急性经口毒性实验
001_经口急性毒性试验方法_改良寇氏法
急 性 毒 性 试 验 方 法――改良寇氏法Kärber 法由Kärber 于1931提出，后经Finney 改进，顾汉颐作过改进，1963年孙瑞元教授对该法进一步改进，改进后的计算方法称为点斜法或孙氏法，增加了不含0%和100%死亡率的校正式，所得LD 50及全部有关参数与正规概率单位法相近。
改良寇氏法（Käber）试验设计的原则是：各组剂量按等比级数；各组动物数相等：大致有一半组数的动物死亡率在10%～50%之间，另一半在50%～100%之间，最好出现0 %和100 %的剂量组。
一、剂量选择及分组1、剂量选择剂量设计是否合理是急性毒性试验能否成功的关键。
探求外源化学物的急性毒性，测定其LD 50或LC 50时，应首先广泛查阅文献资料，了解该化学物的化学结构和理化性质，如结构式、分子量、溶解度、挥发度、纯度及杂质含量等，其次确定测定LD 50的计算方法，然后设计剂量。
2、预试验：总的原则是先用少量动物，以较大的剂量间距染毒，求出粗略的致死剂量范围，即确定受试动物全部致死的最小剂量（b ）和全部不致死的最大剂量（a ），即求出待测化学物0 %~100 %的大致致死剂量范围，然后在这个剂量范围内按几何级数的间距设计5~7个剂量组，组间剂量呈等比级数（r ），其比值为1.2~1.5。
进行正式实验。
用于急性毒性试验时，动物的体重为：大鼠180~200g ，小鼠18~22g ，豚鼠200~250ｇ，家兔2~2.5kg ，犬10~12 kg 。
用于实验的同一批动物体重变异范围不得超过所用动物平均体重的20%。
仍然遵守雌雄各半或雌雄兼取的原则。
当预试中发现化学物的毒性有明显的性别差异时，则需要选用雌、雄两种性别的动物分别进行试验，求出各自的LD 50。
通过预试，找出受试化学物引起动物死亡的大致剂量范围，以此为依据设计正式试验的剂量和分组。
按下式设计剂量组：1n abr -= 式中：r —相邻两组剂量的比值，一般为1.2～1.5，b —最低全致死剂量量， a —最高不致死剂量， n —设计的组数。
《动物毒理实验》课件：实验一 小鼠经口急性毒性试验
四、实验步骤
1. 剂量选择： 查阅文献，估计预期毒性中值；
预试验，求出受试化学物的0～100%或 10～90%大致致死范围，设计正式试验的剂 量和分组。
体重增加：低水平的化学毒物促进动物 生长，动物体重增长率大于对照组。
观察指标（3）
死亡数和死亡时间 十分重要的中毒机理研究信息；重
点观察和记录各个剂量组动物的死亡数； 每只动物死亡的时间（尤其是最早出现 死亡的时间）。
观察指标（4）
病理学检查及其他指标
及时剖检：对死亡动物的主要脏器进行肉眼观察， 重点检查主要脏器的大小、外观、色泽、有无充血、 出血、水肿等；
（2） 配制方法的选择：等浓度稀释法和等 容量稀释法。
等浓度稀释法：将受试化学物配制成一 种浓度，不同剂量组实验动物单位体重所给 受试化学物的体积不同，剂量越高，所用的 体积越大；剂量越低，所用的体积越小。
等容量稀释法
将受试化学物配制成不同浓度，不同剂量 组实验动物单位体重所给受试化学物的体 积相同，剂量越大，受试化学物配制的浓 度越高。
为避免操作误差，等容量稀释的传统方法 常用1︰K系列稀释法（K=各组剂量比值）。
根据实验设计要求确定最高剂量组所需受 试化学物的浓度和总体积，配制母液。
（3）等容量稀释法配制6个剂量组的染毒溶液
➢ 求母液浓度C1 绝对致死剂量为2500mg/kg，最低中毒剂
量为800mg/kg，每10g体重小鼠灌胃0.2mL C1=2500mg/kg×10g/0.2mL＝125mg/mL ➢ 求公比r
OECD急性经口
定动物的生死后再进行下一步试验。有3种可能的结局：
(1)不需进一步试验即可分级； (2)下一步试验降低一个剂量进行； (3)下一步试验以相同剂量再做3只动物，根据后者来决定是终止，升高一档，或降低一
档剂量。
无资料可查，从300 mg/kg体重开始。
限量试验：用于已知毒性很小或没有什么毒性的化学物。
420 固定剂量法（FIXED DOSE PROCEDURE) 423 急性毒性分级试验法 (ACUTE TOXIC CLASS METHOD） 425 上-下剂量法（UP-AND-DOWN PROCEDURE)
官网链接：/environment/oecd-guidelines-for-thetesting-of-chemicals-section-4-health-effects_20745788
3种方法都使用单一性别动物(推荐采用雌性动物，因为一般情况下雌性更敏感)。 3种方法均分阶段进行，耗时长是共同的缺点，节省动物是共同的优点。
(1)2000 mg/kg剂量，先用1只动物，不死亡，再顺序做4只动物(共5只)。有3只动物存活，实验 结束，LD50>2 000 mg/kg；3只动物死亡，限量试验终止，开展正式试验。 (2)5000 mg/kg剂量 (除非有特殊管理要求，一般不推荐做)。先用1只动物，死亡，限量试验终
止，LD50<5 000 mg/kg，做正式试验。不死，再做2只动物，3只动物均存活，实验结束，
LD50>5 000 mg/kg；后2只动物有死亡，再顺序做2只(共5只)，有3只动物存活，LD50>5 000 mg/kg；3只动物死亡，LD50<5 000 mg/kg
每次用1只动物序贯进行，观察48 h，不死亡，下一只提高一档剂量，死亡，就降一
经口急性毒性试验.
大小鼠标记方法（单色法n>10）
双 色 法
大小鼠标记方法（双色法n<10）
红色表示十位数： 头部染红色为10
左前肢为20
左腰部为30 黄色表示个位数。 大小鼠标记方法（双色法n>10）
其它标记方法
烙印编号法：
体内埋号编号法：
耳孔编号法：
挂牌编号法：
实验动物的随机分组
表1 动物随机分组表 动物号 随机数字 除6余数 分组 动物号 随机数字 除6余数 分组 1 97 1 A 16 27 3 C 2 74 2 B 17 7 1 A 3 24 0 F 18 36 0 F 4 67 1 A 19 7 1 A 5 62 2 B 20 51 3 C 6 42 0 F 21 24 0 F 7 81 3 C 22 51 3 C 8 14 2 B 23 79 1 A 9 57 3 C 24 89 5 E 10 26 2 B 25 73 1 A 11 42 0 F 26 16 4 D 12 53 5 E 27 76 4 D 13 32 2 B 28 62 2 B 14 37 1 A 29 27 3 C 15 32 2 B 30 66 0 F
组 别 A B C D 1 2 7 26 4 5 9 27 14 8 16 鼠 号 17 10 20 19 13 22 23 15 29 25 28
E
F
12
3
24
6 11 18 21 30
具体方法如下：继续抄下随机数字分别除以A、B、C、F组的现有动物数，即： 56/7(7为A组现动物数)整除，余数为0，将A组第7只动物(25号)调配给D组；下一 个：50/6(6为A组现有动物数)余2，将A组第2只动物(4号)调配给D组；接下来 26/6(6为C组现有动物数)余2，将C组第2只动物(9号)给D组。余类推，最后调整
实验二 经口急性毒性LD50测定
实验二经口急性毒性LD50测定实验二经口急性毒性LD50测定一、试验目的1. 熟悉急性毒性LD50测定的剂量设计2. 掌握小鼠灌胃技术3. 掌握改进寇氏法计算LD50的方法二、试验原理选择健康的实验动物，依据LD50计算的设计原则，将实验动物随机分成数个染毒组和一个阴性对照组。
一次或24小时内多次给予实验组受试物后，观察动物所产生的急性毒性反应及其严重程度，中毒死亡的特征以及可能的死亡原因。
根据受试物毒性反应与剂量的关系，求出半数致死剂量(LD50)，并根据LD50值将受试物进行急性毒性分级。
三、材料和试剂1. 实验动物:健康成年小鼠60只，雌雄各半2. 器材:灌胃针(小鼠适用)、注射器、吸管、容量瓶、烧杯、滴管、分析天平、台秤、外科手术剪、镊子3. 受试物:(敌百虫或克佰威)4. 染色剂:苦味酸酒精饱和溶液、0.5%品红溶液四、实验内容1. 实验动物称重、编号和随机分组2. 染毒剂量设计及试剂配制3. 小鼠灌胃染毒技术4. 毒性反应的观察及LD50计算五、试验方法(一)预实验1. 探索剂量范围先找出100%与0%的致死量(或阳性反应的剂量)为实验的上、下限剂量(Dmax和Dmin)。
据经验或文献定出一个估计量，取动物若干，每4只一组，按估计量给药，如出现4/4死亡时，下一组剂量降低，当出现3/4死亡时，则上一剂量为Dmax;如降低一档剂量出现的死亡率2/4或1/4时，应考虑到4/4死亡剂量组在正式实验时可能出现死亡率低于70%，为慎重起见可将4/4死亡剂量乘以1.4倍，作为Dmax。
以次类推，找出Dmin。
2. 剂量分组一般染毒组数(G)以5-8组为宜，组间剂量比值为r。
在确定组数后，按下列公式计算r。
1/(G-1)r = (Dmax/Dmin) 3. 受试物溶液的配制配制等比浓度的敌百虫溶液，并使每只动物在给药容量上相等(如0.5ml/20g)。
剂量按等比级数增减，相邻两剂量比值1:0.6,0.9，设5个剂量组。
《动物毒理实验》课件：实验一 小鼠经口急性毒性试验
根据实验设计要求确定最高剂量组所需受 试化学物的浓度和总体积，配制母液。
（3）等容量稀释法配制6个剂量组的染毒溶液
➢ 求母液浓度C1 绝对致死剂量为2500mg/kg，最低中毒剂
量为800mg/kg，每10g体重小鼠灌胃0.2mL C1=2500mg/kg×10g/0.2mL＝125mg/mL ➢ 求公比r
三、实验试剂和材料
1. 药物与试剂 盐酸二甲硝咪唑、苦味酸酒精 饱和溶液和中性红溶液、记号笔
2. 设备与器械 吸管、烧杯、灌胃器、电子天 平（感量0.1 g）、外科手术剪、5 mL注射器、 10 mL注射器、干棉球 3. 实验动物 成年健康小鼠，18-22g，雌雄 各半
四、实验步骤
1. 剂量选择： 查阅文献，估计预期毒性中值；
式中，K：各组剂量的比值，K＝1/r。 取母液m mL置一容器中，供最高剂量组染毒用；加入
m mL溶剂，稀释后的浓度为C2，C1︰C2＝1︰K，取出 m mL供第二组动物染毒用；再加入m mL溶剂，稀释后的 浓度为C3，C2︰C3＝1︰K，取出m mL供第三组动物染 毒用。依次类推，配制其它不同剂量组的试液。
可能的中毒表现： 兴奋，活动增加、骚动、窜跑、跳跃、呼吸加深加快； 抑制，活动减少、呆立、静卧、步态不稳、呼吸困难等； 刺激症状：搔鼻、尖叫、出汗、流涎、眼耳鼻等的出血。
观察指标（2）
体重 观察期间的体重变化可以反映动物中毒
后的整体变化，应3-5天测量一次； 体重减轻：可能是动物食欲下降、摄食
量减少；也可能是化合物干扰代谢系统，影 响食物吸收、利用；
（1） 动物的禁食和复食：灌胃前禁食6～10h，使 动物保持空腹状态，且不至因禁食时间过长影响肝 脏，进而影响实验结果。灌胃后至少2～3h后才能 复食，灌服油剂比水剂要求复食时间更长； （2） 灌胃体积：小鼠每10g体重灌胃0.1～0.2mL， 最多不超过0.4mL。小鼠灌胃量的极限是0.5～1mL； （3） 灌胃方法和注意事项。
经口急性毒性试验
经口急性毒性试验经口急性毒性试验是一种广泛使用的实验室动物毒性试验，它通常用于评价新化合物、生物制品等物质的毒性，以及评估安全使用剂量的潜在结果。
这篇文章将介绍经口急性毒性试验的背景、方法、注意事项和限制。
背景方法经口急性毒性试验通常使用小鼠、大鼠、兔子或其他哺乳动物，动物必须年龄相似、体重相当且健康状态良好。
实验中使用不同剂量的测试物质来确定它们在动物体内的毒性。
通常，实验中使用的剂量量较低，但有时也会使用较高的剂量以便观察更加严重的毒性反应。
其实验流程如下：1.选取合适且健康的实验动物，检查其体内和体外健康状况；2.确定实验剂量，并将物质以食物、水、灌胃管等方式交予动物口服；3.观察动物的外观、行为和症状，记录观察结果；4.在一定时间后继续观察动物，在必要时应用适当的护理；5.按照实验协议的规则处理动物，以确保其安全。
注意事项在进行经口急性毒性试验时，需要注意以下几点：1.确定剂量：需要选择适当的实验剂量，以确保所测试的物质不会对动物造成过度毒性反应，且可以解释毒性的分级。
2.采取恰当的动物保护措施：对于实验过程可能造成疼痛或不适的情况，应采取适当的保护措施，例如提供充足的饮水、合适的饲料和温度环境。
3.保证实验数据质量：为了确保实验数据质量，需要在实验过程中跟踪记录、分析数据，并确定实验的有效性以及物质毒性分级的准确性。
限制虽然经口急性毒性试验是一种有效的毒性评估方法，但它有一定的局限性。
经口急性毒性试验只能评估物质对动物的急性毒性反应，而对于慢性毒性、免疫毒性或生殖毒性等长期影响，它并不能提供完整的信息。
此外，每种动物特征不同，对物质的敏感程度也会不同，因此难以将实验结果适用于不同品种的动物和不同的物质评估。
因此，除经口急性毒性试验外，还需要完善其他的毒性评估方法以更准确地评估药物、化学物质和其他物质的毒性。
(整理)经口毒性实验
急性经口毒性试验Acute Oral Toxicity Test1 范围本方法规定了动物急性经口毒性试验的基本原则、技术和要求。
本方法适用于评价化学品的急性毒性作用。
2 规范性引用文件OECD Guideline for Testing of Chemicals (No. 401. Feb. 1987 ) OECD Guideline for Testing of Chemicals (No. 425. Feb. 2001 ) USEPA OPPTIS Health Effects Guideline (Series 870.1100 June 1996)3 试验目的3.1 检测化学品对实验动物的急性毒性作用和强度。
3.2 为亚急(慢)性等毒性试验提供剂量选择的依据。
3.3 试验结果可作为化学品急性毒性分级和标签标识。
４定义4.1 急性经口毒性(Acute Oral Toxicity): 一次或在24h内多次经口给予实验动物受试样品后，动物在短期内出现的健康损害效应。
4.2 经口半数致死剂量（Oral Median Lethal Dose）: 经口一次或24h内多次经口给予受试样品后，引起实验动物总体中半数死亡的毒物的统计学剂量。
以单位体重接受受试样品的质量(mg/kg bw或g/kg bw)来表示。
4.3 剂量-反应关系(Dose-response Relationship)：表示化学毒物的剂量与某一群体中质效应的发生率之间的关系。
5 试验基本原则以经口灌胃法给予各试验组动物不同剂量的受试样品，每组用一个剂量，染毒剂量的选择可通过预试验确定。
染毒后观察动物的毒性反应和死亡情况。
试验期间死亡的动物要进行尸检，试验结束时仍存活的动物要处死并进行大体解剖。
本方法主要适用于啮齿类动物的研究，但也可用于非啮齿类动物的研究。
6 试验方法6.1 受试样品的处理受试样品应溶解或悬浮于适宜的赋形剂中，（不溶性固体或颗粒状物质研磨、过100目筛）建议首选水或食用植物油（如玉米油）作溶剂，也可考虑使用其它赋形剂（如羧甲基纤维素、明胶、淀粉等）等配成混悬液；不能配制成混悬液时，可配制成其它形式(如糊状物等)，但不能采用具有明显毒性的有机化学溶剂。
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80mg/kg) i-----为相邻两组剂量比值（以高剂量组为分子）的对数
(i=log(125/100)) y-----为死亡率相应的机率单位（查附表）
y y---为五个剂量组的死亡率相应的机率单位的均数。 5
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五、注意事项：
1.灌胃时操作要避免损伤食道或误入气管 2.正确捉拿动物，防止被咬伤且避免动物损
伤 3.灌入量计算和操作要准确，否则影响结果 4.防止操作者中毒。注意通风，不要把药品
各剂量组小鼠染毒剂量:
小鼠染毒剂量= V ml ×各组的受试物浓度（mg/10ml)
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（四）灌胃方法：
小鼠灌胃法：左手拇指和食指捏住小鼠头部两耳后 皮肤，无名指或小指将尾部紧压在手上，使小鼠腹 部向上，尽量使其体位垂直，注意使动物的上消化 道固定成一直线。右手持连着灌胃导针的注射器， 将灌胃针由动物口腔侧插入，避牙齿，沿咽后壁缓 缓滑人食管。若遇阻力，可轻轻上下滑动探索，一 旦感觉阻力消失，即深人至胃部，一般进针深度小 鼠2.5～4cm，随后将受试物溶液注入。如遇动物 挣扎，应停止进针或将针拔出，千万不能强行插入， 以免穿破食管，甚至误入气管，导致动物立即死亡。
小鼠一次灌胃体积为10-20ml/kg
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（五）中毒体征和死亡情况观察
染毒后观察和记录中毒体征及出现的时间、死 亡数量和时间及死亡前的特征。
高剂量组动物的死亡常很快发生，染毒后应即 刻密切观察。
根据观察情况分析中毒特点和毒作用靶器官。
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观察的项目包括：
（1）中枢神经系统和神经肌肉系统：体位异常、叫声异常、 不安、呆滞、痉挛、抽搐麻痹、运动失调、对外反应过敏 或迟钝；整理ຫໍສະໝຸດ pt4（二）剂量选择：
首先查阅与受试化学物结构及理化性质相近似 的化学物的LD50，以此值作为受试化学物的预 期毒性中值，即中间剂量组，再上下各推1-2 个剂量组，进行预实验。
各剂量组的间距可根据LD50 计算方法要求按等 比级数或等差级数安排。
本实验用机率单位法计算LD50，要求按等比级 数排列，常用1：0.8，如敌敌畏的最高剂量为 125 mg/kg，其次剂量组为125 mg/kg *0.8=100 mg/kg ，依次类推为80 、64 和51.2 mg/kg五个剂量组。
（2）植物神经系统：瞳孔扩大或缩小、流涎或流泪； （3）呼吸系统：鼻孔流液、鼻翼煽动、血性分泌物、呼吸
深缓、呼吸过速、仰头呼吸、； （4）泌尿生殖系统：会阴部污秽、有分泌物、阴道或乳房
肿胀； （5）皮肤和毛：皮肤充血、紫绀、被毛蓬松、污秽； （6）眼：眼球突出、结膜充血、角膜浑浊、血性分泌物； （7）消化系统：腹泻、厌食。
例如本次实验五个剂量组: 各剂量组动物给予相同单位体重体积受试物均为 10ml/kg。
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等容量稀释法
D：设计的染毒剂量， mg/kg V：动物给药量（相同单位体重体积）均为
10ml/kg X：各组需配制的受试物溶液的浓度（mg/ml）
，
X D V
如：第一组染毒剂量D=51.2mg/kg，动物按 V= 10ml/kg体重给药，配制的受试物浓度为 X=51.2mg/10ml
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（一）实验动物与分组：
首选健康成年小鼠(18g～25g)和大鼠 (180g～220g) 。
实验前动物要在实验环境中适应3～5 d 时 间，以了解其正常活动情况和健康状况，并 淘汰不健康或体重不符合要求的动物 。
本次实验取体重18-25 g 的小鼠，实验时， 将小鼠称体重、编号、按随机分组原则，将 实验动物分成5组，每组8只。
50(5.0-y)2[2(5y-y1)(y4-y2)2] W
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四、结果评价：
根据实验动物中毒体征、死亡时间、根据得 出的LD50及受试物的种类，按相应的国家 标准或技术规范中的急性经口毒性分级标准 （课本 215页--农药的急性毒性分级）对 受试物进行毒性定级，判断受试物的毒性大 小。
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依次类推：五个组所需配制的受试物浓度分别为
第一组：51.2mg/10ml 第二组： 64mg/10ml 第三组： 80mg/10ml 第四组： 100mg/10ml 第五组： 125mg/10ml
各剂量组小鼠灌胃容量计算:
小鼠灌胃容量V ml=体重（g）×10ml/1000g
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（三）受试化学物配制与稀释
1. 溶剂：
水溶性受试化学物以蒸馏水为溶剂配制成溶 液。
脂溶性受试化学物以吐温-80、二甲基亚砜、 植物油等配制。
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（三）受试化学物配制与稀释
2. 受试物的稀释
等容量稀释法，各个剂量组的动物均给予相同单位 体重体积的受试化学物，按照事先设计的剂量分别 稀释配制为几种不同的浓度的受试物溶液。
急性经口毒性实验 （Acute Oral Toxicity Test）
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一、实验目的：
（一）通过本次实验掌握经口灌胃技术，半 数致死剂量的意义。
（二）通过本次实验学习半数致死剂量的计 算及毒性判定。
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二、测定方法：
本实验以灌胃方式测定敌敌畏DDV （80g/100ml）的半数致死量 （LD50）。
1、2、3、4、5…为小剂量组到大剂量组的顺序。 5.0----为死亡率是50%时所相当的反应率的机率单位
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LD50的95%可信限=log-1(X + 1.96 SX )
X[2(51-yy 0 i(15 ). 0(y y 4)-y2)]X3
Sx[2(5-yy1)10i(y4-y2)2]
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三、LD50 计算：
可采用多种方法测定LD50，有机率单位法、 霍恩氏法、寇氏法等，机率单位法能计算出 任何反应率水平的剂量，且实验2-5组均可。
机率单位法遵守的要求：
1. 剂量按等比级数排列，相邻两剂量组间 的比值常用1：0.8
2. 各实验组动物数相等
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L5D 0 lo 1[g 2(5 1-y y i(0 1 5 ). 0(y 4 y)-y2)X3]