哺乳动物细胞培养制备重组蛋白质药物研究进展
cho细胞重组蛋白原理
cho细胞重组蛋白原理
CHO细胞重组蛋白的原理涉及到CHO细胞的特性以及重组蛋白的生产过程。
首先，CHO细胞是一种哺乳动物细胞，常用于生物制药中。
它具有许多优点，如对重组蛋白的翻译后修饰能力强、生长快速等。
重组蛋白的原理是利用这些CHO细胞来表达外源基因，从而生产所需的蛋白质。
具体来说，CHO细胞重组蛋白的原理包括以下几个步骤：
1. 基因克隆，首先需要将所需的外源基因（编码目标蛋白的基因）克隆到适当的表达载体中，通常是质粒。
这个质粒中还包含一些调控元件，如启动子、终止子和增强子，以确保基因在CHO细胞中得到高效表达。
2. 细胞转染，将经过构建的表达载体导入CHO细胞中。
这可以通过化学方法、电穿孔法或者病毒载体等方式实现。
3. 选择和培养，转染后的CHO细胞需要进行筛选，以确保只有含有外源基因的细胞得以生长和繁殖。
通常会加入抗生素或者其他筛选标记物来实现这一步骤。
筛选后的细胞需要进行培养，以扩大
细胞数量。
4. 蛋白表达和纯化，经过培养的CHO细胞会表达外源基因编码的蛋白质。
这些蛋白质可以分泌到培养液中或者留存在细胞内。
随后，需要对培养液或者细胞进行相应的分离和纯化步骤，以获取纯
净的重组蛋白。
总的来说，CHO细胞重组蛋白的原理是利用CHO细胞表达外源
基因，并通过细胞培养和蛋白纯化等步骤最终获取纯净的重组蛋白。
这一技术在生物制药领域得到广泛应用，为生产重组蛋白药物提供
了重要的手段。
重组蛋白药物的研究进展
[ 5]
齐鲁药事 Qi lu P har maceu tical Af f ai rs 2008 V ol 27 , No 10 转变 , 比如 , N eupog en 向 N eulasta 转变 ; P EG - Intro n A 正 在迅速取代 I ntr on A , 而 P egasys [ 6] 很快地遏 制了 P EG - In tro n A 的发展势头。这提示我 们 , 尽管在市场相对成熟及 饱 和的情况下 , # 重 磅炸 弹∃ 的 突变 体仍 然有 很大 的 机会。 当 然 , 这种机会源于我们对发 病机理、 蛋 白质化 学和生 理功 能 的透彻理解 , 也必须有很好的技术平台对改变后的蛋白进 行 系统、 准确的功能和安全评价。 另一方面 , 加强与国外中小企业的合作。国外大型制 药 巨头都有自己 的产 品研 发体 系 , 与中 国企 业 合作 的机 会 不 大。因此 , 那些北美、 欧洲 的中小 企业高 技术 研发企 业就 有 了与中国医药企业合作的契机 , 因为这些企业的资金同样 有 限 , 他们的钱一般都集中用于研发 , 也希望找到合 作伙伴 , 此 时中国企业也在寻找有核心技术的产品 , 这种优势互补的 合 作能够达成一种双赢的目的。
( Roche 公 司的 Pegasys) 和 PEG 化 的 G % CSF ( Am 融 合蛋白 ( A lbuferon) 已 完成 &期临 床试 的&
生物制药工程中的细胞培养与蛋白质表达技术研究
生物制药工程中的细胞培养与蛋白质表达技术研究细胞培养与蛋白质表达技术在生物制药工程领域中扮演着重要的角色。
通过细胞培养技术，科研人员可以控制细胞生长环境，使其表达特定的蛋白质，从而实现对生物制药产品的生产和提纯。
本文将对细胞培养与蛋白质表达技术在生物制药工程中的应用进行探讨。
细胞培养是一种将细胞在体外的培养基中以合适条件生长和繁殖的技术。
细胞培养技术的发展使得研究人员得以在实验室中大规模培养和操作细胞，以实现对特定蛋白质的表达和生产。
在生物制药工程中，细胞培养技术被广泛应用于生产重组蛋白和抗体等生物制药产品。
通过选择合适的细胞系、优化培养条件和控制生物过程参数, 使细胞能够高效地表达目标蛋白。
细胞表达蛋白质的基本过程包括转染、选择和生产。
转染是将外源基因导入细胞的过程。
常用的转染方法包括病毒介导的转染、电穿孔、化学转染等。
选择是指通过适当的筛选与分离方法筛选出拥有目标基因的细胞克隆株。
生产是指将选定的细胞系进行规模放大，使其大量表达目标蛋白质。
通过这些过程，细胞培养技术可以实现大规模的蛋白质生产。
在细胞培养中，选择适合的细胞系是非常重要的。
不同的细胞具有不同的特性和表达能力。
常用的细胞系包括哺乳动物细胞系、昆虫细胞系和酵母细胞系等。
在选择细胞系时需要考虑其生长特性、表达能力、稳定性和可扩展性等因素。
同时，还需要考虑到细胞系的安全性和遗传稳定性等问题。
为了提高蛋白质的表达水平和纯度，科研人员还需要优化细胞培养条件。
细胞的生长环境包括培养基的选择、营养物质的配比、pH值、温度和气体含量等。
通过优化这些生长条件，可以提高细胞的生长速率和蛋白质表达水平。
此外，控制生物过程参数也是细胞培养中的重要环节。
生物过程参数包括细胞密度、培养时间、信号因子和诱导剂等。
通过控制这些参数，可以使细胞按照预定的方式表达目标蛋白质，从而提高蛋白质的产量和纯度。
细胞培养技术在生物制药工程中的应用非常广泛。
通过细胞培养技术，可以生产各种重组蛋白，如激素、抗体、生长因子和酶等。
cho细胞表达重组蛋白方案
CHO (Chinese Hamster Ovary) 细胞是常用的哺乳动物细胞系统，用于表达重组蛋白的研究和生产。
以下是一般性的CHO 细胞表达重组蛋白的方案：
1. 购买表达载体：选择适合的表达载体，可以是质粒或病毒载体。
载体应包含适当的启动子、选择标记等。
2. 转染CHO 细胞：将表达载体导入CHO 细胞中。
转染方法可以选择经典的化学或电穿孔法，也可以选择使用特定的转染试剂或转染仪器。
3. 选择稳定转染株：在转染后，使用适当的选择剂(如抗生素) 处理细胞，以选择稳定表达重组蛋白的细胞株。
可通过单克隆分离等方法筛选和扩增单一细胞克隆。
4. 细胞培养条件优化：优化培养基配方和细胞培养条件，包括温度、pH 值、培养基组分等，以提高重组蛋白的产量和纯度。
5. 表达蛋白的诱导：使用适当的诱导剂或方法，例如添加诱导剂(如甲酪酸) 到培养基中，以启动重组蛋白的表达。
6. 重组蛋白的纯化和分析：通过细胞破碎和不同的纯化步骤（如亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤等）从培养基或细胞提取物中纯化目标重组蛋白，并使用适当的分析方法验证表达的蛋白的纯度和功能。
在每个步骤中，需要根据具体的重组蛋白和研究目的进行优化和调整。
此外，合理的培养细胞和操作操作也至关重要，以确保产量和纯度的理想达到。
这些方案的细节将根据具体的实验目的和需要进行个体化定制。
哺乳动物细胞重组蛋白工程
哺乳动物细胞重组蛋白工程
哺乳动物细胞重组蛋白工程是一种利用哺乳动物细胞来合成重组蛋白的技术。
该技术可以生产大量纯化的重组蛋白，用于研究和临床应用。
哺乳动物细胞重组蛋白工程一般分为以下几个步骤：
1. 选择合适的宿主细胞：常用的宿主细胞包括CHO（Chinese Hamster Ovary）细胞、HEK（Human Embryonic Kidney）细
胞等。
2. 构建表达载体：将目标基因（编码所需蛋白的基因）插入到合适的表达载体中，并加入适当的启动子、增强子和终止子等元件。
3. 转染和筛选：将构建好的表达载体导入到选择的宿主细胞中，通常使用转染技术（如电穿孔、化学转染等）将表达载体导入宿主细胞，然后通过筛选（如抗生素筛选）获得成功转染的细胞。
4. 表达和培养：将成功转染的细胞进行培养，提供适宜的培养基、温度和气体条件等，促使细胞表达目标蛋白。
5. 纯化和分析：通过细胞培养产生的蛋白，经过一系列纯化步骤（如离心、层析、过滤等），得到高纯度的重组蛋白。
同时，还需要对蛋白进行功能和结构的分析，确保其质量和活性。
哺乳动物细胞重组蛋白工程的优势包括生成更多的细胞因子和复合蛋白、较高水平的糖基化和蛋白修饰等。
然而，与原核表达系统相比，哺乳动物细胞重组蛋白工程的成本较高且时间较长。
重组蛋白、抗体药物的制备
重组蛋白、抗体药物的制备
重组蛋白和抗体药物的制备是通过基因工程技术来实现的。
1. 首先，从人或动物体内提取目标蛋白或抗体的基因。
这可以通过从细胞中提取RNA并将其转录为cDNA，然后使用聚合酶链反应（PCR）扩增目标基因来完成。
2. 接下来，将扩增得到的基因插入到一个适当的表达载体中，这个载体通常是一个质粒或病毒。
载体中通常也会包含一些调控元件，如启动子和转录因子结合位点，用来控制基因的表达水平。
3. 将构建好的表达载体转染到表达宿主细胞中，常见的宿主细胞包括大肠杆菌、哺乳动物细胞等。
转染后，通过对细胞进行培养和群体的筛选，从中筛选出目标蛋白或抗体的高表达细胞株。
4. 高表达细胞株经过大规模培养，然后用适当的方法提取目标蛋白或抗体。
通常使用离心、超滤、层析等技术来纯化目标蛋白或抗体。
5. 最后，对纯化得到的目标蛋白或抗体进行结构和功能鉴定，确保其质量和活性符合要求。
然后将其经过适当的填充剂和稳定剂进行配方，制备成药物形式，如注射液、片剂等。
总的来说，重组蛋白和抗体药物的制备涉及到基因克隆、表达宿主细胞的培养和筛选、蛋白的纯化和鉴定等多个步骤，最终得到符合要求的药物形式。
这些药物在治疗疾病方面具有广泛的应用，如癌症治疗、免疫疗法等。
用于重组蛋白药物生产的CHO细胞无血清培养基的研究进展
中国细胞生物学学报Chinese Journal of Cell Biology 2021，43(4): 905-916DOI: 10.11844/cjcb.2021.04.0025用于重组蛋白药物生产的CHO细胞无血清培养基的研究进展李伟风^樊振林“2张洹瑜U2林艳^王天云G新乡医学院基础医学院生物化学与分子生物学教研室，新乡453003;2河南省重组药物蛋白表达系统国际联合实验室，新乡453000;3新乡医学院护理学院，新乡453003)摘要 哺乳动物表达系统因其具有类似于人源化细胞的翻译后修饰方式，已经成为重组蛋白药物生产的主要表达系统。
中国仓鼠印巢(Chinese hamster ovary,C H O)细胞是生产重组蛋白的理想哺乳动物细胞宿主，目前近70%批准上市的重组蛋白药物是由C H O细胞生产的。
常规细胞培养所用的培养基需要补充血清才能正常生长，但血清存在来源批次不一、下游分离纯化困难、支 原体污染潜在风险等缺点，因此，C H O细胞生产重组蛋白药物要求必须用无血清培养基培养避免以上问题产生。
近年来，围绕无血清培养基进行了大量研究，并取得了显著进展。
该文综述了CHO细 胞的特性、无血清培养基的基础成分及作用，以及一些特殊添加剂的作用等方面的研究进展。
关键词 C H O细胞;无血清培养基;糖蕋化;关键成分Advances of Serum-Free Medium for CHO Cells forthe Production of Recombinant ProteinLI W e i f e n g1’2,F A N Zhenlin1’2,Z H A N G H u a n y u1，2,L I N Y a n1’3,W A N G T i a n y u n1.2* {^Department o f B iochemistry and Molecular Biology, School o f B asic Medicine, Xinxiang Medical University, Xinxiang 453003, China\2H enan International Joint Laboratory o f R ecombinant Therapeutic Protein Expression System, Xinxiang 453000, China\z S chool o f N ursing, Xinxiang Medical University, Xinxiang 453003, China)Abstract M a m m a l i a n expression s y s t e m has b e c o m e the m a i n expression s y s t e m for the production of recombinant protein,d u e to its similarity o f the post-translational modification to the h u m a n cells.C H O(Chinese h a m ster ov a r y)cells are ideal m a m m a l i a n expression hosts for r e c o m b i n a n t protein production.T h e m e d i u m used for routine cell culture requires supplemental s e r u m for n o r m a l g r o w t h.H o w e v e r,d u e to the disadvantages o f s e r u m,s u c h as different sources a n d batches,difficulty in d o w n s t r e a m separation a n d purification,a n d potential risk o f m y c o p l a s m a contamination.Therefore,serum-free culture m e d i u m is required for C H O cells to produce r ecombinant protein drugs to avoid the a b o v e p r o b l e m s.In recent years,a lot o f researches h a v e b e e n per f o r m e d o n serum-free m e d i u m,a n d remarkable progress has b e e n m a d e.In this r eview,the characteristics of C H O cells,the basic c o m p o n e n t s a n d functions o f serum-free m e d i u m,a n d the functions o f s o m e special additives are r e v i e w e d.K e y w o r d s C H O cells;serum-free m e d i u m;glycosylation;k e y c o m p o n e n t收稿H期:202(M O~22 接受日期:2021 -02-04河南省高等学校重点科研项目计划(批准号:20A350007)和河南省高校重点科研项目(批准号:19A350008)资助的课题*通讯作者。
蛋白质表达在动物细胞中的应用利用哺乳动物细胞表达重组蛋白质的优势
蛋白质表达在动物细胞中的应用利用哺乳动物细胞表达重组蛋白质的优势蛋白质是生命机体中最重要的组成部分之一，在生物学、医学和工业领域都具有广泛的应用。
蛋白质表达则是将基因信息转化为蛋白质的过程，这一过程对于基础研究和工业化生产都具有重要作用。
在动物细胞中，蛋白质表达利用哺乳动物细胞表达重组蛋白质具有一系列优势。
一、哺乳动物细胞表达的优势哺乳动物细胞是表达重组蛋白质的理想载体，其优势主要有以下几点：1.真核生物中的哺乳动物细胞能够在所有重组蛋白质修饰过程中提供最高水平的质量。
由于哺乳动物细胞在体内合成蛋白质时，可以发生多种复杂的修饰过程，例如酰化、糖基化和磷酸化等。
这些修饰可以提高蛋白质的稳定性、可溶性和生物活性，使重组蛋白质更加适合用于医学和工业方面。
相比之下，原核生物（如大肠杆菌）表达的蛋白质缺乏这些修饰过程，因此其生物活性和稳定性较低。
此外，哺乳动物细胞中的重组蛋白质也很少产生抗原性，因此更适合用于医学应用。
2.哺乳动物细胞中的蛋白质折叠和修饰过程更加类似于人类和其他哺乳动物中蛋白质合成的过程。
由于哺乳动物细胞与人类和其他哺乳动物有很大相似性，因此表达的重组蛋白质更符合人类进化历史和生物学功能。
这也意味着可以更好地预测重组蛋白质在生理环境下的稳定性和效力，缩短临床试验的时间和成本。
3.哺乳动物细胞表达的重组蛋白质能够以天然状态的形式分泌到培养基中。
重组蛋白质如果能够以天然状态的形式分泌到培养基中，可以节省纯化步骤和工艺流程，降低生产成本，提高重组蛋白质的产量和纯度。
而哺乳动物细胞中的重组蛋白质通常能够实现这一点。
此外，哺乳动物细胞的培养和维护工艺已经比较成熟，使用更加方便。
二、哺乳动物细胞表达重组蛋白质的方法哺乳动物细胞表达重组蛋白质的方法有多种，主要有以下几种：1.哺乳动物细胞内表达哺乳动物细胞内表达是将重组质粒导入哺乳动物细胞内部，利用细胞自身的基因转录、转译和修饰等机制，表达出重组蛋白质。
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成为皋因转染实验中可供选择的新细胞株。
２．
重组表达载体
人工构建的哺乳动物细胞表达载体为穿梭载体，含有原核基凶序列：大肠杆
菌复制予及抗生素抗性暴冈等，这样便于裁体侄原核细胞中扩增和大疑制备。另
外含有能使外源基凶在哺乳动物细胞中有效转录的启动子和增强子元件，以及终
止子和加ｐｏｌｙＡ信号序列。Ｔｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司的ｐｃＤＮＡ系列载体是实验中常用的
８０年代，哺乳动物细胞生产罩组蛋白质的研究｝要在旋转培养瓶中进行，
由于这些容器体积较小，仪有约５０毫升，另外这种容器的液相体积传质系数 （Ｋｌａ）约为２－３／ｈ，最大的细胞密度仅为２＂３Ｘ１０６
ｃｅｌ ｌｓ／ｍｌ。因此，旋转式小
瓶细胞培养不适用于大规模培养。轨道式振摇瓶，约５０ｍｌ体积的通气瓶，作为 一种小规模哺乳动物细胞培养装置，细胞密度达到１０７细胞／ｍｌ，在适当的搅动 速度下，Ｋｌａ可以达到１０—２０／ｈ。由于具有良好的传质系数，可以有效地克服氧 对高密度细胞培养的限制，这种装置可作为实验室规模的前期研究。 目前大规模哺乳动物细胞培养绝大数是在不锈钢搅拌式反应罐中进行的，现
备重组蛋白的研究。
１．
重组细胞系 哺乳动物细胞大规模培养生产重组蛋白中，常用的细胞系有ＣＨＯ和１１ＥＫ２９３
两大类细胞。曾一度使用较多的ＣＯＳ细胞，由于强烈的贴壁作用，限制了大规模
悬浮细胞培养生产的实际应用。目前还有一些哺乳动物细胞株正在进行大规模培
１７４
养生产的研发中，如猿细胞衍生的Ｖｅｒｏ和ＣＶ－ｌ，以及人的胚胎干细胞等。 上世纪８０年代初期，Ｒｉｎｇｏｌｄ等首次报道采用非病毒性基因转移技术获得 了稳定性转染外源目的基因的哺乳动物细胞株，即永生化ＣＨＯ（Ｃｈｉｎｅｓｅ ｈａｍｓｔｅｒ
在有一种趋势就是采用一次性设备或波动型搅拌反应器。细胞被培养于一次性塑 料装置中，体积可以达到５００Ｌ，这种装置的Ｋｌａ约为４／ｈ。目前也有供应商提供 一次性搅拌式反应罐，体积也可以达１吨位水平。
４．结束语
哺乳动物细胞培养生产重组蛋白质相关技术和设备的发展将会使该领域产 生革命性的变化。目前随着基因组学、蛋白质组学和代谢组学研究，人们对哺乳 动物宿主细胞的生理、生化有了更深入的了解。通过增加细胞密度、延长培养时
们多年来对哺乳动物细胞大规模生产重组蛋白的关键之处进行了深入研究与优 化，主要集中在对细胞株、表达载体、基因转移、重组细胞筛选、培养基的组成 以及生物过程等方面的改造和优化。特别是补料流加技术的采用，使细胞在长时 间的培养过程中细胞数目多、且健壮活泼。遗憾的是这些技术掌握在少数公司手 中，没有公开化。为了提高重组哺乳动物细胞表达重组蛋白质的产量，一般可以 从以下两个方面着手：改进基因传输和遗传筛选的方法，以加速高产细胞株的发 现，另一方面则是开发高效的细胞培养系统，以便快速、低成本地筛选生物制备 过程的优化条件，通过优化补料策略提高细胞密度和细胞的存活率。为了减少成 本和节约时问，近年来国外又开展了大规模哺乳动物细胞培养瞬时表达（ＴＧＥ）制
有１５－２５％细胞在没有选择性压力的条件下稳定表达目的蛋白。染色体中的ＤＮＡ
元件会影响基因的沉默，如核骨架／基质结合区（Ｓ／ＭＡＲｓ）、绝缘体等染色体元 件将稳定重组细胞中蛋白质的表达。这些元件可以克隆到表达载体中，抑制异染 色体区的形成，减少基因的沉默。
３．
生物制备过程 哺乳动物细胞大规模培养的工业化生产过程绝大数是在生物反应器中进行
哺乳动物细胞表达载体，它含有人巨细胞病毒的ＣＭＶ启动子。驱使目的皋因表达
的启动了是表达载体的关键凶素，人臣细胞病毒的早期皋冈肩动子和增加子
（ｐｒｏｍｏｔｅｒ／ｅｎｈａｎｃｅｒ）是最常用的启动子。也有采用鼠ＣＭｖ启动子、人／鼠源巨 细胞病毒杂交的ＣＭＶ启动予和延长因子ｌ
Ｑ（ＥＦｌ
Ｑ）的启动予。一些实验寮也
养基中。ＨＥＫ２９３细胞系具有很高的质粒转染效率和对保持外源基因的高稳定性，
２９３细胞已成为基凶转染实验巾最常使用的细胞系之一。以ＨＥＫ２９３为基础衍生 了一些新的ＩＩＥＫ细胞株，如ＥＢ病毒转化的ＨＥＫ．ＥＮＮＡ细胞，ＳＶ４０ Ｔ一抗原转化的
ＨＥＫ２９３
Ｔ株，Ｂ淋巴瘤细胞融合的ＨＫＢ—ｌ １细胞等，这些细胞株具有新的特性，
基因所插入位点染色体的结构。异染色质区ＤＮＡ较浓缩，转录不活跃，而常染色
区较松驰，转录活跃。染色体的这两种状态与组蛋白的修饰（乙酰化、甲基化、 磷酸化）有关，蛋白修饰控制了染色体的浓缩和转录活性。大约有５０％的重组细 胞在选择性压力移去后的数天内就会发生快速沉默，而大约有３０％的细胞会选择 性压力移去后的６个月内就会逐渐减少目的基因的表达，称为慢沉默。最后大约
ＥｍｂｒｙｏｎｉＣ Ｋｉｄｎｅｙ ２９３
ｃｅｌｌ）于１９７７年由Ｇｒａｈａｍ等
用５型腺病毒７５株系转化构建的，它含有ＡｄＳ Ｅ１区的人胚肾亚三倍体细胞系， 是一种Ｅ１区缺陷互补细胞系。２９３细胞是贴壁依赖型呈上皮样细胞，表现出典
１７５
型的腺病毒转化细胞的表型，细胞允许Ａｄ５和其他血清型腺病毒在其上增殖。贴 壁培养、微载体培养、无血清悬浮培养三种方式均可用于２９３细胞的大规模培养。 ２９３细胞在无Ｃａ加或含Ｃａ２＋培养基中町同样生长，也可生长在血清浓度较低的培
ｃｌｏｎｅＰｉＸ
ｓｙｓｔｅｍ（Ｇｅｎｅｔｉｘ Ｌｔｄ．）ａｎｄ
Ｃｅｌ
１Ｃｅｌｅｃｔｏｒ。对这些仪器而言，使用的
前提是假定重组细胞被重悬于半固体的培养基中。在这样的条件下，分泌性的重
组蛋白处于细胞的附近，可以被荧光标记的抗体染色，这些自动化系统能检测和 筛选重组细胞系以作进一步研究。 ｔ１ＥＫ２９３细胞（Ｈｕｍａｎ
在过去的２０多年中，哺乳动物细胞制备重组长，由过去的７天延长至２１天；
（２）细胞密度
（３）
增加，由过去的卜２Ｘ１０６细胞／毫升，增加到现在的卜１．５Ｘ１０ ７细胞／毫升；
产量增加，过去为１０—２０ｐｇ重组蛋白／细胞／天，５０一１００ｍｇ重组蛋白／升，而现在 则为５０－９０ｐｇ重组蛋白／细胞／天，卜５９重组蛋白／升。这些变化的主要原因是人
的单细胞悬浮式培养，反应罐的体积可达２０吨。为了节约成本，减少动物血清 对产品的污染，现在主要采用无血清培养基，目前有多家商业公司提供适用不同 细胞株和不同生产工艺的无血清培养基，如Ｕ１ｔｒａＣｕｌｔｕｒｅ，ＰｒｏＣＨＯ，Ｐｒ０２９３等。
１７６
大多数的无血清产品含有向细胞内转运离子的转铁蛋ｆ１和调节葡萄糖摄取量的 胰岛素，以及一些蛋一质如清蛋白，纤连蛋白，胎球蛋自等，这止警蛋自在细胞培
似的理化・忖质和乍物学功能。以默克、基凶泰克等围际大公刮为代表的大规模流
加培养生产工艺，其反应罐体积可以达剑１０吨以上，蛋白表达浓度为
１．０—２．Ｏｇ／Ｌ。我闻从２０００年开始逐渐发展了该项技术，虽然起步较晚，基础较 差，但经过努力实现了该项技术的突破。本课题组目ｆｉ＿ｉＪｉＦ．在开展哺乳动物细胞表 达重组蛋自和抗体药物的研究和技术开发。 １９８７年ＦＤＡ批准了基因泰克公刮生产的ｔＰＡ，这是世界上第一个哺乳动物细 胞制备的重组蛋一质药物，当时基因泰克公司借鉴了细菌大舰模培养技术，在搅 拌式反应罐中大规模培养悬浮重组ＣｌＩＯ细胞制备ｔＰＡ。这是一项具有晕程碑性的 工作，标志着哺乳动物细胞制备重组蛋门时代的到来。
ｏｖａｒｙ）细胞系。ＣＨＯ细胞足第一批采用的宿主细胞，是一种＿二氢叶酸还原酶营
养缺陷型细胞株。蟹白质制备过程中所采用的ＣＨＯ细胞于１９５７年山Ｐｕｃｋ等人将 原代培养的中围仓鼠卵巢细胞的永４ｉ化而获得。ＣＨＯ—Ｋｌ足由原始ＣｔｔＯ细胞衍生 的甘氨酸依赖型细胞株，并经进一步突变产牛为Ｃｌｌ沪ＤＸＢｌ ｌ，也称为ＣＩＩＯ－ＤＵＫＸ 或ＣＨＯ－ＤＵＫ－ＸＢＩ ｌ，这是一株ＤＨＦＲ缺陷型细胞株，这些细胞中已删除了一个ｄｈｆｒ 等位皋因，另一个等位基凶则产生了错义突变。ＣＨＯ－ｐｒ０３一细胞株为脯氨酸依赖 型细胞株，它被突变产生为ＣＨＯ～Ｄ（；４４，该细胞株则删除了ｄｈｆｒ的两个等位基因。 这些Ｄ１１ＦＲ缺陷细胞株需要甘氨酸、次黄嘌呤和胸腺嘧Ｉ赃作为生长补允原料。 虽然ＣＨＯ细胞最初并不足为了用。『．表达重组蛋白而制备的，ｆＨ ＤＩｔＦＲ删除的 ＣＨＯ细胞易于制作稳定的转基凶细胞株。采Ｊ１ｊ外源ｄｈＩ、ｒ与目的基闻共转染，通 过ＧＨＴ缺少培养基可以筛选剑稳定的转染细胞株。这已成为一项标准的遗传筛选 方法，首先是将目的基因和ｄｈｆ’ｒ克隆在Ｉ司一表达载体或个别的表达载体。载有 两个基凶的质粒被转染到宿主细胞中，然后让细胞￡卜长在选择性培养基（缺少 ＧＨＴ）中。每一个存活细胞的染色体中将有一个或多个拷贝的外源日的基冈和 ｄｈｆｒ。不同的重组细胞株整合的质粒拷贝数不尽相Ｉｒｄ，但它们整合的位点往往则 是相同的。每一个细胞株的生长速率和罩组蛋白质的表达水平有很大的变化。一 般要对成百上千个细胞株进行筛选和评价，才能得到高产稳定的重组细胞株。ＭＴＸ （氨甲蝶呤，ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）能抑制ｄｈｆｒ基因表达产物的活性，当表达外源ｄｈｆｒ 的重组细胞ＣＨＯ株，在含有高浓度的ＭＴＸ培养基中，绝大数的细胞会在２—３周内 死亡，仅有少数整合有高拷贝的重组质粒的细胞株爿‘能存活。目的基因一般与 ｄｈｆｒ相伴随而整合，因此可以用此法筛选得到高拷贝含有目的基因的重组细胞 株。 根据共转染重组原理，新的筛选方法是采用荧光激活细胞分检技术（ＦＡＣＳ）。 将ＧＦＰ蛋白与目的基冈共转染，然后利用ＧＦＰ特异性荧光分检技术，获取产荧光 细胞株。也可将目的基因与编码细胞表面蛋白的基因共转染，重组细胞表达的细 胞表面蛋白，可以采用荧光标记的抗体技术进行流式细胞技术分检。同样，荧光 性ＭＴＸ能与ＤｔｌＦＲ结合，ＤＨＦＲ也可以被ＦＡＣＳ技术分检。ＭＴＸ特异性荧光强度与重 组蛋白质的表达量相当。现在克隆细胞株可以通过自动化的仪器分检，如
开发了自己的哺乳动物表达载体，主要添加了一些其它的元件以增加目的基凼的
表达水平，如ｐＳＳｌ８５质粒引入ＨＩＶ病毒的转录活性元件ＴＡＴ／ＴＡＲ，ｐＴＴ质粒则引 入腺病毒的内含子剪接元件以增加ｍＲＮＡ稳定性和蛋白质翻译速度。 ～旦克隆细胞系获得后，必须对其蛋白质表达的稳定性作出评价。由于基因 的沉默现象产生了特定基因的转录降低或取消。导致基因沉默的主要原因是目的