细胞培养液的配制
细胞培养过程中的注意事项及试剂配制
20ug/ml内皮生长因子，
注意事项：
1.配制溶液时必须用新鲜的蒸馏水。
2.安装蔡式滤器时通常使用孔径0.45微米和0.22微米滤膜各一张，放置位置为0.45的位于0.22微米的滤膜上方，并且要特别注意滤膜光面朝上。
4.实验后灭菌：用75％酒精（3‰新洁尔灭）擦拭超净台、边台、倒置显微镜的载物台。
实验人员的无菌准备：
1.肥皂洗手。
2.穿好隔离衣、带好隔离帽、口罩、放好拖鞋
3.用75％酒精棉球擦净双手。
无菌操作的演示：
1.凡是带入超净工作台内的酒精、PBS、培养基、胰蛋白酶的瓶子均要用75％酒精擦拭瓶子的外表面
2.靠近酒精灯火焰操作。
5.烘干、包装：洗干净后先烘干，然后用牛皮纸（油光纸）包装。
6.高压消毒：包装好的器皿装入高压锅内盖好盖子，打开开关和安全阀，当蒸气成直线上升时，关闭安全阀，当指针指向15磅时，维持20-30分钟。
7.高压消毒后烘干
(2)旧的玻璃器皿的洗消：
1．刷洗、烘干：使用过的玻璃器皿可直接泡入来苏尔液或洗涤剂溶液中，泡过来苏尔溶液（洗涤剂）的器皿要用清水刷洗干净，然后烘干。
一般培养液中谷氨酰胺的含量为1～4mmol/L。可以配制200mmol/L谷氨酰胺液贮存，用时加入培养液。配制方法为，谷氨酰胺2.922g溶于三蒸水加至100ml即配成200mmol/L的溶液，充分搅拌溶解后，过滤除菌，分装小瓶，-20℃保存，使用时可向100ml培养液中加入1ml谷氨酰胺溶液。
(9).肝素溶液的配制：
0.1％Ⅰ型胶原酶溶液同胰蛋白酶一样配制和消毒灭菌。注意：因为Ⅰ型胶原酶分子颗粒比胰酶大，不容易过滤，因此可以用蔡式滤器过滤除菌。分装入10ml小瓶-20℃保存。
各种培养液的配方
各种培养液的配方培养液是一种专门设计用于细胞培养的营养基质，它提供了细胞所需的营养物质和生长因子，以支持细胞的生长和增殖。
不同类型的细胞和细胞培养的特定目的可能需要不同的培养液配方。
以下是几种常见的细胞培养液配方：1. DMEM（Dulbecco's Modified Eagle Medium）：配方：- Glucose: 4.5g/L- L-Glutamine: 4mM- Sodium Bicarbonate: 3.7g/L- Sodium Pyruvate: 110mg/L- Phenol Red: 0.1%备注：DMEM是一种基础培养液，广泛用于多种哺乳动物细胞的培养，提供了细胞所需的基本营养物质，如糖、氨基酸和盐类。
2. RPMI 1640（Roswell Park Memorial Institute Medium）：配方：- Glucose: 2g/L- L-Glutamine: 2mM- Sodium Bicarbonate: 2g/L-HEPES:10mM- Phenol Red: 0.1%备注：RPMI 1640是一种适用于多种动物和人类细胞培养的基础培养液，具有类似DMEM的配方，但Glucose和L-Glutamine的浓度较低，适合一些特定的细胞类型。
3. MEM（Minimum Essential Medium）：配方：- Glucose: 1g/L- L-Glutamine: 2mM- Sodium Bicarbonate: 2.2g/L-HEPES:15mM- Phenol Red: 0.1%备注：MEM也是一种通用基础培养液，适用于多种细胞类型的培养，其配方与DMEM相似，但含有更低浓度的糖。
4. F-12（Ham's F-12 Nutrient Mixture）：配方：- Glucose: 3.15g/L- L-Glutamine: 2mM- Sodium Bicarbonate: 1.17g/L- Phenol Red: 0.03%备注：F-12是一种含有丰富营养物质的培养液，特别适用于培养多种优质的细胞系。
细胞培养液的配制
关于R P M I1640细胞培养液的配制1) 配制培养基最好使用新制备的三蒸水。
一般在试验前当天或前一天制备为好。
调节pH值的酸碱溶液也应该使用这种水配制。
2) 制备培养基的器皿清洗要绝对干净，烤干后备用（滤器、滤膜、量筒、移液管及盛放培养基的小瓶等存放和转移培养基液体的器具都应进行灭菌）。
3) 溶解培养基：将干粉培养基溶于总量1/3的水中，再用水洗包装袋内面两次，倒入培养液中。
振荡或超声助溶，一般不要加热助溶。
4) 补加试剂：根据包装袋说明和试验需要加入NaHCO3（2.0g）、谷氨酰胺、丙酮酸钠、HEPES等其他试剂。
5) 加抗生素：一般抗生素终浓度为――青霉素100U/ml，链霉素100U/ml。
市售青霉素为80万U／瓶，可溶于4ml体积，每一升培养液中加即可。
市售链霉素为100万U／瓶，可溶于5ml体积，每一升培养液中也加即可。
无链霉素的情况下，用庆大霉素代替，终浓度调为50～200U/ml。
6) 调pH值：加水到900ml（在需要加10％小牛血清的情况下），然后用5％ NaHCO3调节pH到。
7) 过滤除菌：宜采用和滤膜各一张，上层为，下层为，以保证过滤效果。
注意滤膜正面（光面）朝上。
过滤后分装于小瓶中（100或200ml）。
8) 加小牛血清：根据培养基配制的量将小牛血清分装，冷冻保存（－20℃）。
临用前将加入小牛血清(10%~20%)。
【注意事项】每次配液时，需要的其他辅助性液体（Hanks，胰蛋白酶消化液，PBS，抗生素溶液等）也可以同时配制，分别过滤。
市售小牛血清使用前多应该灭活（56℃，30min），以消除补体活性。
动物血清个体差异大，故而每一批血清都进行严格检测，同时进行无菌试验。
优质血清应该为淡黄色，透明，无溶血，无沉淀，灭活后颜色稍深。
生化检测总蛋白含量~4.5g/100ml，球蛋白不高于2g／100ml。
选定一个效果较好的批号后，可一次多购该批号的血清，保证试验条件的稳定。
细胞培养液配制操作规程
细胞培养液配制操作规程
试剂和器材准备：
1. 用三角瓶装1L 超纯水，放入搅拌子，盖上铝箔纸，121摄氏度高压灭菌30分钟，冷却过夜。
2. 过滤器装好滤膜后用报纸包装好，121摄氏度高压灭菌30分钟。
3. 装培养液的试剂瓶瓶口用铝箔纸包好，140摄氏度烘烤3小时。
配制过程：
1. 将盛有灭菌超纯水的三角瓶放到磁力搅拌器上，搅拌速度以液面恰能产生漩涡为宜。
2. 打开干粉培养液的包装，将干粉慢慢加入容器，边加边搅拌
3. 往包装袋内加入适量的超纯水使残留的培养液粉末溶解并倾倒入三角瓶内，如此清洗数遍
4. 添加NaHCO3。
RPMI1640添加2.0g NaHCO3，DMEM添加3.7g NaHCO3。
5.搅拌约2小时待干粉完全溶解。
6. 用1N NaOH 和1N HCl调节培养液pH在
7.1～7.2，调节好pH后盖紧容器。
7. 加入5 mL 200×的PS双抗，搅拌均匀。
8. 0.22um微孔滤膜过虑除菌，分装到试剂瓶中，盖好瓶盖密封，4摄氏度保存。
使用前添加血清，使血清含量为10％。
未加血清的培养液可在4摄氏度保存8个月，加血清后应在1个月内用完。
9. 检验。
取过滤后的培养液3～5mL，置于无菌的35mm培养皿中，放入培养箱中培养两天，检查是否有长细菌。
注：
1. 过滤完毕后应及时把过滤器和试剂瓶清洗干净。
清洗过程：自来水冲洗，蒸馏水洗3遍，超纯水洗一遍，沥干，烘干
2. 本操作规程以配制1L为例，配制量多时各组分应等比例增加。
1。
培养用液的配制
实验一培养用液的配制、除菌与分装【实验目的】1. 掌握常见培养用液的配制方法。
2. 掌握常用的灭菌方法。
3. 了解每种培养用液的作用。
【实验原理】常用细胞培养用液包括磷酸盐平衡盐溶液（Phosphate Buffered Saline，PBS）、液体培养基、胰蛋白酶（Trypsin）和EDTA溶液。
PBS用于清洗细胞、配制胰蛋白酶和EDTA。
培养基含有细胞生长需要的各种营养元素，使用时通常还需填加血清和抗生素。
鱼类细胞培养的培养基常用种类是MEM 和L-15；用于动物的一般是DMEM和RPMI-1640。
胰蛋白酶可将贴壁的细胞从培养瓶壁上消化下来，通常使用浓度为0.25%或0.125%。
EDTA 用于清洗细胞表面，螯合Ca2+等二价离子，使细胞易于为胰蛋白酶消化。
细胞培养用的试剂必需是无菌的，PBS 和EDTA 可以采用高压灭菌，而培养基和胰蛋白酶溶液含生物活性物质，配制好后通过过滤除菌。
【试剂、材料与仪器】试剂：NaCl ；KCl；Na2HPO4；KH2PO4；EDTA；胰蛋白酶；HEPES；碳酸氢钠；MEM或PRMI-1640 培养基干粉；GPS材料：三蒸水，蒸馏水瓶，精密天平，药匙，称量纸，烧杯（250 mL、1000 mL），玻棒，精密pH 试纸（6.8-8.0），容量瓶（250 mL、1000 mL），一次性注射器，一次性过滤器，普镊，酒精灯，打火机，医用酒精，消毒纱布，酒精喷壶，已高压灭菌试剂瓶（500 mL、250 mL、100 mL），记号笔，标签纸，橡胶手套，移液管（5 mL、10 mL），封口膜仪器：超净工作台，加液枪，4℃冰箱【实验分组】实验分组进行，每组4人，每班20人，共分5组。
第1组配制PBS并高压灭菌，第2组配制胰蛋白酶溶液并过滤除菌和分装，第3组配制EDTA溶液并分装高压灭菌，第4组配制培养基，第5组过滤除菌培养基并分装。
每个实验小组需准备试剂有：胰酶50 mL；EDTA 50 mL；培养基90 mL（使用前加入10 mL血清）。
293细胞培养
293细胞培养1.培养基DMEM ++丙酮酸钠++10%血清++青链霉素2.复苏：（1）37度融化后，擦干冻存管酒精擦，细胞加入15ml离心管，加5ml培养基，500g离心5min，弃上清，加1ml培养基重悬后加入到培养瓶中，5~6ml左右，记得晃匀。
3. 传代吸出旧培基，加5mlPBS洗1-2遍，用移液管加1ml胰酶，滚2遍吸出，37度放1min左右计时，看到变圆即加入新培基吹打，几下就好了，分到新瓶里。
我个人认为：293细胞贴壁后形成圆形，可能是细胞本身状态不是很好，细胞不够饱满，细胞的贴壁后的棱角不易显露出来，所以看上去类似圆形，而且细胞较小。
293细胞是用5型腺病毒75株系转化，含有Ad5 E1区的人胚肾亚三倍体细胞系，是一种E1区缺陷互补细胞系。
它是加拿大McMaster University的F.L.Graham与ey 于1976年用DNA转染技术构建而成。
293细胞是贴壁依赖型呈上皮样细胞，表现出典型的腺病毒转化细胞的表型，细胞允许Ad5和其他血清型腺病毒在其上增殖。
哺乳细胞的大规模培养方式有三种：贴壁培养、微载体培养、无血清悬浮培养。
这三种方式均可用于293细胞的大规模培养。
293细胞在无Ca2+或含Ca2+培养基中可同样生长，也可生长在血清浓度降低的培养基中。
单层培养细胞在5-10％FBS-DMEM中能生长很好。
一般来讲，1:10传代后，一周可以长满。
严禁过度生长，这点很重要。
因为会导致细胞密度加大和堆积，影响病毒斑的形成和转染，传代时也不易打散。
悬浮的293细胞很容易大规模培养，但不容易长期保持稳定。
293细胞在传代120次以后，其表型可能改变，生长状况不再完全是单层的了，偶尔会形成局部的细胞成团聚集，应立即抛弃，重新引入新传代的细胞。
293细胞培养特性：1、293细胞明显适应酸性环境,pH值在6.9～7.1时,可顺利贴壁生长, 换液时动作要轻。
一般用高糖的DMEM培养基。
2、传代：倒去废液，PBS洗一次（轻），用0.02%EDTA与0.25%Trypsin消化，生长良好细胞，培养瓶中轻摇,使之流遍所有细胞表面,即将其吸除或弃去消化30s，然后吸去，再让剩下的EDTA/Trypsin作用30s,镜下观察细胞变圆,就可加DMEM终止消化，反复吹打至细胞全成单个悬浮细胞即可。
细胞培养液配制的流程
细胞培养液配制的流程
细胞培养液配制的流程：
①材料准备：
- 准备所需的所有化学试剂、培养基粉末、抗生素、血清、pH指示剂、无菌水或三蒸水。
②滤器消毒：
- 准备0.45μm和0.22μm孔径的滤膜，浸入三蒸水中，然后置于滤器上，打包后进行高压蒸汽灭菌。
③容器准备：
- 确保所有使用的容器（如烧杯、量筒、移液管等）都是干净且无菌的。
④溶解培养基：
- 将培养基粉末倒入无菌容器中，加入预热的三蒸水，使用磁力搅拌器充分搅拌直至完全溶解。
⑤添加补充成分：
- 按照实验需求，向溶解的培养基中加入nahco3、抗生素（如青霉素和链霉素）、L-谷氨酰胺等成分。
⑥加入血清：
- 如果配方需要，加入胎牛血清或其他类型的血清，通常为10%或20%体积比。
⑦ pH调节：
- 使用pH计检测溶液的pH值，根据需要加入1N HCl或1N NaOH进行调节，直至达到目标pH值。
⑧温度控制：
- 将配制好的培养液加热至接近细胞培养的温度（37°C左右），以防止温度骤变影响细胞。
⑨过滤除菌：
- 通过0.22μm孔径的滤器过滤培养液，以除去任何可能存在的微生物。
⑩分装：
- 将过滤后的培养液转移到无菌的细胞培养瓶或培养皿中，避免空气中的微生物污染。
⑪标记与记录：
- 在容器上标记培养液的类型、批号、配制日期以及有效期，并记录所
有操作细节。
⑫储存：
- 将配制好的培养液储存在适当的温度下，通常是4°C，直到使用前再恢复至室温或培养温度。
细胞培养相关常用液体配制标准SOP操作规程样本
细胞培养相关常用液体配制标准SOP操作规程样本（一）胰酶的配制：（浓度为1‰，1L）1、认真清洗配制容器，自来水20遍，去离子水5遍，超纯水润洗3遍。
2、称取牛胰蛋白酶1.0g；EDTA 2 g；3、用超纯水溶解；4、磁力搅拌器搅拌至胰酶完全溶解，溶液变得澄清；5、超纯水定容至1L；6、不锈钢滤器加0.22um滤纸两张高温灭菌后，在超净工作台过滤；7、在血清瓶中加入少量滤好的胰酶，置于细胞培养箱中检测是否染菌，其余置于4℃待用；8、过滤后洗净滤器再次灭菌，避免残留的胰酶降解蛋白。
（二）DMEM配制：1、所需试剂及材料：试剂：DMEM干粉（GIBCO 10L）、超纯水（Milli-Q）、Na2CO3 （Sigma）材料：10L玻璃瓶、500ml盐水瓶（灭菌）、0.22um滤膜、滤器（事先放好两层滤膜并高压灭菌）、磁力搅拌器大号搅拌子蠕动泵胶塞2、操作步骤：(1)10L玻璃瓶洗涤，自来水20遍，去离子水5遍，超纯水润洗3遍。
(2)在10L玻璃瓶中加入超纯水9.5L，将DMEM干粉倒入，在磁力搅拌器上搅拌溶解。
(3)按照3.7g/L 加入Na2CO3 。
(4)调节pH值至7.2~7.4。
(5)过滤分装，并注明名称及配制日期。
此过程注意无菌操作！(6)最后用血清瓶取10ml左右置于细胞培养箱中检测是否染菌。
(7)清洗滤器，10L玻璃瓶，软管，将所有实验器具归位。
（三）1640、MEM培养基的配制同上，Na2CO3的用量见包装说明（四）细胞间100×双抗（青霉素、链霉素）的配制青霉素及链霉素配制的终浓度为1万单位/毫升。
配制的步骤以400ml为例：1.认真清洗配制容器，自来水20遍，去离子水5遍，超纯水润洗3遍。
2.准备5瓶青霉素（80万单位/瓶）、4瓶链霉素（100万单位/瓶）。
3.加入1-2ml细胞间专用PBS进入青霉素、链霉素的瓶子内，浸泡后吹吸数次至全部溶解，溶解后的液体吸入配制容器内。
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培养基的选择 依据: 经验、文献、尝试 常用: RPMI1640、DMEM
培养基的来源 市售干粉培养基---自己配制 液体培养基---直接使用(注意有效期)
培养基的除菌方法
过滤除菌: (1) 正压过滤---效率高 (2) 负压过滤---效率低
高压蒸气灭菌: 不含谷氨酰胺，灭菌后另外添加
霉菌污染方可使用
注意事项
谷氨酰胺在溶液中很不稳定，４℃，７ｄ分解５ ０％，放置两周以上时，根据需要添加谷氨酰胺。 配制１００×母液（200 mmol/L, 即 29.22g/L）, 每100ml加入0.5－2 ml母液，终 浓度1－4 mmol/L
抗生素在37℃稳定性维持3－4d, 可控制轻度污 染。防污染重在无菌操作
将浸气消毒
3.液体配制
① 将培养粉倒入容器中
②加入新鲜制备的三蒸水磁力搅拌器充分搅拌
③按照实验的具体要求分别加入 NaHCO3和青链霉 素（青霉素100U/mL：80万U溶至4ml三蒸水, 取0.5ml；
链霉素100U/mL：100万U溶至5ml三蒸水, 取0.5ml)
④按要求加入一定比例的 血清（血清一般需经 56℃，30min灭活）
例如: 配制含10%胎牛血 清的RPMI1640培养液 1升，应加入 无血清培养液900ml 灭活胎牛血清100ml
⑤加入1N HCl约3mL,调整pH至7.2－7.4
磁力搅拌器充分 搅拌
准备过滤
⑥ 无菌条件下装好滤器，检查气体以及液体管道是否通畅。 (一般使用氧气。注意气压适当, 防止滤膜破裂，)
将 液 体 倒 入 无 菌 滤 器 ， 接 通
气 体
⑦过滤后的液体分装 于贮液瓶
分装过程严格无菌操作
分装后的液体贮存于 4℃，2周内用完。
(5) 按 要 求 加 血 清 （ 血 清 一 般 需 经 56℃ ， 30min灭活） 例如: 10%胎牛血清 无血清培养液 900ml 灭活胎牛血清 100ml
(6) 正压过滤除菌 (气压适当, 防止滤膜破裂) (7) 分装,贮存于4℃，2周内用完。 (8) 无菌试验: 取样, 37℃放置24－72h, 无细菌、
培养液配制过程 （以RPMI1640为例）
1. 物品准备
(1）滤器、 微孔滤膜、磁力搅拌器、天平、烧杯、 量筒、pH计、贮液瓶等。
(2) 培养粉、 NaHCO3、 1N HCl、青霉素、链霉 素、血清、新鲜制备的 三蒸水
2. 滤器消毒准备
取孔径为0.45μm和0.22μm滤膜各一张，浸入三蒸水 中
消毒物品 滤器中放置0.45μm和0.22μm滤膜, 包装, 高压 蒸气消毒
配制步骤
(1) 10.4g/包培养粉溶至1L三蒸水中, 磁力搅 拌20min
(2) 加2g NaHCO3/L, 继续搅拌10min (3) 加青霉素100U/mL(80万U溶至4ml三蒸
水, 取0.5ml) 链霉素100U/mL(100万U溶至5ml三蒸水, 取0.5ml)) (4) 加1N HCl约3mL, 调pH至7.2, 继续搅拌
培养基附加成分的添加
按使用说明或实验要求添加 配制时加: 碳酸氢钠、抗生素、血清等 临用前加: 生物活性因子如EGF、FGF、NGF、 PDGF等
RPMI1640培养液配制过程
准备物品 (1) 不锈钢过滤器, 滤膜(0.45μm,0.22μm),磁力 搅拌器,天平,烧杯,量筒,盐水瓶 (2) 培养粉,1N HCl,NaHCO3,青霉素,链霉素,胎 牛血清,新鲜三蒸水