密试纸;(4)量筒、烧杯、试管、吸管、滴管、灭菌小瓶等.(三) 操作步骤1、DEAE-Sephadex A-50预处理称DEAE-Sephadex A-50(下称A-50)5克,悬于500ml蒸馏水,1小时后倾去上层细粒.按每克A-50加0.5N NaOH 15ml的比例,将A-50浸泡于0.5N NaOH中,搅匀,静置30分钟,装入布氏漏斗(垫有2层滤纸)中抽滤,并反复用蒸馏水抽洗至PH呈中性;再以0.5N HCl同上操作过程处理,最后以0.5N NaOH再处理一次.处理完后,将A-50浸泡于0.1M,PH 7.4 PB中过夜.2、装柱(1)将层析柱垂直固定于滴定铁架上,柱底垫一园尼龙纱,出水口接一乳胶或塑料管并关闭开关.(2)将0.1M,PH7.4 PB沿玻璃棒倒入柱中至1/4高度,再倒入经预处理并以同上缓冲液调成稀糊状的A-50.待A-50凝胶沉降2-3cm厚时,启开出水口螺旋夹,控制流速1ml/分钟,同时连续倒入糊状A-50凝胶至所需高度.(3)关闭出水口,待A-50凝胶完全沉降后,柱面放一园形滤纸片,以橡皮塞塞紧柱上口,通过插入橡皮塞之针头及所连接的乳胶或塑料管与洗脱液瓶相连接.3、平衡:启开出水口螺旋夹,控制流速12-14滴/分钟,使约2倍床体积的洗脱液流出.并以PH 计与电导仪分别测定洗脱液及流出液之PH值与离子强度是否相同.达到一致时关闭出水口,停止平衡.4、加样及洗脱:启开上口橡皮塞及下口螺旋夹,使柱中液体缓慢滴出,当柱面液体与柱面相切时,立即关闭出水口,以毛细滴管沿柱壁加入样品(体积应<床体积的2%,蛋白浓度以<100mg为宜).松开出水口螺旋夹使柱面样品缓慢进入柱内,至与柱面相切时,立即关闭下口,以少量洗脱液洗柱壁2-3次;再放开出水口,使洗液进入床柱,随后立即于柱面上加入数ml洗脱液,紧塞柱上口,使整个洗脱过程成一密闭系统.并控制流速12~14滴/分钟.5. 收集:开始洗脱的同时就以试管进行收集.每管收集3~5ml.共收集10~15管.6. 测蛋白:以751-G型紫外分光光度计分别测定每管OD280nm,与OD260nm,按前述公式计算各管蛋白含量.并以OD280nm为纵座标,以试管编号为横座标,绘制洗脱曲线.7. 合并、浓缩:将洗脱峰的上坡段与下坡段各管收集液分别进行合并,以PEG(MW6000)洗缩至所需体积,加入0.02%NaN3防腐剂,于4℃保存备用.8. A-50凝胶的再生:在柱上先以2M NaCl洗柱上的杂蛋白至流出液的OD280nm<0.02,再以蒸馏水洗去柱中盐.然后按预处理过程将A-50再处理一遍即达再生.近期用时泡于洗脱缓冲液中4℃保存;近期不用时,以无水酒精洗2次,再置50℃温箱烘干,装瓶内保存.(四) 注意事项1. 柱的选择:从理论上说,只要柱足够长,就得获得理想的分辨率,但由于层析柱流速同压力梯度有关,柱长增加使流速减慢,峰变宽,分辨率降低.柱的直径增加,使液体流动的不均匀性增加,分辨率明显下降.2. 纯化过程必须严格控制脱缓冲液的PH及离子强度.样品与A-50凝胶必须用洗脱缓冲液彻底平衡后,才能进行柱层析.3. 所装的柱床必须表面平整,无沟流及气泡,否则应重装.4. 洗脱过程中应严格控制流速,且勿过快.5. 上样的体积要小,浓度不宜过高.6. 加样及整个洗脱过程中,严防柱面变干.。
DEAE凝胶使用说明
DEAE凝胶使用说明1.准备工作：-检查DEAE凝胶的质量：确保没有受到严重污染或老化，外观应为均匀的白色颗粒。
-确保实验室内的仪器和设备已经彻底清洁，并消毒所需的器具。
-准备所需的缓冲液和其他试剂，确保其符合实验目的和DEAE凝胶的使用要求。
2.DEAE凝胶的预处理：-使用1M氢氧化钠（NaOH）溶液将DEAE凝胶悬浊液平衡至碱性条件，通常使用10倍体积的溶液。
-在室温或较高温度下（取决于溶液性质），搅拌凝胶膏悬浊液约30分钟。
-通过过滤或离心凝胶悬浊液，将其与清洁的缓冲液或水相分离。
3.DEAE凝胶的装填：-将经过预处理的DEAE凝胶放入柱子中，确保填充均匀。
-起初，可以使用较低的流速将缓冲液通过凝胶柱，以避免凝胶的移位或破碎。
4.样品应用：-将待分离的样品溶解在适当的缓冲液中，并使用适当的浓度和pH值进行预处理。
-以缓慢的速度将样品注入DEAE凝胶柱中，以避免柱床破碎并确保样品均匀分布。
5.洗脱和洗涤：-使用适当的缓冲液进行柱洗脱，以清除非目标分子和其他杂质。
-可使用梯度洗脱，逐渐增加盐浓度或改变缓冲液的pH值，以逐步洗脱需纯化的目标分子。
-可使用电镜、紫外吸收光谱等方法监测样品的洗脱效果。
6.贮存和保养：-分离纯化后的目标物质，根据其特性选择适当的储存条件，并确保它们的稳定性和活性。
-要洗涤和存储DEAE凝胶柱，使用适当的缓冲液，并跟随厂家提供的建议来保持柱子的良好状态。
1.DEAE凝胶在潮湿环境中易吸湿结块，因此应储存在干燥的环境中，并避免接触水分。
2.在使用DEAE凝胶前，应仔细阅读和遵守产品厂家提供的操作手册和说明。
3.使用适当的防护设备，如手套和实验室外套，以避免对身体造成伤害。
4.避免直接接触凝胶材料，以免发生过敏或刺激。
5.处理使用过的DEAE凝胶时，遵循有关废弃物处理的当地法规。
DEAE凝胶是一种常用的分离纯化工具，但其使用需要严格控制各个步骤和条件。
正确使用和操作DEAE凝胶可以提高实验结果的可靠性和重复性，并提高样品纯度。
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DEAE-Sephadex A-50柱层析纯化免疫球蛋白
原理
试剂和器材
操作步骤
注意事项
(一) 原理
DEAE-SephadexA-50(二乙基氨基乙基-葡聚糖A-50)为弱碱性阴离子交换剂。
用NaOH将CL-型转变为OH-型后，可吸附酸性蛋白。
血清中的γ球蛋白属于中性蛋白(等电点为PH6.85～7.5)，其余均属酸性蛋白。
在PH7.2～7.4的环境中，酸性蛋白均被DEAE-Sephadex A-50吸附，只有γ球蛋白不被吸附。
因此，通过柱层析γ球蛋白便可在洗脱中先流出,而其他蛋白则被吸附在柱上,从而便可分离获得纯化的IgG。
DEAE-sephadexA-50柱层析是离子交换层析的一种。
(二)试剂和器材
1、试剂:
(1)盐析提取的人γ球蛋白；
(2)0.5N NaOH，0.5N HCl 2M NaCl，10％NaN3；
(3)DEAE-Sephadex A-50，聚乙二醇(PEG)；
(4)0.1M, PH7.4 PB(配制见盐析部分)；
2、器材:
(1)层析玻璃柱(1.3×40cm)，滴定铁架，自由夹，螺旋夹，尼龙纱(200目)；
(2)普通冰箱，751桮型紫外分光光度计，电导仪、抽滤装置(包括抽气机、干燥瓶、布氏漏斗、橡皮垫圈、抽滤瓶)，PH计；
(3)透析袋、座标纸、滤纸、PH精密试纸；
(4)量筒、烧杯、试管、吸管、滴管、灭菌小瓶等。
(三) 操作步骤
1、DEAE-Sephadex A-50预处理
称DEAE-Sephadex A-50(下称A-50)5克，悬于500ml蒸馏水，1小时后倾去上层细粒。
按每克A-50加0.5N NaOH 15ml的比例，将A-50浸泡于0.5N NaOH中，搅匀，静置30分钟，装入布氏漏斗(垫有2层滤纸)中抽滤，并反复用蒸馏水抽洗至PH呈中性；再以0.5N HCl同上操作过程处理，最后以0.5N NaOH再处理一次。
处理完后，将A-50浸泡于0.1M，PH 7.4 PB 中过夜。
2、装柱
(1)将层析柱垂直固定于滴定铁架上，柱底垫一园尼龙纱，出水口接一乳胶或塑料管并关闭开关。
(2)将0.1M，PH7.4 PB沿玻璃棒倒入柱中至1/4高度，再倒入经预处理并以同上缓冲液调成稀糊状的A-50。
待A-50凝胶沉降2-3cm厚时，启开出水口螺旋夹，控制流速1ml/分钟，同时连续倒入糊状A-50凝胶至所需高度。
(3)关闭出水口，待A-50凝胶完全沉降后，柱面放一园形滤纸片，以橡皮塞塞紧柱上口，通过插入橡皮塞之针头及所连接的乳胶或塑料管与洗脱液瓶相连接。
3、平衡:启开出水口螺旋夹，控制流速12-14滴/分钟，使约2倍床体积的洗脱液流出。
并以PH计与电导仪分别测定洗脱液及流出液之PH值与离子强度是否相同。
达到一致时关闭出水口，停止平衡。
4、加样及洗脱:
启开上口橡皮塞及下口螺旋夹，使柱中液体缓慢滴出，当柱面液体与柱面相切时，立即关闭出水口，以毛细滴管沿柱壁加入样品(体积应<床体积的2％，蛋白浓度以<100mg为宜)。
松开出水口螺旋夹使柱面样品缓慢进入柱内，至与柱面相切时，立即关闭下口，以少量洗脱液洗柱壁2-3次；再放开出水口，使洗液进入床柱，随后立即于柱面上加入数ml洗脱液，紧塞柱上口，使整个洗脱过程成一密闭系统。
并控制流速12～14滴／分钟。
5.收集：开始洗脱的同时就以试管进行收集。
每管收集3～5ml。
共收集10～15管。
6.测蛋白：以751-G型紫外分光光度计分别测定每管OD280nm，与OD260nm，按前述公式计算各管蛋白含量。
并以OD280nm为纵座标，以试管编号为横座标，绘制洗脱曲线。
7.合并、浓缩：将洗脱峰的上坡段与下坡段各管收集液分别进行合并，以PEG(MW6000)洗缩至所需体积，加入0.02％NaN３防腐剂，于4℃保存备用。
8.A-50凝胶的再生:在柱上先以2M NaCl洗柱上的杂蛋白至流出液的OD280nm<0.02，再以蒸馏水洗去柱中盐。
然后按预处理过程将A-50再处理一遍即达再生。
近期用时泡于洗脱缓冲液中４℃保存；近期不用时，以无水酒精洗2次，再置50℃温箱烘干，装瓶内保存。
(四) 注意事项
1.柱的选择：从理论上说，只要柱足够长，就得获得理想的分辨率，但由于层析柱流速同压力梯度有关，柱长增加使流速减慢，峰变宽，分辨率降低。
柱的直径增加，使液体流动的不均匀性增加，分辨率明显下降。
2.纯化过程必须严格控制脱缓冲液的PH及离子强度。
样品与A-50凝胶必须用洗脱缓冲液彻底平衡后，才能进行柱层析。
3.所装的柱床必须表面平整，无沟流及气泡，否则应重装。
4.洗脱过程中应严格控制流速，且勿过快。
5.上样的体积要小，浓度不宜过高。
6.加样及整个洗脱过程中，严防柱面变干。