植物细胞的微核检测技术-
植物染色体毒理实验 蚕豆根尖微核实验
蚕豆根尖微核实验摘要：本实验用洗发水诱导蚕豆根尖发生畸变，通过固定、酸解、，染色、压片、镜检等一系列过程观察蚕豆根尖细胞核及微核，通过微核的数量判断洗发水对人体毒害作用的大小。
由于产生的微核数量与外界诱变因子的强弱成正比，因此可用微核实验来评价各种诱变因子对生物遗传物质的影响程度。
关键词：蚕豆根尖微核卡诺固定液吉姆萨染液前言：随着相关研究人员的一系列实验表明：日常用品中的一些物质会对植物细胞尤其是分生组织细胞产生明显影响，它们会破坏细胞中的遗传物质——染色体，导致微核的产生，破坏细胞正常的生命活动。
微核（micronucleus,简称MCN），也叫卫星核，是真核类生物细胞中的一种异常结构，是染色体畸变在间期细胞中的一种表现形式。
在细胞间期，微核呈圆形或椭圆形，游离于主核之外，大小应在主核1/3以下，着色与主核一致或稍浅，呈圆形或椭圆形。
蚕豆根尖细胞的微核是由于根尖细胞在分裂时受到外界诱变因子作用，形成的不随细胞分裂进入细胞核的染色体片段。
以观察细胞中微核的形成来检测遗传毒物，称为微核实验。
利用蚕豆根尖作为实验材料进行微核测试，可准确的显示各种处理诱发畸变的效果，并可用于污染程度的监测。
目前微核测试已经广泛应用于辐射损伤、辐射防护、化学诱变剂、新药试验、染色体遗传疾病及癌症前期诊断等各方面。
1．材料1.1实验材料：蚕豆（根尖细胞的染色体大，DNA含量高，对诱变因子反应敏感）1.2实验药品：1mol/L盐酸、固定液（乙醇、冰醋酸3：1配制）、吉姆萨染液1.3实验用具：显微镜、镊子、载玻片、盖玻片、盆、纱布、烧杯、水浴锅等2．步骤2.1 浸种催芽将试验所用适量蚕豆放入盛水烧杯盆中，在室温下浸泡1d。
种子吸胀后，用温润纱布松散包裹蚕豆置盆中，保持温度催芽2d，此时根长出将近约1.5cm。
2.2 毒性处理选取根生长良好，根长一致的种子，分成两组，一组放入盛有被测洗发水的盆中，被测液浸没根尖即可。
另一组放入盛有自来水的盆中培养，做对照组。
利用植物微核技术探究环境污染状况的实验设计
利用植物微核技术探究环境污染状况的实验设计作者：靳慧娴汪久佳来源：《黑河教育》2010年第12期“探究水质污染程度与生物细胞微核率高低的关系”是苏教版生物必修2《遗传与进化》中的一个探究课题，上海《生命科学》教材高中试用本第3册中也有类似的实验。
中学阶段开设该实验可以让学生更好地理解环境因子对细胞变异的影响，并能紧密联系环境问题，具有现实意义。
但由于种种原因，目前在中学开展本实验的还很少。
本文针对该实验进行了初步探索，以期为中学开展该实验提供一些借鉴。
1.实验原理微核是指独立于细胞核外的圆形、椭圆形或无规则的小核，其直径小于细胞核的1/3，可以是染色体断片，也可以是整条染色体。
自然状态下，生物体产生微核的概率很小，在某些有害理化因素的影响下，微核的产生率会大大增加。
当这些有害因素损伤真核细胞的遗传物质时细胞核中的染色体会发生断裂时，这些染色体片段不能随有丝分裂进入子细胞，留在细胞质中，就构成了微核。
微核是常见的遗传毒理学指标之一，指示染色体或纺锤体的损伤。
由于这种损伤会因细胞受到的外界诱变因子作用的加剧而加剧，而微核产生的数量又可与诱变因子剂量的多少有关系，因此可用微核出现的频率来评价环境诱变因子对生物遗传物质的损伤程度。
通常计算微核数目的多少用微核千分率MCN(平均每千个细胞出现微核的细胞个数)来表示。
蚕豆根尖微核实验具有准确、快速、操作简便、有明显剂量一效应关系、适合大批量样品检测等优点，在环境监测中应用广泛。
2.实验材料微核实验通常使用蚕豆做实验材料，采用市售本地青皮豆。
实验选大小均匀、饱满、表面光滑的个体。
3.实验过程①蚕豆萌发。
蚕豆用24℃用自来水浸泡36小时，湿纱布包裹催芽36小时。
选已发芽的蚕豆放入垫有湿脱脂棉的培养皿中培养36小时。
其间每12小时用水冲洗1次，换水培养。
在发芽良好的种子中选择根长整齐一致，根长约1.5—2.0 cm的蚕豆随机分组。
②诱变剂配制。
用蒸馏水将四氯乙烯(污水中常见的一种持久性有机污染物)分别配制成0.1mg／L、1mg／L、10mg／L、100mg／L的溶液。
实验5蚕豆根尖细胞微核检测技术
微核试验的应用 微核试验广泛应用于药品、食品添加剂、农药、化妆品、工
业化学品、环境污染物等遗传毒性的检测、安全性评价和遗传 损害的监测,为接触有害物质人群提供遗传损害检测和工作环境 监测,为行政管理部门的决策、立法奠定理论依据。
环境物质监测和致突变物检测 化疗后的细胞学损伤观察 放疗的遗传学损伤分析 特定人群的突变损伤检测和早期预报 利用微核试验筛选抗癌物质 利用微核试验指示环境污染的程度
编辑课件
微核形成机理
化学毒性物质 染色体断裂剂 可诱发染色体发生断裂的遗传毒性物质。细胞
核的主要成分是染色体,在正常的情况下细胞分裂时染色体被 纺锤丝牵引平均分向细胞的二极,形成二个正常的核,被平均 分配给二个细胞。在染色体断裂剂如丝裂霉素存在下,染色体 发生断裂,并不发生重接或不在原处重接,则形成了无着丝粒 的段片,在细胞分裂后期不能向两极移动,而残留在细胞中央 的赤道板附近,当子细胞形成时则游离于细胞质中形成不含着 丝粒的微核 。
编辑课件
2）污染指数（pollution index)
污染指数（PI)=样品实测MN‰ 平均值/标准水MN‰ 平均值 PI在 0- 1.5 区间为基本无污染
1.5-2.0区间为轻度污染 2.0-3.5区间为中度污染 3.5以上为严重污染 注：1）对严重污染的水环境，监查处理时造成根尖死亡，应稀释 后再做测试； 2）如RT> 35℃，MN本底会增高，但可经污染指数数据处理， 不会影响监测结果。
一般认为微核是有丝分裂后期丧失着丝粒的染色体断片产生的。 这些断片或染色体在分裂过程中行动滞后，在分裂末期不能进入主 核，便形成了主核之外的核块。当子细胞进入下一次分裂间期时， 它们便浓缩成主核之外的小核，即形成了微核。微核率的多少与和 作用因子的剂量或辐射累积效应有正相关。
5-蚕豆根尖细胞微核检测技术
➢2个同学为1组，首先把观察镜调试好，一人负责 一个号，将亲本蝇在麻醉瓶中麻醉，在观察镜下辨 明雌雄，迅速转入平放于固定在实验台上的相应培 养瓶，待麻醉的果蝇苏醒后，再将瓶放正即可；
➢每组同学将果蝇的3间婚房放置于25℃温室中培养；
第5周已完成
果蝇生活周期
❖ 受精卵：白色，椭圆形，22-24 h 后即可孵化
5对接入新的培养瓶中继续培养； 1瓶正交观察后放飞窗外 2瓶反交观察后各选5/10对接入新的培养瓶中继续培养 ➢ 7天后，F2幼虫出现，倒出F1亲本果蝇； ➢ 7天后，麻醉、观察全部F2成虫性状。
思考与分析
❖1只雄果蝇1生中可以交配多少次 ❖1只雌果蝇1生中可以产卵多少枚 ❖影响果蝇产卵的因素，卵是否都可以正常发育 ❖您掌控的培养瓶里果蝇产卵的情况与对策
➢ 组合设计，在培养瓶上做好标记：
正交：野生型(+++) × 三隐性突变体（abc） 1瓶 解读：19#雌性（5头）与6#雄性（5头）共处一室，看能
发生什么故事? 反交：三隐性突变体（abc） × 野生型(+++) 2瓶 解读：6#雌性（5头）与19#雄性（5头）共处一室，看能
发生什么故事?
实验报告
蚕豆根尖微核观察统计表
微核数 细胞数 微千分率 平均微千分率 污染指数（PI） 处理组
对照组
样品实测MCN ‰平均值 污染指数(PI)=
对照组MCN ‰平均值
思考
❖微核检测的意义 ❖微核产生的影响因素与处理设计 ❖为何要用植物根尖分生区进行检测
学学期期实实验验安安排排
遗传学实验课
F1幼虫观察，释放伴性遗传及三点试验亲本 蚕豆根尖细胞微核检测技术 第6周
授课老师：黄文超
紫露草微核试验
紫露草
术语解释
微核:细胞的染色体发生断裂后,细胞进入下一次分裂时,染
色体片段不能随有丝分裂进入子细胞,而在细胞质中形成 直径小于主核的,嗜色与主核一致,完全与主核分开的圆形 或椭圆形核。
花序: 大多数植物的花，密集或稀疏地按一定排列顺序，
着生在特殊的总花柄上。花在总花柄上有规律的排列方式 称为花序。
处理、恢复培养 、固定及保存
将过滤后的各采样点水样盛入500ml烧瓶中并编号。烧 杯上蒙以带孔的塑料薄膜或盖上带孔的薄塑料板，每个处 理组和对照组各插入15个花枝，对照组用自来水，在人工 光照下连续处理6h。每种水中至少应设两个平行处理组， 对于非水溶性物质，可先用二甲基亚砜溶解，经自来水稀 释后在进行处理，同时要做二甲基亚砜的对照试验。处理 到指定时间，将水样倒掉，换上自来水，在人工光照下做 连续24-30h的恢复培养，除掉叶子和花梗，把花序放入新 配制的卡诺氏液中固定24h，再将花序移入70%酒精中， 即可制片观察。也可将固定后的花序置于3-5oC长期保存， 但每月需更换70%酒精一次
压片及微核观察
一个花序愈是上部的花蕾年龄越老。选择一个适龄的 花蕾（一般在中下部），用解剖刀把花蕾从中间劈成两部 分，用解剖针或尖镊子打开花蕾，剥出花药，滴一滴醋酸 洋红，并稍加压挤，置100倍显微镜下观察，若绝大部分 是早期四倍体，则充分捣碎花药，让更多四倍体释放出 来，并加一滴醋酸洋红（经显微镜观察染色颜色过深可滴 加1-2滴45%的冰醋酸），弃去载玻片上无关杂质，小心 盖上盖玻片，置酒精灯火上来回3-4次微热（不要让染液 煮沸冒泡），然后趁热把玻片放在几层吸水纸下，用大拇 指压挤盖玻片，取出后置250倍显微镜下观察计数,随机统 计四分体和微核数，每个处理组和对照组至少观察五张叶 子，统计1500个四分体。
实验八 植物微核检测技术23页PPT文档
以染色体为指标的“三致效应”的检测方 法：
1. 经典的染色体畸变分析方法； 2. 姐妹染色单体互换测试法； 3. 微核测试法。
（1）断片 （2）双着丝点 （3）环
微核率与用药剂量或辐射积累效应呈正相关。
实验材料：
毛葱（Allium fistulosum）根尖。
实验器材：
显微镜，冰箱，水浴锅，分析天平，剪刀，镊子， 刀片，载玻片，盖玻片，滤纸，量筒，滴瓶，酒精 灯，指管等。
试剂
1. 环磷酰胺（CP） 2. 卡诺氏（Carnoy‘s）固定液 3. 希夫（Schiff‘s）试剂 4. 45%醋酸 5. 1 mol/L盐酸
微核检测记录表
细胞数
微核数
微核千分率
作业和思考题：
1. 叙述微核形成原理。 2. 统计微核细胞数，计算微核细胞千分率。 3. 画出具有微核的细胞示意图。
注意事项：
1. 处在分裂过程中的细胞对不同理化因素的 敏感时期和敏感剂量是不同的，需要进行 试验摸索。
2. 观察与识别微核要准确，统计细胞数至少 1000个/3张片。
4. 镜检及观察，检查400个细胞/片。
结果及分析：
1. 细胞学观察：
在细胞分裂间期，微核 呈圆形或椭圆形，游离 于主核之外，大小在主 核的1/3以下，折光率 及细胞化学反应性质和 主核一样。
毛葱根尖微核
2. 微核率计算
微核率（MCN%o）=
微核数 细胞数
×1000%o
片号 第1片 第2片 第3片 总计
环境因素造成的遗传毒理效应： “三致效应”
植物根尖微核检测技术
• （6）染色：吸去盐酸，用蒸馏水浸没幼根三次， 每次1～2分钟。最后浸于水中。于载玻片上，截下 1～2mm左右长的根尖，滴一滴醋酸洋红染液，染 色5～8分钟，加盖玻片，压片观察。 • （7）观察与计算：首先在显微镜低倍镜下找到分 生组织区细胞分散均匀，分裂相较多的部位，再转 高倍镜观察。微核大小在主核1/3以下，并与主核分 离，着色与主核一致或稍浅，呈圆形或椭圆形。每 一处理观察3个根尖，每个根尖数1000个细胞，统 计其中含微核的细胞数，然后计算平均数，即为该 处理的MCN%，即微核千分率，以此可作一个检测 指标。
应用举例
• 评估污水处理厂污水处理效率：对污水处 理前后的微核千分率进行比较，可有效指 示污水处理效果。 • 对化妆品致突变作用的检测：嵇庆等 （1994）用蚕豆根尖微核法检测了10种脂 溶性面霜的致突变性，结果其中的3种有致 突变作用。
实验材料
• 松滋青皮豆或洋葱
器具和药品
• 显微镜、镊子、载玻片、盖玻片、烧杯、 瓷盘。6mol/L盐酸、甲醇、冰醋酸、醋酸洋 红、CrO3、NaN3、EMS。
实验目的
• 了解微核测试的原理和毒理遗传学在实际生活与 工作中的应用范围及意义 • 学习根尖的微核测试技术
实验原理
• 微核简称(MCN)，也叫卫星核， 是真核生物细胞中的一种异常 ，也叫卫星核， 微核简称 结构，也是染色体畸变在间期细胞中的一种表现形式，往往是细胞经 结构，也是染色体畸变在间期细胞中的一种表现形式，往往是细胞经 形式 辐射或化学药物的作用而产生。在细胞间期微核呈圆形或椭圆形， 辐射或化学药物的作用而产生。在细胞间期微核呈圆形或椭圆形，游 离于主核之外、大小应在主核 ／ 以下 以下。 离于主核之外、大小应在主核1／3以下。微核是由有丝分裂后期丧失 着丝粒的断片产生的， 着丝粒的断片产生的，但有些实验也证明整条的染色体或多条染色体 也能形成微核。 也能形成微核。这些断片或染色体在细胞分裂末期被两个子细胞核所 排斥便形成了第三个核块。 已经证实微核率的大小是和用药的剂量或 排斥便形成了第三个核块。 辐射累积效应呈正相关。 目前微核测试已经广泛应用于辐射损伤、 辐射累积效应呈正相关。 目前微核测试已经广泛应用于辐射损伤、辐 相关 射防护、化学诱变剂、新药试验、 射防护、化学诱变剂、新药试验、染色体遗传疾病及癌症前期诊断等 各方面 各方面。
微核技术在环境监测中的应用概况
240理论研究0 引言 现阶段，微核技术主要应用于药物筛选、肿瘤防治和环境检测等多种领域，其应用范围较广。
无论是国内还是国外诸多国家和机构，已将微核技术作为一种诱变试验的标准检测方法。
1 微核检测技术概述 微核检测技术是一项实用而有效的试验技术，主要应用于环境检测领域，无论是国内还是国外，将微核检测技术作为检测水环境生物的标准性方法。
除此之外，还可以将其应用于水体的致突变性检测领域。
所谓微核是指生物遭受环境因素的影响之后，其染色体结构会逐渐发生改变，形状和颜色都会随之发生变化。
细胞分裂后期，无着丝粒断片或滞后染色体不能向细胞的两极运动，而是残留在细胞中央的赤道板附近。
微核可以检测环境的污染程度，其测量单位为频率。
微核技术主要应用于细胞水平上的遗传毒性研究和微核进行环境污染检测这两方面。
前者主要是通过微核试验展开药物分析与研究，主要成果应用于医学领域。
后者主要是采用植物微核技术检测环境的污染程度，所用的材料主要包括紫露草、蚕豆、洋葱等。
2 微核技术在环境检测中的应用2.1 紫露草四分体微核技术 美国科学家以紫露草作为原料，借助特殊工具处理致癌物质之后，可以观察到乙烷气体处理之后会诱发小孢子。
这是产生微核的主要过程。
依据实验结果表明，微核数量的多少与乙烷气体的浓度息息相关，且呈正相关关系。
这就初步验证了紫露草微核检测系统的功能与作用。
表明该技术可用于室内空气质量的检测。
随着科学技术的不断进步，微核技术逐渐被应用于环境检测领域，用于检测水分的污染频率。
2.2 蚕豆根尖微核技术 该技术建立在紫露草分体微核技术基础之上，属于一种生物短期检测方法，是国内国外应用较为普遍的一种环境检测模式。
该技术被提出之前，不少科学家将其拥有检测X-射线、丝裂霉素C等，用于检测淡水污染诱变剂损伤的微核效应，从而建立了诱变剂检测系统。
该系统能够快速获取相关遗传信息，对致突变物的敏感度较高，可直接用于水污染的检测。
相较于紫露草四分体微核技术而言，该技术具有以下优势：其一，实验周期短。
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设计性实验
化生院生物科学教研室
一、实验目的
•1、了解细胞微核形成的机理及其形态特点；•2、学习植物根尖细胞的微核检测技术。
•3、小组合作，掌握设计实验的基本能力。
二、实验原理
•微核(micronuclei)简称MCN，是真核类生物细胞中的一种异常结构，往往是细胞经辐射或化学药物的作用而产生的。
在细胞间期，微核呈圆形或椭圆形，游离于主核之外，大小应在主核1/3以下。
微核的折光率及细胞化学反应性质和主核一样，也具合成DNA的能力。
•一般认为微核是由有丝分裂后期丧失着丝粒的染色体断片产生的，在有丝分裂后期不能向两极移动，所以游离于细胞质中，在间期细胞核形成时，即可在它附近看到一到几个很小的圆形结构，直径大约是细胞直径的1/20 ~1/5，这就是微核。
•微核率的大小是和用药的剂量或辐射累积效应呈正相关，因此，微核是常用的遗传毒理学指标之一，指示染色体或纺锤体的损伤。
微核测试已用于辐射损伤、辐射防护、化学诱变剂、新药试验、染色体遗传疾病及癌症前期诊断等各方面。
三、实验材料：
大蒜、大豆、蚕豆等。
四、实验仪器设备：
显微镜、恒温培养箱、恒温水浴锅、镊子、
载玻片及盖玻片。
五、实验步骤：
1、幼根的培养：提前3~5天进行培养，将大蒜瓣剥去外边膜
质枯皮，下端可见许多微微凸起的根原体，将蒜瓣架在烧杯（大小与蒜瓣适宜）口上，杯中盛满清水，使蒜瓣的下部浸入水中，置培养箱中，注意每天换水，经3~5天后，即可长出1-2cm的嫩根。
2、处理根尖：阳性检测采用1.0~2.5M CrO3，0.5~
1.5M NaN3，150250mM EMS，对照用自来水处理，
处理时间24h。
3、恢复培养：处理后的根尖用自来水浸洗3次，每次
2-3min，洗净后在水中恢复培养24h。
4、固定：用甲醛：冰醋酸（3：1）固定液固定24h后弃去
固定液，或换入70％酒精中保存。
5、酸解：弃去固定液，用清水漂洗2-3次，吸净水，加入6M盐酸，于室温解离10min，弃去盐酸，漂洗根尖2-3次，彻底洗净盐酸。
6、染色：截下1-2mm长的根尖，滴加石炭酸品红染液，染色10min，加盖玻片，压片观察。
•固定是借助于物理方法或化学药剂的作用，迅速透入组织和细胞将之杀死，并且使其结构和内含物如：蛋白质，脂肪，糖类以及核物质与细胞器等，在形态结构上尽可能保持生活时的完整和真实状态，同时更易于染色，可以较清楚的显现细胞在生活时不易看清的结构。
•酸解的作用是去除未固定的蛋白质, 同时使胞间层的果胶类物质解体，细胞分散而易于观察。
六、实验结果
1、首先在低倍镜中找到分生组织区细胞分散均匀，分裂相
较多的部位，再转高倍镜观察，找到微核。
2、微核识别标准：
（1）在主核大小的1/3以下，并与主核分离的小核。
（2）小核着色与主核相当或稍浅。
（3）小核形态为圆形、椭圆形或不规则型。
3、每一处理观察3个根尖，每个根尖计数100个细胞，统计
其中含微核的细胞数，计算平均数，即为该处理的
MCN‰，即微核千分率。
样品实测MCN‰平均值污染指标（PI）=
对照组（标准水）MCN‰平均值
微核微核
七、思考题
•1、在植物细胞的微核检测实验中，为什么要进行24h的恢复培养？
•2、产生微核的根尖细胞在产生前的分裂中期可能出现什么样的中期分裂图像？
八、基本要求
➢成立探究小组（7-8人）。
➢查阅资料，确定方案。
➢分工协作，实施方案。
培养材料处理材料微核统计结论分析汇报小结。
➢完成实验报告。