抗体筛选和鉴定.pdf
抗体筛选理论及方法(杨君青)
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原理和意义
抗筛细胞的要求 试管法抗球蛋白试验 凝胶法抗球蛋白试验 聚凝胺试验 常见疑难问题
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内 套 管壁
反应 室 反 应 室 底 孔 外管壁 亲和凝 胶
特殊粘液
试剂或 盐水 凝胶或 玻璃珠
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凝胶技术的原理
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溶血性抗体：抗体在体外激活补体，导致溶血。 可用5%的EDTA按1:10比例加入血清中，螯合钙离子 ，抑制补体激活。 冷抗体：先离心，37℃孵育2-3分钟，在水浴箱中直 接看结果。 自身抗体：直抗试验。
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常用的质控方法： 1. 聚凝胺法：用阳性对照试剂与待检血清按同样步骤进 行质控试验，结果应为“1+”的弱凝集。
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如果红细胞表面结合了抗体/补体，加入抗球蛋白分子后，可 在这些抗体/补体之间“搭桥”，产生红细胞凝集现象。 自身免疫性溶血性贫血、输血反应、新生儿溶血病的诊断
/wikipedia/commons/1/1c/Coombs_test_schematic.
反应室下端底孔很小，液体在孵育过程中不会流入下方微 柱中。 离心时，反应室中的红细胞和血清混合液穿过反应室底孔 ，与微柱中液体汇合。由于该液体的比重在红细胞与血清 之间，血清比重低，因此不能在离心力的作用下继续向柱 底运动，红细胞的比重略重，能继续向下脱离血清穿过液 体层，直达凝胶上部。 在这一过程中，被IgG致敏的红细胞将与液体层中的抗球 蛋白试剂反应，形成凝集，因而无法穿过凝胶层达到柱底 ，红细胞滞留在凝胶层的顶部。 未被IgG致敏的红细胞不会形成凝集，在离心力作用下会 直达柱底。血清因停留在液体层的上部，不会中和液体层 中的抗球蛋白试剂。柱的形状也很重要，很细或呈扁平状 ，柱内液体不易受离心力作用旋转混合
三聚氰胺人源scFv抗体筛选与鉴定
ｃｏ ｅ ， ｓｎ ｎ ｙ ｑｉｋ ｄｉ ｌｎ ｓ ｕ ｉｇｅｚ ｍｅ ｎ ｅ ｍｍｕ ｏ ｏ ｂ ｎ ｓａ ｔ ｏ （ Ｓ ，ｃｏ ｓｒａ ｔ ｅａ ｄｃ ｍｐ ｔｔ ｅｉ ｉｉｏ ｘ ｅ ｉ ｎ ｓ ｎ ｓ ｒ ｅ ｔａ ｓｙｍｅｈ ｄ ＥＩ Ａ） ｒｓ—ｅ ｃｉ ｎ ｏ ｅｉｉ ｈｂｔ ｎｅ ｐ ｒｍｅ ｔ ， Ｉ ｖ ｖ ｎ ｉ
关键 词 ： 体 ； 菌体表 面展 示技 术 ； 抗 噬 三聚氰 胺 中图分 类号 ： ３ ２ １ 文献 标 志码 ： 文 章编号 ：６ １７ １ （ ０ ２ ０ —１ —４ Ｒ ９． １ Ａ １ ７ —４ ４ ２ １ ） ３０ ００
ｄ ｉ１ ． ９ ９ｊ ｉ ｎ １ ７— ４ ４ ２ １ ． ３ ０ ３ ｏ ： ０ ３ ６ ／． ｓ ． ６ １ ７ １ ． ０ ２ ０ ． ０ ｓ
临床输血学实验指导
临床输血学实验指导实验一血型鉴定目的要求:掌握 ABO 血型的鉴定熟悉 Rh 血型的鉴定一、ABO 血型鉴定1. 凡红细胞上具有 A 抗原者为 A 型 ; 有 B 抗原者为 B 型 ;A 和B 抗原都没有者为 O 型 ;A 和 B 抗原都有者为 AB 型。
2.ABO 血型检查法 :将被检者红细胞用生理盐水洗涤 1-2 次 , 配成 2-5% 悬液待用。
(1)正定型 : 取小试管二只 , 分别用记号笔标记后加抗 A 、抗 B血清各一滴 , 然后各加受检者红细胞悬液一滴。
(2) 反定型 : 取小试管三只 , 分别用记号笔标记后加受检者血清一漓 , 然后加标准 A 、 B 及O 型红细胞各一漓。
将上述混匀后 , 静置数分钟 , 或 3 ∞ 0 转 /min 离心 15 秒后 , 肉眼判断凝集度。
结果判断:二、阳血型鉴定1.Rh 血型系是目前为止所发现的红细胞血型系中最为复杂的一个血型系。
至今已发现的抗原 40 多个 , 但涉及临床问题的主要是 5 个抗原 , 即 C 、 c 、 D 、 E 、 e 及其相应的特异性抗体。
目前输血界普遍认为凡带有 D 抗原者 , 称为阳阳性 , 不带 D 抗原者称为 Rh 阴性。
但是从输血免疫及血型血清学角度来看 , 只有 cedee 才是真正的 Rh 阴性者。
2.m 血型检查法一般情况下 ,Rh 血型鉴定中只进行 Rh(D) 定型。
遇有特殊情况时才进行 Rh 血型系中 5 个抗原的定型。
现售的 Rh(D) 抗血清大多为单克隆 IgM 型或 IgMdgG 型。
方法 :取小试管 1 支 , 用笔标记好后 , 加入 mI 抗 D 血清 1 滴 , 若为单克隆的 IgM 型或 IgMdgG抗血清 , 加 2%-5% 受检者红细胞盐水悬液 1 漓 , 混匀 ,3000r/min 离心 15 秒 , 肉眼观察凝集度。
若为 IgG 型血清 , 需加做 2% 受检者红细胞及菠萝酶液各 1 滴 , 混匀 , 置 37 ℃水浴 30 分钟 , 30 ∞ r/min 离心 15 秒 , 肉眼观察凝集度。
scFv抗体的筛选和活性研究(Molecular Devices)
靶向FGFR3胞外区域的人scFv抗体的筛选和活性研究成纤维细胞生长因子(FGF)是最大的一类中胚层和上皮细胞生长分化多肽因子家族。
FGFs在许多生物学过程中发挥重要作用，比如胚胎发育，伤口愈合，血细胞生成及血管发生等。
此外，已有研究表明FGFs可以增加多种肿瘤细胞的浸润性，如前列腺、膀胱、肾脏、乳房、胰腺等部位肿瘤。
目前，共发现20多种FGFs，对不同类型细胞具有不同的作用。
但是，只发现了5种FGF受体(FGFR)。
在蛋白水平上，这些受体具有55%-72%的同源性。
FGFR结构包括一个胞外配体结合区域，一个跨膜区域以及一个胞内激酶区域。
配体结合区域包含三个不同的类似免疫球蛋白结构域(称为免疫球蛋白I，II和III)。
FGFR1-3 mRNA的不同的剪接作用形成两种亚型α和β。
其中FGFR3具有两种不同的突变体IIIb和IIIc。
这两种变体具有不同的亲和活性：IIIc分布更加广泛，能和多种FGFs结合(FGF1，FGF2，FGF4，和FGF9)；IIIb优先和FGF1结合，能够较低程度和FGF8和FGF9结合。
在有肝素(heparin)作用的情况下，FGFs和FGFRs结合后，FGFs诱导受体二聚化，引起胞内激酶区域的自身磷酸化以及下游信号级联反应的激活。
配体受体结合后，FGFs会启动多种信号转导途径：胞内钙离子水平升高，诱导丝裂原活化蛋白激酶和蛋白激酶C通路，激活腺苷酸环化酶以及诱导原癌基因c-myc 和c- fos。
已发现FGFR3会发生特殊突变，导致其酪氨酸激酶活性激活，引起一些与骨骼发育，多发性骨髓瘤，颈部肿瘤以及膀胱肿瘤相关的综合征。
最近的研究发现FGFR信号是前列腺肿瘤细胞在体外存活所完全必需的。
近来，FGFR3已被作为多发性骨髓瘤的可能治疗性靶点。
尽管已有确实证据表明激活的FGFR3突变存在于肿瘤组织中，但是关于FGFR3在肿瘤组织中的表达知道的非常少。
近来，使用基因芯片技术对基因表达分析后，发现和正常组织相比FGFR3在膀胱肿瘤样品中过表达。
《抗体制备技术》课件
采用适当的免疫佐剂和免疫方式，如 使用特定的抗原组合、多次免疫和改 变免疫途径等，以提高免疫反应的效 果。
高亲和力抗体的制备挑战与解决方案
挑战
高亲和力抗体的制备需要经过多轮筛 选和优化，过程繁琐且效率低下。
解决方案
采用基因工程和细胞工程技术，通过 改造B淋巴细胞或使用噬菌体展示技 术等手段，快速筛选出高亲和力抗体 ，提高制备效率。
缺点是技术难度较高，需要专业的基因工程知识和技术。
噬菌体展示技术
01
噬菌体展示技术是一种 利用噬菌体展示抗体库 来筛选单克隆抗体的技
术。
02
该方法的优点是操作简 便、筛选效率高，可用 于制备治疗和诊断用的
单克隆抗体。
03
缺点是抗体库的构建需 要大量时间和精力，且 筛选到的抗体亲和力可
能较低。
蛋白质转导技术
数。
荧光共振能量转移（FRET）
03
通过荧光标记的抗体和抗原结合后荧光信号的变化，测定亲和
力。
抗体特异性鉴定
抗原竞争试验
免疫荧光染色
通过加入不同浓度的竞争性抗原，观 察抗体与抗原结合的变化，确定抗体 的特异性。
利用抗体与抗原的特异性结合，对细 胞或组织进行荧光染色，观察抗原的 表达和分布，确定抗体的特异性。
噬菌体展示技术
利用噬菌体展示技术筛选出能与目标抗原结合的抗体片段。
转基因抗体技术
通过基因工程技术将抗体的基因导入到宿主细胞中，表达并筛选 出具有所需特性的抗体。
抗体亲和力测定
酶联免疫吸附试验（ELISA）
01
通过检测抗体与抗原结合后的信号变化，计算出抗体的亲和力
常数。
表面等离子共振（SPR）
02
不规则抗体筛查及鉴定培训7.27
情况一：抗筛阳性反应强度不一，自身对照阴性
表型与抗体互相验证
情况二：抗筛全部呈阳性反应，反应强度大致相同， 自身对照阳性
情况二：抗筛全部呈阳性反应，反应强度大致相同， 自身对照阳性
3 抗筛阳性输血原则
抗筛阳性患者输血
确认只有不规则抗体
自身（-）、抗体筛选（+）
配血时患者血清中的同种抗体与供 者红细胞上相应抗原起反应。
P 血型 系统抗体
最常见的表型 ：P1、P2 P1 红细胞上有两种不同的 抗原：P1 和 P；P2 红细胞 上只有 P 抗原，可以产生 抗-P1。
不规则抗体种类（其他）
Lewis血型系统抗体： 多为IgM类，属自然产生的抗体，37℃一般不发生反应
Lutheran 血型系统抗体： LU抗原剂量效应，导致混合凝集、临床意义一般不大
结果判读：根据谱细胞的反应格局一般可以鉴定常见的抗体,但有 一定的局限性，有可能漏检常见的组合抗体
排除法：纯合子表达抗原无反应则直接排 除对应的抗体（举例：与5号细胞dCCee、11 号细胞DCCEe、12号细胞DCcEE反应均为阴性， 表明不存在单特异性抗-C）
情况一：抗筛阳性反应强度不一，自身对照阴性
操作:抗体鉴定谱细胞分别与被检血清进行间接抗球 蛋白试验，同时做自身对照
自身细胞检查：确定患者血清内是否有自身抗体或自身抗体与同 种抗体并存，只有是阴性时，才能排除自身抗体或其他凝集素导 致的谱细胞凝集；
使用试剂谱细胞：谱细胞一般是由8～16单人份的已知血型表型的O 型红细胞配套组成，具有各种不同的抗原成分；
聚凝胺介质法
1.红细胞上已有不完全抗体致敏
2.加入聚凝胺，缩短红细胞之间的距离，不完全 抗体同时与两个红细胞结合使其特异性凝集
EV71病毒特异性单克隆抗体的筛选
分类号：单位代码：10019密级：学号：TS040322硕士学位论文EV71病毒特异性单克隆抗体的筛选与鉴定研究Screening and Characterization of Monoclonal Antibody Specific to EV71 Virus研究生：李静指导教师：王宾教授申请学位门类级别：理学硕士专业名称：生理学研究方向：分子免疫学所在学院：生物学院二零零九年六月独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。
尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。
与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。
研究生签名：时间：年月日关于论文使用授权的说明本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。
同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。
(保密的学位论文在解密后应遵守此协议)研究生签名：时间：年月日导师签名：时间：年月日摘要手足口病（Hand foot mouth disease， HFMD）是由多种肠道病毒引起的一种常见急性传染病，多发生于5岁以下的婴幼儿，可引起发热和手足、口腔等部位的皮疹、溃疡，个别患者可引起心肌炎、肺水肿、无菌性脑膜脑炎等致命性并发症。
该病是全球性传染病，传染性强，易引起暴发或流行。
1997年以来，肠道病毒71型（Enterovirus 71， EV71）感染为主的手足口病在马来西亚、台湾、新加坡等地大规模爆发流行，引起世界各国关注和警惕。
EV71病毒为小RNA病毒科、肠道病毒属，分为A、B、C三基因型；VP1作为主要的衣壳蛋白，具有最多的型特异性中和位点，是主要的病毒中和决定因子，直接决定病毒的抗原性。
不规则抗体筛选和鉴定标准操作规程
不规则抗体筛选和鉴定标准操作规程1.检验目的不规则抗体筛选和鉴定可在交叉配合之前进行或一起进行，这样有利于患者抗体的早期确认及鉴定，发现临床上有意义的抗体，避免一些可能的情况而造成病情的延误。
2.检验方法分盐水介质法、抗球蛋白法和微柱凝胶法。
3.检验原理让待检者的血清与已知血型的试剂红细胞即筛选红细胞（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ套）起反应，以发现在37℃中有反应活性的抗体。
这种抗体可引起新生儿溶血病、溶血性输血反应、或使输入的红细胞存活期缩短等。
当不规则抗体筛选试验阳性后，再进行不规则抗体鉴定，即利用谱红细胞（11套鉴定细胞）与待检者的血清反应，根据反应结果判断机体所产生的同种抗体类别。
4.标本要求受检者不抗凝静脉血4.0ml，分离血清，48小时内使用5.试剂5.1.筛选红细胞：由2或3人份的O型红细胞组成为一套试剂，每套试剂筛选红细胞中至少有以下常见的抗原：D、C、E、c、e、M、N、S、s、P、Le a、Le b、K、k、Fy a、Fy b、Jk a、Jk b等。
每次用3套试剂（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ）进行抗体筛选，见表1005-1。
5.2.鉴定谱细胞：除包括常见的抗原以外还有：C w、Kp a、Kp b、Js a、Js b、Lu a、Lu b、Xr/min a等。
每次用11套试剂进行抗体鉴定，见表1005-2。
5.3.抗球蛋白试剂：多特异性抗球蛋白血清（IgG、C3d）。
5.4.致敏红细胞（质控细胞）。
5.5.0.9%生理盐水。
5.6.Coombs微柱凝胶卡。
6.器材试管、吸管、37℃水浴箱、台式离心机、滤纸、微量加样器等。
7.操作程序7.1.盐水介质法7.1.1．取受检者血清2滴于标记有Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的3支小试管中。
7.1.2．对应加入Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ套2%～5%筛选红细胞生理盐水悬液1滴，37℃孵育30分钟。
7.1.3.以3000r/min离心10秒，观察凝集和溶血情况，并记录反应情况于表1005-1中。
如果抗体筛选试验阳性，继续做以下试验。