Northern印迹杂交技术教案资料
Northern-Blot印迹杂交
10 X Buffer, Sephadex G-50,SDS，双
氧水, 灭菌水等。
2021/10/10
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四、实验步骤
1. 用具的准备：180度烤三角锥瓶、量筒、镊子、
刀片等4h；清洗梳子和电泳槽，并用双氧水浸 泡过夜，用DEPC (diethypyrocarbonate，焦碳酸 二乙酯) 水冲洗，干燥备用；处理DEPC水(2 L) 备用
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三、实验材料
1、仪器 恒温水浴箱，电泳仪，凝胶成像系统，真空
转移仪，真空泵，UV 交联仪，杂交炉，恒温摇 床，脱色摇床，漩涡振荡器，分光光度计，微量 移液器，电炉（或微波炉），离心管，烧杯，量 筒，三角瓶等。
2、材料
总RNA样品或mRNA样品，探针模板DNA(25
ng)，尼龙膜
② 95 ℃加热3 min后，迅速放置于冰冷却5 min。
③在离心管中按下列顺序加入以下溶液：
10×Buffer
2.5 μl
dNTP Mixture
2.5 μl
111 TBq/mmol[a-32P]dCTP 5 μl
Exo-free Klenow Fragment 1 μl
混匀后（25ul），37 ℃下反应30 min。短暂离 心，收集溶液到管底。
② 连接真空泵和真空转移仪，剪取一块适当大小 的膜，在Transfer buffer 浸湿 5 min后，放置在 多孔渗水屏的适当位置。
③ 盖上塑胶屏，盖上外框，扣上锁，将胶的多余 部分切除，切后的胶四边缘要能盖过塑胶屏孔， 并至少盖过边缘约2mm，以防止漏气。
④ 将胶小心放置在膜上，膜与胶间不能有气泡。
NorthernBlot
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Northern杂交试验指导手册
Northern杂交试验指导手册Northern杂交试验指导手册DIG标记的Northern杂交试验指导一、 RNA提取方法一、改良异硫氰酸胍提取法试剂及其配制异硫氰酸胍变性液：贮存液－在含484ml 水（经DEPC处理）, 17.6ml 0.75mol/L柠檬酸钠（pH7.0）和26.4ml10%Sarkosyl的溶液中加入250g异硫氰酸胍，加热至60~65℃并持续搅拌使之充分溶解。
贮存液室温保存备用（不超过3个月）。
工作液－在每50ml贮存液中加入0.35ml2-ME即配制成工作液。
工作液于室温下保存不超过1个月。
工作液各成分的终浓度为：4mol/L异硫氰酸胍25mol/L柠檬酸钠pH 7.00.5%(w/v)N-十二烷基肌氨酸(Sarkosyl)0.1mol/L巯基乙醇(2-ME)其它溶液：2mol/L乙酸钠 (NaAc) 缓冲液 (pH 4.0)水饱和酚（pH 3.5）49∶1 (v/v) 氯仿/异戊醇100%异丙醇70%乙醇（用DEPC处理水配制）DEPC处理后高压灭菌水试验程序1．取0.5~1g左右新鲜植物组织置于研钵中，加入液氮，迅速研磨成均匀的粉末。
2．将粉末全部移入冰上预冷的离心管中，并向其中加入5ml异硫氰酸胍变性液，轻轻摇动离心管使混合均匀。
3．顺序加入2mol/l NaAc 0.5ml、水饱和苯酚5ml、氯仿/异戊醇1ml，每加入一种试剂都轻轻摇动离心管混合均匀，最后将离心管盖紧，倒转几次混合均匀，冰浴15min.。
4．4℃条件下15000g离心30min.，将上层水相转移至另一干净的离心管中，并加入等体积的异丙醇，混匀后置于－20℃冰箱冷冻1h.。
5．4℃条件下13000g离心25min.，小心去除上清液，沉淀溶于1.5ml异硫酸胍变型液中（体积为第一次变性液的1/3），再加入等体积的异丙醇，混匀后置于－20℃冰箱冷冻1h.。
6．4℃条件下13000g离心20min.，沉淀用70%乙醇洗一次，晾干后溶于适量体积（50μg/100μl）的DEPC处理水中，检测后分装，置于－70℃低温条件下保存。
Northern印迹杂交技术
5.酶联免疫染色 5.酶联免疫染色
• 室温，用缓冲液Ⅰ洗膜 1-5 min，缓冲液 室温，用缓冲液Ⅰ min， min，再用缓冲液Ⅰ Ⅱ洗膜 30 min，再用缓冲液Ⅰ洗膜 1-5 min。 min。 • 用缓冲液Ⅰ稀释抗体缓冲液（1：2000）， 用缓冲液Ⅰ稀释抗体缓冲液（ 2000）， 稀释后的抗体溶液在4℃只能稳定12 h。 4℃只能稳定 稀释后的抗体溶液在4℃只能稳定12 h。室 温下将膜在抗体稀释液中浸泡30 min。 温下将膜在抗体稀释液中浸泡30 min。 • 缓冲液Ⅱ洗膜2次，每次15 min，以除去未 缓冲液Ⅱ洗膜2 每次15 min， 结合的抗体复合物。再用20 mL缓冲液 缓冲液Ⅲ 结合的抗体复合物。再用20 mL缓冲液Ⅲ平 衡膜2 min。 衡膜2-5 min。
• Northern 杂交是用于RNA定量和定性分析的常用 杂交是用于RNA RNA定量和定性分析的常用 技术，它是将RNA RNA分子从电泳凝胶转移到硝酸纤维 技术，它是将RNA分子从电泳凝胶转移到硝酸纤维 素滤膜或其他化学修饰的活性滤纸上， 素滤膜或其他化学修饰的活性滤纸上，再进行核 酸分子杂交的一种实验方法。 酸分子杂交的一种实验方法。 • 可以鉴定总RNA或poly(A)+RNA样品中同源RNA的存 可以鉴定总RNA RNA或 RNA样品中同源RNA的存 样品中同源RNA 在与否、测定样品中特定mRNA分子的大小和丰度， mRNA分子的大小和丰度 在与否、测定样品中特定mRNA分子的大小和丰度， 是分子生物学中研究基因表达在转录水平上的调 节以及cDNA合成的重要手段。 节以及cDNA合成的重要手段。 cDNA合成的重要手段
浸泡在 250 ml tris*NaCI 室温、 室温、30r/min 30min。 。
Northern blot技术
Northern杂交试验指导手册－Northern 印迹杂交A．探针准备DIG标记的RNA探针与DNA探针相比，显示较强的杂交信号和较地的非特异性背景，因此，只要可能选用RNA探针可以比DNA探针获得更好的杂交结果。
如果必须使用DNA探针，建议使用高SDS杂交缓冲液或DIG Easy Hyb以减少背景。
在正式杂交试验之前，优化杂交探针浓度是避免颜色背景所必须的。
探针浓度的确定可通过模拟杂交进行。
取一小片空白膜，将其浸入不同探针浓度的溶液中（如：1μl/ ml、3μl/ ml、5μl/ ml …），可观察到背景颜色的浓度即可作为杂交探针浓度。
在采用荧光检测或采用CSPD 化学发光检测时，建议试验探针浓度50－100ng/ml，如果采用CDP-Star化学发光检测，由于灵敏度很高，在此探针浓度下会产生很高的背景，因此，要适当降低探针浓度。
B. 印迹条件对于1%的变性琼脂糖胶向尼龙膜上印迹转膜，在10×和20×的SSC盐浓度下可以获得相同的结果，转膜时间是在4℃或室温下过夜。
C. 试剂及其配制MOPS缓冲液（10×）: 200mmol/L MOPS ( pH 7.0 )50mmol/L NaAc10mmol/L EDTA上样染料：50%甘油，1mmol/L EDTA，0.4%溴酚蓝，0.4%二甲苯蓝甲醛（37%溶液，13.3mol/L）染液：0.5mol/L NaAc(pH 5.2)中含0.04%的亚甲蓝甲酰胺（去离子）70%乙醇SSC(20×)：3mol/L NaCl (175g/L)0.3mol/L 柠檬酸三钠•2H2O (88g/L)用1mol/L HCl调整至pH 7.0Denhardt溶液（100×)：10g Ficoll 400 + 10g PVP + 10g BSA(Penta x组分V)用DSPC处理水溶解，定容至500ml，过滤后分装成每份25ml于-20℃保存。
northern印迹法原理和流程
northern印迹法原理和流程英文回答：The Northern Blot technique is a widely used method for detecting the presence of a specific RNA molecule in a sample. The principle behind this technique is to separate RNA molecules based on their size using gel electrophoresis and then transfer them onto a membrane for hybridization with a labeled probe. The labeled probe will bind to the specific RNA molecule of interest, allowing for its detection and quantification.The Northern Blot technique involves several key steps. First, RNA is extracted from the sample of interest, typically using a method such as phenol-chloroform extraction. The extracted RNA is then separated by size using gel electrophoresis, which involves applying an electric field to the gel matrix to separate the RNA molecules based on their size. The separated RNA molecules are then transferred from the gel onto a membrane,typically a nylon membrane, through a process called capillary or vacuum transfer.After the transfer, the membrane is cross-linked to immobilize the RNA, making it available for hybridization with a labeled probe. The labeled probe is a single-stranded DNA or RNA molecule that is complementary to the target RNA of interest. This probe is typically labeled with a radioactive or fluorescent tag for detection. The membrane is then incubated with the labeled probe, allowing it to hybridize specifically to the target RNA molecule.Following hybridization, the membrane is washed to remove any unbound probe, and then it is exposed to X-ray film or scanned using a fluorescent scanner to visualize the labeled RNA molecule. The intensity of the signal on the film or scanner corresponds to the abundance of the target RNA molecule in the original sample.Overall, the Northern Blot technique provides a valuable tool for studying gene expression and RNA abundance in biological samples.中文回答：北方印迹法是一种用于检测样本中特定RNA分子存在的常用方法。
Northern杂交实验
b)在可见光下用黄色滤光片对染色的膜照像。
c)照像后，将膜放入0.2×SSC和1%（m/v）SDS中室温脱色15min。
注：用适宜的方法将RNA固定在膜上后，可直接进行杂交，也可用锡箔纸或滤纸宽松包装，真空下储存于室温。
总RNA的甲醛凝胶电泳、变性RNA的转膜及固定。
A：在含有甲醛的琼脂糖凝胶上进行的RNA电泳
方法采用萨姆布鲁克《分子克隆实验指南》第三版。
注：可加入溴化乙锭在甲醛凝胶中
试剂：溴化乙锭（用DEPC处理的水配制）
甲醛37%--40%
甲酰胺
试剂：
10×甲醛凝胶电泳加样缓冲液
50%甘油
10 m mol/L EDTA(Ph8.0)
转移膜的准备
5、用新的解剖刀或切纸刀裁一张长宽均大于胶1MM的尼龙膜。
6、将尼龙膜漂浮在去离子水表面直至滤膜从下往上全部湿透，然后将膜侵入10×SSC中至少5分钟，用干净的解剖刀切去滤膜一角，使其与凝胶的切角相对应。
转移系统的安装和RNA转移
7、将胶倒转后置于平台上滤纸的中央，确保厚滤纸和胶之间没有气泡滞留。
含1%SDS的0.2*SSC
20*SSC：
在800mL水中溶解175.3g NaCL和88.2g柠檬酸钠，加入数滴10mol/L NaOH溶液调pH值至7.0，加水定容至1L，分装后高压灭菌。
转移缓冲液：
碱性转移至带正电荷的膜：用0.01mol/L NaOH和3mol/L NaCL
中性转移至不带电荷的膜：用20*SSC
50×TAE：242克Tris碱，57.1 ml冰乙酸，100 ml 0.5M EDTA(Ph8.0)，定容至1000ml
Northern Blot 实验 Protocol
Northern Blot（Northern印迹杂交）是一种用于检测RNA表达水平的方法，它通过将RNA从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维素膜上，然后与特定基因互补配对的探针进行杂交，从而检测目的片段。
实验原理：Northern Blot利用了RNA的分子量大小不同，通过电泳方法将其按照大小分离，然后转移至硝酸纤维素膜上。
探针与特定的基因互补配对，当探针与目标RNA片段杂交时，可以检测到特定基因的表达情况。
所需试剂和耗材：1.RNA样品或mRNA样品。
2.探针模板DNA。
3.尼龙膜。
4.NorthernMax Kit（Cat. # 1940,Ambion, Inc.）等试剂。
实验仪器：1.恒温水浴箱。
2.电泳仪。
3.凝胶成像系统。
4.真空转移仪和真空泵。
5.UV交联仪。
6.杂交炉。
7.恒温摇床。
8.脱色摇床。
9.漩涡振荡器。
10.分光光度计。
11.微量移液器。
12.电炉或微波炉。
13.离心管。
14.烧杯。
15.量筒。
16.三角瓶等。
准备工作：1.准备好所需的试剂和耗材，确保它们在有效期内，并按照要求储存和使用。
2.确保实验区域干净整洁，并无菌操作。
3.了解和掌握实验步骤，以及如何解决可能出现的问题。
4.使用DEPC水处理相关玻璃器皿，保证无RNA酶的污染。
实验方法：1.将RNA样品进行电泳分离，根据分子量大小将RNA分子分离至琼脂糖凝胶中。
2.将凝胶中的RNA分子转印到硝酸纤维素膜上。
3.将硝酸纤维素膜上的RNA与特定基因的探针进行杂交。
4.通过底片暗盒制作X光底片，以检测RNA的表达情况。
5.对硝酸纤维素膜进行脱色处理，以便进一步检测和分析。
6.通过分光光度计测定X光底片的吸光度，以定量分析RNA的表达水平。
7.根据定量分析结果进行数据分析，绘制图表等。
注意事项：1.在实验过程中，要注意防止污染，尤其是避免交叉污染，因为这会对实验结果产生极大的影响。
2.所有溶液都应该是新鲜的，并且在使用之前应该进行充分的过滤和离心处理。
northern印迹杂交原理
northern印迹杂交原理北方印迹杂交（Northern blot）是一种用于检测和分离特定RNA序列的实验技术。
它是南方印迹技术的衍生物，南方印迹技术是用于检测和分离DNA序列的一种实验技术。
北方印迹技术常用于研究基因的表达调控机制和RNA水平的变化。
北方印迹杂交的原理基本上与南方杂交的原理相似，但有一些具体差异。
北方印迹的主要步骤包括RNA提取、转印到膜上、固定RNA到膜上、杂交和检测。
首先，从细胞或组织中提取总RNA。
通常使用酚-氯仿法或商业RNA 提取试剂盒进行提取。
在提取过程中，应严格遵循消毒和无RNase污染的条件。
接下来，将提取的RNA样品加载到琼脂糖凝胶中进行电泳分离。
通过电泳可以将RNA按分子大小进行分离，从而得到RNA带。
在电泳结束后，在凝胶上用碱性溶液溶解凝胶，将RNA转移到尼龙或硝酸纤维膜上。
然后，固定RNA到膜上。
这通常是通过使RNA与膜上的阳离子进行静电相互作用来实现的。
可以使用UV交联来增强RNA与膜的结合。
在固定RNA后，开始进行杂交。
杂交是将与目标RNA序列具有互补序列的DNA或RNA探针与膜上的RNA进行配对。
探针可以是标记有荧光物质或放射性同位素的分子探针。
探针的选择应根据研究的具体目的来确定。
杂交的条件包括温度、时间和杂交液的组成。
温度通常选择在50-65摄氏度之间，时间通常在几小时到一夜之间。
杂交液中通常包含盐、DENHART's溶液、聚丙烯醇等。
最后，进行检测。
检测的方法可以是放射自显影、化学发光或荧光检测。
如果使用放射性标记的探针，可以使用放射自显影技术来检测。
如果使用化学发光或荧光标记的探针，可以使用相应的检测仪器进行检测。
北方印迹杂交技术可以用于许多研究领域，例如研究基因表达的调控机制、RNA的稳定性和降解等。
它的优点包括对RNA分子的特异性检测和分离，以及对研究RNA变化的敏感性和定量性。
它的局限性在于需要较长的处理时间和较大的RNA样品量，以及需要较高的实验技术要求。
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northern 印迹杂交流程图
所用材料、试剂及仪器 方法与步骤 参考书籍及文献
材料
总RNA样品或mRNA样品、 探针模板DNA、随机引物、地高 辛-dUTP、klenow酶、硝酸纤维 素虑膜等。
试剂
• 10*MOPS缓冲液、DEPC水、6*RNA上样 缓冲液、37%甲醛、甲酰胺、 20*ssc(pH7.0) 杂交缓冲液、2*洗膜缓冲液 (2*ssc)、预杂交液、杂交缓冲液、缓冲液 Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ、NBT(硝基四氮唑蓝 )、 BCIP(5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸盐) 、TE缓冲液、 显色液、琼脂糖等。
上样
用标尺测量加样 孔与条带的距离
，拍照
切去凝胶一角，用 用SSC冲洗并浸泡 胶板，以除去甲醛
。
电泳：用1*MOPS缓冲液 ，先用20V使样品进胶， 再用5V/cm电泳1 h ，停 止电泳。
2.转膜
浸泡在250 ml 50 Mmol/l NaOH ,室 温、30r/min 30 min。
浸泡在 250 ml
仪器
• 恒温水浴箱，电泳仪，杂交袋，真空转移 仪，真空泵，杂交炉，恒温摇床，脱色摇 床，漩涡振荡器，分光光度计，微量移液 器，电炉（或微波炉），离心机，烧杯， 量筒，三角瓶，紫外灯等。
1.RNA电泳
琼脂糖与纯水一定 比例于微波炉内混 匀、冷却到75°C
加mops缓冲液、 甲醛，混匀。
制备成电泳用胶 待胶凝过程中， 准备RNA样品。
tris*NaCI 室温、30r/min 30min。
浸泡在250ml 10*SSC约1min
。
RNA转膜前的处理
转膜的 方法
毛细管洗脱法 真空转移法 电印迹法
叠放的滤纸，凝胶和膜之间不能有气泡，转膜约 10 h。
电泳后的凝胶 → 放置 → 室温转移10—25h → 漂洗（SSC）除碎胶片 →80℃烘烤2h固 定核酸.
3、探针标记
探针模 模板、随 机引物 、双蒸
水。 冰块
离心、 混匀。 变性
顺序加
随机引
缓冲液
、dNTP 、dUTP
室温
Klenow 3h
酶，混
匀。
75°C 保温10 Min。
加预冷 无水乙 醇、混 匀。1000r/min15min、去上清
-20
℃、
、乙醇洗 涤、真 空干燥
2 h 、TE溶解
、-20°C
• 洗膜：在室温下用50mL 2*SSC， 0.1% SDS 溶液洗膜两次以上，每次 5 min。膜即可以立即用于显色检测或 储存备用（干燥环境中）。
5.酶联免疫染色
• 室温，用缓冲液Ⅰ洗膜 1-5 min，缓冲液 Ⅱ洗膜 30 min，再用缓冲液Ⅰ洗膜 1-5 min。
• 用缓冲液Ⅰ稀释抗体缓冲液（1：2000）， 稀释后的抗体溶液在4℃只能稳定12 h。室 温下将膜在抗体稀释液中浸泡30 min。
• 缓冲液Ⅱ洗膜2次，每次15 min，以除去 未结合的抗体复合物。再用20 mL缓冲液 Ⅲ平衡膜2-5 min。
• 在黑暗条件下将膜与显色液放入密封 的暗盒中显色。通常 2 min后出现颜 色，充分显色应在16 h以上。膜可以 在弱光下短时间暴露以检测显色强度。
• 显色完毕后用TE缓冲液停止染色，照 相记录显色结果。
[4] 魏春红,李毅.现代分子生物学实验技术[M].高等教育出版 社,2006,156-162.
[5] 汪天虹.分子生物学实验[M].北京大学出版社,2009,76-79.
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Northern印迹杂交技术
• Northern 杂交是用于RNA定量和定性分析的常 用技术，它是将RNA分子从电泳凝胶转移到硝酸 纤维素滤膜或其他化学修饰的活性滤纸上，再进 行核酸分子杂交的一种实验方法。
• 可以鉴定总RNA或poly(A)+RNA样品中同源 RNA的存在与否、测定样品中特定mRNA分子的 大小和丰度，是分子生物学中研究基因表达在转 录水平上的调节以及cDNA合成的重要手段。
结果示例
参考书籍及文献
[1] 朱玉贤,李 毅.现代分子生物学[M].高等教育出版 社,2002，173-178.
[2] 黄怡森,张光毅.生化与分子生物学[M].科学出版社， 2008，345-347.
[3] 郝福英,朱玉贤,朱圣庚，等.分子生物学实验技术[M].北 京大学出版社,1998,68-72.
备用。
4.杂交
• 将待杂交的滤膜放入杂交袋中，按 20mL/100cm2滤膜计算加入预杂交 液、68℃水浴摇床杂交1-2 h。
• 将标记好的DNA探针煮沸5min，迅 速在冰上冷却。将探针加入预热的杂 交液中，充分混匀。
• 倒去预杂交液，按250mL/c㎡滤膜计 算向杂交袋中加入含地高辛标记探针 的杂交液，68℃杂交6 h以上。