共聚焦显微镜
在体反射式共聚焦显微镜原理
7. 数据处理：收集到的荧光信号经过电子学处理和数字化，然后通过计算机进行图像重建 和处理。可以使用不同的软件进行图像处理，如图像叠加、三维重建等。
通过以上原理，CLSM可以获得高分辨率的三维图像，具有较高的光学分辨率和深度探测 能力。它可以用于生物学研究、医学诊断、材料科学等领域，对于观察和分析样品的细微结 构和功能具有重要意义。
在体反射式共聚焦显微镜原理
体反射式共聚焦显微镜（Confocal Laser Scanning Microscope，简称CLSM）是一种 高分辨率的显微镜技术，其原理如下：
1. 激光光源：CLSM使用激光光源，通常是单色激光器，产生高亮度、单色的激光光束。
2. 反射镜：激光光束通过一个反射镜，被反射到一个特定的角度，然后通过一个扫描镜系 统。
5. 样品：样品可以是生物组织、细胞、纳米颗粒等。样品通常被染色或标记以增强成像的 对比度和选择性。
6. 探测器：样品反射或发射的荧光信号被收集并传递到一个探测器上。探测器可以是光电 二极管（Photomultiplier Tube，简称PMT）或光电倍增管（Avalanche Photodiode，简 称APD）。探测器将信号转化为电信号。
3. 扫描镜系统：扫描镜系统由两个可调节的镜子组成，可以控制激光光束在样品上的位置 。其中一个镜子控制激光光束在水平方向上的移动，另一个镜子控制垂直方向上的移动。
在体反射式共聚焦显微镜原理
4. 物镜：激光光束通过扫描镜系统后，通过一个物镜聚焦到样品上。物镜具有高数值孔径 和长工作距离，以提供高分辨率的成像能力。
共聚焦显微镜实验报告
一、实验目的1. 熟悉共聚焦显微镜的基本原理和操作方法。
2. 利用共聚焦显微镜观察细胞结构、细胞器和细胞内分子的分布情况。
3. 掌握共聚焦显微镜在生物学研究中的应用。
二、实验原理共聚焦显微镜（Confocal Microscopy）是一种利用激光光源、共聚焦光学系统和计算机图像处理技术进行细胞和组织结构观察的显微镜。
其基本原理是利用激光光源在样品上形成点光源，通过物镜聚焦到样品的焦平面上，激发荧光物质发出荧光。
由于照明针孔与探测针孔相对于物镜焦平面是共轭的，只有焦平面上的光才能通过探测针孔，从而实现对焦平面的荧光信号采集，同时抑制了背景光的干扰。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：细胞样品（如酵母细胞、植物细胞等）、荧光染料（如DAPI、FITC 等）、荧光标记抗体等。
2. 实验仪器：共聚焦显微镜、激光光源、物镜、扫描模块、探测器、计算机等。
四、实验步骤1. 样品制备：将细胞样品固定、染色，并进行适当处理，使其适合共聚焦显微镜观察。
2. 设定共聚焦显微镜参数：包括激光光源的波长、扫描速度、扫描范围等。
3. 观察细胞结构：使用共聚焦显微镜观察细胞的结构，如细胞核、细胞质、细胞器等。
4. 观察细胞器：使用荧光染料和荧光标记抗体对细胞器进行染色，观察其分布和形态。
5. 观察细胞内分子：使用荧光标记抗体对细胞内分子进行染色，观察其分布和动态变化。
6. 图像采集与处理：使用共聚焦显微镜采集图像，并通过计算机图像处理技术进行图像分析和三维重建。
五、实验结果与分析1. 观察到细胞核、细胞质、细胞器等细胞结构清晰可见，荧光染料和荧光标记抗体在细胞内分布均匀。
2. 观察到线粒体、内质网、高尔基体等细胞器在细胞内的分布和形态，为细胞器功能研究提供依据。
3. 观察到细胞内分子在细胞内的分布和动态变化，为细胞信号传导和分子调控研究提供线索。
六、实验讨论1. 共聚焦显微镜具有较高的分辨率和信噪比，能够观察细胞内部精细结构，为生物学研究提供有力工具。
2024年共聚焦显微镜市场规模分析
2024年共聚焦显微镜市场规模分析引言共聚焦显微镜（Confocal microscopy）是一种高分辨率的显微镜技术，可用于观察生物和材料的细胞结构和组织形态。
近年来，随着生命科学和材料科学领域的快速发展，共聚焦显微镜的市场需求也呈现出快速增长的趋势。
本文将对共聚焦显微镜市场进行规模分析，并探讨其未来发展趋势。
市场规模分析共聚焦显微镜市场概况共聚焦显微镜市场是一个相对年轻但快速增长的市场。
共聚焦显微镜的高分辨率和三维立体观察能力，使其成为生命科学和材料科学研究中的重要工具。
目前，该市场主要由医疗研究机构、学术研究机构和生物技术公司等需求方驱动。
共聚焦显微镜市场规模根据市场调研公司的数据显示，近年来共聚焦显微镜市场持续增长。
预计到2025年，该市场的总体规模将超过X亿美元。
主要驱动因素包括生命科学研究的不断进展、医疗影像技术的提升以及材料科学领域对于高分辨率显微镜的需求增加。
共聚焦显微镜市场应用领域共聚焦显微镜在生命科学和材料科学领域有广泛的应用。
生命科学领域的主要应用包括细胞生物学、分子生物学和神经科学等。
材料科学领域的应用主要包括纳米材料研究、光电材料研发和材料表面形貌观察等。
共聚焦显微镜市场竞争格局共聚焦显微镜市场竞争激烈，主要厂商包括日本的奥林巴斯（Olympus）、美国的蔡司（Carl Zeiss）和德国的莱卡（Leica）等。
这些厂商通过不断提升产品性能和功能来争夺市场份额，同时也不断推出新的应用方案以满足客户需求。
未来发展趋势技术创新驱动发展随着科学技术的不断进步，共聚焦显微镜的分辨率和观察深度将不断提高。
同时，新的成像技术和显微镜配套技术的发展也将推动整个共聚焦显微镜市场的发展。
市场应用拓展随着生命科学和材料科学领域的发展，共聚焦显微镜在更多的应用领域将得到拓展。
例如，在制药行业，共聚焦显微镜可用于药物研发和临床试验中的细胞观察和分析。
云端数据处理和分析随着云计算和大数据技术的发展，共聚焦显微镜图像的数据处理和分析将更加高效和准确。
激光共聚焦显微镜的原理和应用
激光共聚焦显微镜的原理和应用1. 引言激光共聚焦显微镜（Laser Scanning Confocal Microscope，简称LSCM）是一种高分辨率的显微镜技术，已经广泛应用于生物学、医学和材料科学等领域。
本文将介绍激光共聚焦显微镜的原理和应用。
2. 原理激光共聚焦显微镜通过激光束的共聚焦和通过物体的反射或荧光发射来实现图像的采集。
2.1 激光共聚焦•通过透镜来聚焦激光束•聚焦点在样本表面上产生光斑•样本反射或发射出来的光再次通过透镜，聚焦到探测器上•透镜的位置可以移动，可以扫描整个样本2.2 反射和荧光信号的采集•激光束照射到样本上，经过反射或荧光发射•光学系统收集并聚焦这些发射的光•通过探测器记录下发射光的强度和位置•通过移动透镜和探测器，可以获得样本的三维图像3. 应用激光共聚焦显微镜在许多领域都得到了广泛的应用，以下是其中的几个典型应用。
3.1 细胞生物学•可以观察细胞的形态和结构•可以追踪细胞内的生物分子运动•可以观察细胞的生物化学过程3.2 分子生物学•可以观察和定量细胞器的分布和聚集情况•可以观察和测量分子的扩散速率•可以研究蛋白质的合成和代谢过程3.3 医学研究•可以观察和诊断组织和器官的病理变化•可以研究疾病的发生和发展机制•可以评估治疗方法的有效性和副作用3.4 材料科学•可以观察材料的微观结构和表面形貌•可以研究材料的热力学和力学性质•可以评估材料的耐久性和可靠性4. 总结激光共聚焦显微镜是一种高分辨率的显微镜技术，通过激光束的共聚焦和物体的反射或荧光发射来实现图像的采集。
它在细胞生物学、分子生物学、医学研究和材料科学等领域都有着广泛的应用。
利用激光共聚焦显微镜，科研人员可以观察和研究生物和材料的微观结构、功能和相互作用，为科学研究和应用提供了强大的工具。
荧光共聚焦显微镜原理
荧光共聚焦显微镜原理
荧光共聚焦显微镜（Confocal Microscope）的原理基于光学聚焦和计算机图像处理技术。
其工作原理主要包括以下几个方面：
1. 光学聚焦：共聚焦显微镜使用高数值孔径的物镜将激发光聚焦在样品上，形成非常小的光斑。
这样可以在焦平面上获得较高的图像分辨率。
2. 针孔滤波：在共聚焦显微镜中，通常在物镜的后焦平面设置一个小孔（即针孔），只允许经过聚焦的光斑通过。
这样可以有效地消除杂散光和背景光，提高图像的对比度和信噪比。
3. 光学切片：通过计算机控制扫描器，使激光束在样品上做平面扫描，同时检测器接收经过针孔滤波的荧光信号。
这样就可以获取一系列二维图像，再通过计算机将这些图像叠加起来，形成一个三维的图像。
通过光学切片的原理，可以实现对样品的逐层扫描，获得不同深度的图像。
4. 计算机图像处理：共聚焦显微镜采集到的图像数据需要经过计算机的图像处理和分析，包括对图像进行增强、伪彩色编码、三维重建等操作，以便更好地展示样品的结构和功能。
总的来说，荧光共聚焦显微镜的原理是将激光光源聚焦在样品上，通过针孔滤波和光学切片技术获取高分辨率的三维图像，再通过计算机进行图像处理
和分析。
这种技术广泛应用于生物学、医学、材料科学等领域，用于观察和分析细胞、组织、蛋白质等微观结构。
共聚焦显微镜原理
共聚焦显微镜原理
共聚焦显微镜是一种高分辨率显微镜，它利用共聚焦原理观察样品的表面形貌和结构。
共聚焦显微镜具有高分辨率、高对比度和三维表面重建的优点，因此在材料科学、生物医学和纳米技术等领域得到了广泛的应用。
首先，共聚焦显微镜的工作原理是基于共焦原理。
共焦原理是指在焦平面上同时聚焦激光束和检测信号，通过这种方式可以获得高分辨率的图像。
共聚焦显微镜利用激光光源照射在样品表面，样品表面反射的光信号被激光束收集，然后经过光学系统聚焦到探测器上，最终形成样品的高分辨率图像。
其次，共聚焦显微镜的成像原理是通过探测器接收样品表面反射的光信号，并将这些信号转换成电信号。
然后通过信号处理系统对这些电信号进行处理，最终形成样品的图像。
共聚焦显微镜的成像原理保证了其在观察样品表面形貌和结构时具有高分辨率和高对比度的特点。
另外，共聚焦显微镜在成像过程中还可以实现三维表面重建。
通过对样品表面反射的光信号进行处理，可以获取样品表面的高度信息，从而实现对样品表面的三维重建。
这种特点使得共聚焦显微镜在观察微纳米结构和纳米材料时具有独特的优势。
总的来说，共聚焦显微镜是一种基于共焦原理的高分辨率显微镜，其工作原理是利用激光束和检测信号在焦平面上同时聚焦，成像原理是通过探测器接收样品表面反射的光信号，并将这些信号转换成电信号，最终形成样品的图像。
共聚焦显微镜在观察样品表面形貌和结构时具有高分辨率、高对比度和三维表面重建的优点，因此在材料科学、生物医学和纳米技术等领域得到了广泛的应用。
共聚焦显微镜的应用
共聚焦显微镜的应用共聚焦显微镜是一种常见且广泛应用于生物学、材料科学和其他领域的先进显微镜技术。
它通过使用一种特殊的激光光束和精确的光学系统，可以获取高分辨率和高对比度的显微图像。
共聚焦显微镜的原理是利用聚焦在样本上的激光光束与样本中的荧光信号进行交互，然后通过成像系统收集并转换这些信号为可视化的图像。
共聚焦显微镜的应用范围非常广泛。
下面，我将从多个角度讨论共聚焦显微镜在不同领域的应用。
1. 生物学中的应用：共聚焦显微镜在生物学研究中具有重要作用。
它可以提供高分辨率的细胞和组织结构图像。
在细胞生物学中，共聚焦显微镜可以用于观察细胞内蛋白质、细胞器和细胞核等结构的分布和运动。
共聚焦显微镜还可以用于观察细胞分裂过程、细胞内信号传导和细胞凋亡等关键生物学过程。
2. 材料科学中的应用：在材料科学领域，共聚焦显微镜被广泛应用于材料的表征和分析。
它可以提供高分辨率的表面形貌和内部结构信息。
在材料表面缺陷分析中，共聚焦显微镜能够观察到微观缺陷的形貌和位置。
共聚焦显微镜还可用于材料的化学成分分析和荧光标记探针的检测。
3. 医学领域中的应用：在医学领域，共聚焦显微镜可用于细胞和组织的诊断和研究。
在癌症研究中，共聚焦显微镜可以观察到癌细胞的形貌和分布，从而帮助医生确定病情和制定治疗方案。
共聚焦显微镜还可以用于血液和生物标本的显微观察，以及对药物在体内的分布和代谢过程的研究。
总结回顾：共聚焦显微镜是一种在生物学、材料科学和医学领域具有广泛应用的先进显微镜技术。
它通过高分辨率和高对比度的显微图像提供了对样本的详细观察。
在生物学中，共聚焦显微镜可以用于观察细胞结构、蛋白质分布和细胞内过程。
在材料科学中，共聚焦显微镜广泛应用于材料的表征和分析。
在医学领域，共聚焦显微镜对癌症诊断和研究具有重要意义。
通过综合利用共聚焦显微镜的特点和功能，我们可以更深入地理解和研究生物、材料和医学等领域的重要问题。
观点和理解：共聚焦显微镜作为一项先进的显微镜技术，为我们提供了探索微观世界的窗口。
扫描共聚焦显微镜原理
扫描共聚焦显微镜原理一、引言扫描共聚焦显微镜（Scanning Confocal Microscope，SCM）是一种先进的显微成像技术，它在生物学、医学、材料科学等领域有着广泛的应用。
与传统的显微镜相比，扫描共聚焦显微镜具有更高的分辨率和更好的成像质量。
本文将重点介绍扫描共聚焦显微镜的工作原理。
二、扫描共聚焦显微镜的工作原理扫描共聚焦显微镜的基本原理是通过逐点扫描样品，并对每个像素点的荧光信号进行检测和记录，从而获得高分辨率的图像。
以下是扫描共聚焦显微镜的工作原理：1.逐点扫描：扫描共聚焦显微镜使用快速振镜或声光器件等扫描装置，对样品进行逐点扫描。
在每个像素点上，激光束聚焦在样品上，激发荧光。
2.激发荧光：当激光束照射到样品上时，会激发荧光。
这些荧光信号是样品特性的反映，可以用于成像。
3.检测荧光信号：在每个像素点上，荧光信号被检测器收集并转换为电信号。
这个过程是在焦平面上完成的，因此每个像素点都有良好的焦深。
4.记录图像：电信号被记录并转换为数字信号，然后通过计算机进行图像处理和显示。
由于每个像素点的荧光信号都被独立记录，因此最终获得的图像具有高分辨率和高对比度。
5.图像重建：通过将所有像素点的图像信息组合起来，可以重建出整个样品的图像。
这个过程可以通过计算机软件实现。
三、扫描共聚焦显微镜的特点和优势扫描共聚焦显微镜具有以下特点和优势：1.高分辨率：由于逐点扫描和独立检测每个像素点的荧光信号，扫描共聚焦显微镜可以获得高分辨率的图像，远高于传统的显微镜。
2.更好的焦深：由于在焦平面上进行检测，每个像素点都有良好的焦深，使得获得的图像具有更好的立体感。
3.减少杂散光干扰：通过只检测焦平面的荧光信号，扫描共聚焦显微镜有效地减少了杂散光干扰，提高了图像的对比度。
4.定量分析：由于每个像素点的荧光信号都可以独立记录，因此可以对样品进行定量分析，如测量荧光强度、测量荧光光谱等。
5.适合各种样品：扫描共聚焦显微镜适用于各种样品，如生物切片、细胞培养物、组织样本等。
2024年共聚焦显微镜市场发展现状
共聚焦显微镜市场发展现状摘要共聚焦显微镜是一种重要的高分辨率显微成像技术，广泛应用于生命科学、材料科学、纳米科技等领域。
本文通过对共聚焦显微镜市场发展现状的调查研究，分析了市场的规模、增长趋势、应用领域、主要厂商等方面的情况。
结果显示，共聚焦显微镜市场呈现出快速增长的趋势，并且在生命科学领域有着广泛的应用。
同时，主要厂商之间的竞争日趋激烈，技术创新和产品升级成为市场发展的主要驱动力。
然而，市场中还存在着一些挑战，如成本高、操作复杂等问题，需要进一步加以解决。
1. 引言共聚焦显微镜（confocal microscope）是一种利用激光光源和共焦透镜技术实现的高分辨率显微成像技术。
它能够消除样品中的散射光，获得高质量的三维显微图像。
由于其独特的优势，共聚焦显微镜得到了广泛的应用，尤其是在生命科学研究中。
本文旨在分析共聚焦显微镜市场的发展现状，为行业从业者和投资者提供参考。
2. 市场规模与增长趋势根据市场调研数据显示，共聚焦显微镜市场规模自2020年以来呈现出稳步增长的趋势。
尽管受到COVID-19疫情影响，市场在2020年下半年出现了一定程度的放缓，但在2021年以后逐渐恢复并实现了正增长。
预计未来几年，共聚焦显微镜市场将继续保持较高的增长率。
3. 应用领域共聚焦显微镜在生命科学、材料科学、纳米科技等领域有着广泛的应用。
在生命科学领域，共聚焦显微镜可用于细胞和组织的三维成像、蛋白质定位和交互、细胞活动的实时观察等方面。
在材料科学领域，共聚焦显微镜可用于表面形貌的观察、材料结构分析、纳米颗粒的表征等方面。
在纳米科技领域，共聚焦显微镜可用于纳米结构的成像和分析等。
4. 主要厂商共聚焦显微镜市场中存在着众多的主要厂商，其中包括Zeiss、Leica、Nikon、Olympus等知名品牌。
这些厂商在共聚焦显微镜的研发、生产和销售方面具有较强的实力。
此外，一些新兴的科技企业也在该领域崭露头角，推出了一系列具有创新性的产品，例如Andor、Bruker等。
共聚焦成像显微镜安全操作及保养规程
共聚焦成像显微镜安全操作及保养规程共聚焦显微镜是一种先进的成像设备，广泛应用于生命科学、物理科学等多个领域，它能够提供高分辨率、深度和对样本的空间结构进行三维描述等特点，但同时也存在一定的风险。
本文旨在向相关工作人员提供共聚焦显微镜的安全操作及保养规程，以保证人员安全和设备正常运行。
安全操作规程1. 佩戴个人防护装备在使用共聚焦显微镜时，必须佩戴好个人防护装备，包括安全眼镜、手套、长袖上衣等，以预防暴露在激光光束下时对眼睛和皮肤的伤害。
2. 正确开启设备在正式使用设备前，必须确认整个设备是否处于正常的状态。
应该先开启共聚焦显微镜，验证各个系统是否工作正常，包括激光器、探测器和其他系统等，检查完毕后再进行后续的操作。
3. 熟练掌握操作方法在进行具体的实验操作前，需要对设备的部件及相关装置进行仔细学习，全面掌握该设备的使用方法及相应的安全措施。
各种操作的位置和流程都需熟记于心。
4. 控制激光手柄在使用共聚焦显微镜时，必须节制使用激光手柄，尤其是在进行样品扫描和调焦过程中，必须控制激光手柄的强度，调整到安全低于I m ax的最小值；当不再需要激光时，应立即关闭激光器。
5. 防止交叉感染共聚焦显微镜通常应用于生物实验，因此必须防止交叉感染。
慎选样品、消毒液及其他相关材料，严禁在同一个场所同时进行不同的生物实验。
设备保养规程1. 清洁电视显微镜在使用电视显微镜时，需要擦拭透镜，去除灰尘或样本残留物，否则将影响整个系统的成像效果。
当透镜变脏时，可以使用棉球或者干的无菌纱布进行轻轻擦拭，切勿使用水和洗涤剂清洗。
2. 定期维护激光器共聚焦显微镜的激光器需要定期进行维护，以确保激光器的正常工作。
具体的维护包括：•检查整个设备是否有异响或异常的情况。
•清除激光器的滤镜，以确保光线从整个激光器系统中传输有效的光输出。
•应定期更换一定损耗的透射镜片等磨损部件。
3. 清洁镜头在使用共聚焦显微镜时，必须保证样品及相应的镜头是干净的，否则将影响成像效果。
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吴立君博士徕卡显微系统南京大学共聚焦显微镜生物学相关荧光样品制备共聚焦显微镜生物学相关荧光样品制备Dr Lijun Wu Leica / Shanghai 23/6/2014植物细胞动物细胞共聚焦显微镜生物学相关荧光样品制备Lijun Wu Leica / Shanghai 23/6/2014共聚焦显微镜生物学相关荧光样品制备Dr Lijun Wu Leica / Shanghai 23/6/2014MitoTracker LysoTrackerAnti-Calnexin TubulinGM-130Phalloidin Hoechst 33258EEA1DAPIPIOrganelle markersActinPIEREarly Endosome荧光样品染色•免疫荧光细胞化学法•荧光探针•荧光蛋白基因转染用于体内标记的荧光探针•量子点法共聚焦显微镜生物学相关荧光样品制备Dr Lijun Wu Leica / Shanghai 23/6/2014组织标本主要取之活组织检查标本、手术切除标本、动物模型标本以及尸体解剖标本。
前三作用是沉淀蛋白质和糖，对组织穿透性很强，保存抗原的免疫活性较好。
但醇类对低分子蛋白质、多肽及胞浆内蛋白质的保存效果较差，解决的办法是和其他试为免疫组织化学染色中最常用的一种切片方法。
其最突出的优点是能够比较完好地保存多种抗原的免疫活性，尤其是细胞表面抗原更应该采用冰冻切片。
新鲜的组织及已经固定的组织共聚焦显微镜生物学相关荧光样品制备Dr Lijun Wu Leica / Shanghai 23/6/2014共聚焦显微镜生物学相关荧光样品制备Dr Lijun Wu Leica / Shanghai 23/6/2014组织和细胞的自发性荧光检测1、动物组织一般呈现弱淡兰色荧光，其中弹性纤维的荧光较强；2、红细胞血红蛋白中的卟啉呈红色荧光，但在正常情况下，卟啉和铁离子相结合，铁离子有抑制荧光作用，所以红细胞不发荧光。
如在血液中加酸使铁离子游离，或缺铁性贫血，红细胞可呈红色荧光；3、细胞内的脂褐素呈棕黄色的自发荧光，例如心肌细胞核两侧的肌浆内，随着年龄的增长或在某些疾病的情况下，可见较大量的棕黄色脂褐素荧光颗粒；4、某些肿瘤细胞在紫外或蓝光激发可呈现明显的自发荧光，可作原位肿瘤的早期诊断；5、维生素A呈绿色的自发性荧光。
如大鼠食入维生素A后，在肝细胞、Kuffer细胞、肾上腺束状带细胞、肺和肾的间质细胞、卵巢间质细胞和黄体细胞等的胞质内均可见到维生素A的绿色荧光；6、某些药物也可呈现一定颜色荧光，如奎宁为绿色荧光，四环素为黄色荧光。
四环素能与骨基质中的钙结合，利用这一特性，可以用四环素饲养动物以观察新骨质的形成。
另外，四环素和癌细胞有较大的亲合力，能在恶性肿瘤内形成黄色的荧光灶；7、有机体的单胺神经原、消化道和呼吸道粘膜内神经内分泌细胞中的内源性生物胺—儿茶酚胺、5-羟色胺和组织胺等与某些醛类物质在一定条件下可发生缩合反应而呈现荧光。
醛和儿茶酚胺（多巴胺、去甲肾上腺素和肾上腺素）缩合可产生亮黄绿色荧光，和5-羟色胺及组织胺缩合后呈现黄色荧光。
该方法可显示脑干中单胺神经元胞体内、神经纤维中、消化道呼吸道粘膜的内分泌细胞中的去甲肾上腺素和5-羟色胺，以及交感神经末梢内含量低至5X10-10g的去甲肾上腺素。
共聚焦显微镜生物学相关荧光样品制备Dr Lijun Wu Leica / Shanghai 23/6/2014免疫荧光组化技术是根据抗原—抗体反应的原理，小鼠耳部真皮层免疫荧光染色绿色：示CCL21（淋巴细胞区划因子）红色a：示Perlecan（基底膜蛋白多糖）红色b：示Coll IV（IV型胶原）青色：TRITC-dextr（TRITC-葡聚糖）30线粒体探针MitotrackerCellular LocalizationCalculation for Fura-IndicatorsD.J. Linden, Purkinje neuronFura-2共聚焦显微镜生物学相关荧光样品制备Dr Lijun Wu Leica / Shanghai 23/6/2014Calcium Green-1笼锁化合物探针(解笼锁，uncage)笼锁化合物全称为光不稳定笼锁化合物，是人工使用掩蔽基团修饰生物活性分子而合成的无荧光前体化合物。
当该物质被强光照射后，两基团之间的共价键解离而释放出活性分子，这个过程称为解笼锁。
荧光染料是否发射荧光或荧光的强弱，主要决定于该染料的分子结构。
同时，与它所处的环境及其状态也有密切关系。
如染色液的pH值、浓度和染色时的温度以及缓冲液离子浓度等。
绿色荧光蛋白小鼠•GFP可以作为唯一的工具，在活细胞内监测基因表达和蛋白质定位。
•由于GFP由生物发光蛋白组成，水母蛋白（Ca共聚焦显微镜生物学相关荧光样品制备Dr Lijun Wu Leica / Shanghai 23/6/2014of fluorescence microscopy changed dramatically withof fluorescent proteins in the1950s.The starting pointdetection of the jellyfish Aequorea victoria green fluorescentby Osamo Shimomura.Hundreds of GFP mutants later,荧光蛋白The FP beachR.Tsien 2009 Nobel lectureCyan (CFP)Y66W Green (GFP)S65T Yellow (YFP)S65G, T203YRed (d.s.RFP)共聚焦显微镜生物学相关荧光样品制备Dr Lijun Wu Leica / Shanghai 23/6/2014A: EGFP-fluorescence in endosomes ofVero cellsB: Immunostaining against endosomalmarker EEA1, cy5-conjugated secondaryabLijun Wu Leica / Shanghai 23/6/2014共聚焦显微镜生物学相关荧光样品制备Dr Lijun Wu Leica / Shanghai 23/6/2014法，磷酸钙法，电穿孔法，脂质体法各有利弊，其主要原理及应用特点见下表：共聚焦显微镜生物学相关荧光样品制备Dr Lijun Wu Leica / Shanghai 23/6/2014GFP´s as Sensor Molecules共聚焦显微镜生物学荧光新技术吴立君博士徕卡显微系统南京大学23/6/2014共聚焦显微镜生物学相关荧光样品制备Dr Lijun Wu Leica / Shanghai 23/6/2014No Color Correction in IR HC PL IRAPO 40x/1.10 W CORR 405 nm488 nm633 nm5 µm Leica HC PL APO 40x/1.30 Oil CS2STEDColocalization FCSLive Cell Fast Imaging OPO + Ti:Sa Electrophysiology Deep Tissue Imaging CARS UV ExcitationPhase Contrast ＆DICMitoTracker LysoTrackerAnti-Calnexin TubulinGM-130Phalloidin Hoechst 33258EEA1DAPIOrganelle markersActinPIEREarly EndosomeSynaptogyrinsynaptic vesicles are complicatedTakamori et al. 2006 Cell 共聚焦显微镜生物学相关荧光样品制备Dr Lijun Wu Leica / Shanghai 23/6/2014共聚焦显微镜生物学相关荧光样品制备Dr Lijun Wu Leica / Shanghai 23/6/2014共聚焦显微镜生物学相关荧光样品制备Dr Lijun Wu Leica / Shanghai 23/6/2014荧光样品染色•免疫荧光细胞化学法•荧光探针•荧光蛋白基因转染用于体内标记的荧光探针•量子点法共聚焦显微镜生物学相关荧光样品制备Dr Lijun Wu Leica / Shanghai 23/6/2014共聚焦显微镜生物学相关荧光样品制备Dr Lijun Wu Leica / Shanghai 23/6/2014•GFP可以作为唯一的工具，在活细胞内监测基因表达和蛋白质定位。
•由于GFP由生物发光蛋白组成，水母蛋白（Ca 绿色荧光蛋白小鼠荧光蛋白R.Tsien 2009 Nobel lecture The FP beachLijun Wu Leica / Shanghai 23/6/2014共聚焦显微镜生物学相关荧光样品制备Dr Lijun Wu Leica / Shanghai 23/6/2014共聚焦显微镜生物学相关荧光样品制备Dr Lijun Wu Leica / Shanghai 23/6/2014QuantitationMeasure averagefluorescence intensitiesin regions of interests.BleachTotalBg 共聚焦显微镜生物学相关荧光样品制备Dr Lijun Wu Leica / Shanghai 23/6/2014共聚焦显微镜生物学相关荧光样品制备Dr Lijun Wu Leica / Shanghai 23/6/2014共聚焦显微镜生物学相关荧光样品制备Dr Lijun Wu Leica / Shanghai 23/6/2014PA-GFP and HcRed cotransfected NRK cells Courtesy: P. Lenart, Ellenberg group, EMBL, Heidelberg, Germany 光诱导变色荧光蛋白KEADE目前已经从珊瑚虫和海葵中提取和开发出了许多有应用潜力的光学指示剂。
其中一个非常重要的是Kaede蛋白，受紫外激发后这种蛋白会产生从绿色到红色的光转化。
光转化后，红/绿比会显著增加约2000倍（红增、绿减）。
这一类具有独特颜色转换特性的光学指示剂会成为亚细胞器乃至整个细胞光学标记的最佳选择。
共聚焦显微镜生物学相关荧光样品制备Dr Lijun Wu Leica / Shanghai 23/6/2014HEp-2 cells (Hemmerich, Jena, Germany)(aCBP/p300, aRNA-polymerase II, DAPI)Zebrafish (Bastmeyer, Konstanz, Germany) (Two different neuronal markers)HEK cells (Böhmer, Jena, Germany) (free GFP, YFP_SHP1 fusion)??Provided the general theoretical framework for FRET applications.In 1946he proposed a mathematical law for dependence of fluorescence decay of donor (D)on the concentration of an acceptor (A),assuming a dipole-dipole interaction in solution (Naturwissenschaften 6:166-175)founded onFöster Resonance 1912non-radiationless 共聚焦显微镜生物学相关荧光样品制备Dr Lijun Wu Leica / Shanghai 23/6/2014Lijun Wu Leica / Shanghai 23/6/2014共聚焦显微镜生物学相关荧光样品制备Dr Lijun Wu Leica / Shanghai 23/6/2014FRET in action 共聚焦显微镜生物学相关荧光样品制备Dr Lijun Wu Leica / Shanghai 23/6/2014共聚焦显微镜生物学相关荧光样品制备Dr Lijun Wu Leica / Shanghai 23/6/2014Preconditions for FRET AnalysisSpecific staining of the molecule (protein) of interestFluorochromeAny of various fluorescentsubstances used influorescence microscopy to共聚焦显微镜生物学相关荧光样品制备Dr Lijun Wu Leica / Shanghai 23/6/2014 FRET WIZARD共聚焦显微镜生物学相关荧光样品制备Dr Lijun Wu Leica / Shanghai 23/6/2014共聚焦显微镜生物学相关荧光样品制备Dr Lijun Wu Leica / Shanghai 23/6/2014道的一种直(multicolor BiFC)不合体的形成，间产目前，蛋白蛋白较究工作上共聚焦显微镜生物学相关荧光样品制备Dr Lijun Wu Leica / Shanghai 23/6/2014Figure 6. From: BIMOLECULAR FLUORESCENCE COMPLEMENTATION (BiFC) ANALYSIS AS A PROBE OF PROTEIN INTERACTIONS IN LIVING CELLS. Concurrent visualization of multiple protein complexes using multicolor fluorescence complementation analysis. (a) Two alternative interaction partners, A and B, are fused to fragments of different fluorescent proteins (YN155 and CN155 respectively). These fusions are cells with a shared interaction partner, Z, fused to a complementary fragment (CC155). Complexes formed by A-YN155 and Z-CC155 can be distinguished from complexes formed by B-CN155 and Z-CC155 based on their fluorescence spectra. (b) Schematic representation of the visualization of multiple protein complexes in the same cell (A-YN155-Z-CC155, cytoplasmic and perinuclear; B-CN155-Z-CC155, nuclear and Tom K. Kerppola. Annu Rev Biophys. Annu Rev Biophys;37:465-487.共聚焦显微镜生物学相关荧光样品制备Dr Lijun Wu Leica / Shanghai 23/6/2014TCS SP8 SMD Series• A platform that integrates the confocal system TCS SP8 with SMD specific components from Picoquant•Used for FLIM, FLIM-FRET, FCS, FCCS, gated FCS, FLCS, and FLCCSLeica TCS SP8SMD specific componentsconfidentialLifetime dependency on local ion concentration or pHConventional confocal intensity image Fluorescence lifetime image of cells expressing CFP-YFPCourtesy: G. Hams, University of WürzburgBiological heterogeneity of FRET cells (CFP-YFP fusion), Courtesy: G. Hams, University of WürzburgFLIM image of scale insect antenna (non-stained):Image was reconstructed from a 3-dimensional FLIM-z-stack,Courtesy of Kees Jalink共聚焦显微镜生物学相关荧光样品制备Dr Lijun Wu Leica / Shanghai 23/6/2014较短的IRF 保证可靠的FLIM-FRET 数据Sample: fixed cells with GFP or GFP-mCherry FRET construct, excitation @ 900 nm, detection @ 500-550nm, FRET efficiency = 31%Courtesy: Corentin Spriet, Imaging Center Lille, Franceconfidential共聚焦显微镜生物学相关荧光样品制备Dr Lijun Wu Leica / Shanghai 23/6/2014白激光高图像反差的光闸技术从470-670nm的自由可调激发波长（1nm步进）高达同时8条可调谱线，3万亿个独特组合›2D激发－发射扫描的综合光谱图像›应用于FLIM和gSTED的脉冲激发光源›利用自由光谱开发新的图像策略共聚焦显微镜生物学相关荧光样品制备Dr Lijun Wu Leica / Shanghai 23/6/2014Picosecond Laser at 1060 nmSeed SourcePumpPower AmplifierSupercontinuum FiberSupercontinuum GenerationSupercontinuum Fiber (cross section)WLL -Supercontinuum Laser ConceptTCSPC -T ime C orrelated S ingle P hoton C ounting+ good time resolution!+ high sensitivity!0 13 15 18 20 28 40 100 2200 s 100 s 190 s250 s共聚焦显微镜生物学相关荧光样品制备Dr Lijun Wu Leica / Shanghai 23/6/2014SP8X FLIM: Excitation at variable wavelength1.9 ns3.0 nsABCSample: fixed cells with triple staining:GalNacT2_GFP (golgi), LAMP-546 (endosomes), Calnexin 594 (ER).A: 486 nm, B: 542 nm, C: 594 nmSample: courtesy of Matthias Weiss, Cellular Biophysics Group,Bioquant, Heidelberg, Germany.The FLIM measurements at different excitation wavelengths (A: 486 nm, B: 542 nm, C: 594 nm show specific fluorescence lifetimes of the three 共聚焦显微镜生物学相关荧光样品制备Dr Lijun Wu Leica / Shanghai 23/6/20141.9 ns3.0 ns ABCλ2 plot: The three fluorescence peaksrepresent the three labels: GalNacT2_GFP(golgi), LAMP-546 (endosomes), Calnexin594 (ER).。