雌激素受体基因突变的研究进展_王晓稼

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(收稿:1999-08-17　修回:1999-11-01)

雌激素受体基因突变的研究进展

浙江大学肿瘤研究所(杭州310009)　王晓稼综述　郑　树审校

摘要　在乳腺癌生物学特性研究和内分泌治疗中雌激素受体(ER)起重要的作用。已有足够的证据显示ER在mRNA水平可能发生突变或变异,这些ERm RN A突变[ER(m)m RN A]可能会影响乳腺癌的生物学行为。本文就ER变异体(v ariants)的产生机制、检测和应用作一综述。

关键词　雌激素受体　基因　突变

雌激素受体(ER)对乳腺癌生物学特性和临床内分泌治疗研究有着重要的意义。早在1985年Sluyser 和M ester曾提出存在基因表达水平ER突变或变异的可能性,这些ER变异体(variants)可以在没有E2的参与下诱导基因转录。至今,已有足够的证据显示ER 在mRNA水平的突变,因为有许多的ERmRN A突变[ER(m)mRNA]被报告,但尚没有确定相应有临床价值的变异或突变ER蛋白———ER(v)或ER(m),而且ERm RN A的突变在癌组织和正常组织中均可被发现[1,2]。因此,ER在基因水平突变对乳腺癌生物学行为的影响及其临床意义有待深入的研究。

一、正常ER的结构

ER蛋白全长为595个氨基酸,分子量为67kD。研究还发现ER至少有两种,即α受体和β受体。ER 蛋白分子从N-端到羧基端共分成6个功能区:A、B、C、D、E和F,它们分别或协同担任一定的功能。氨基端(A/B区)主要为AF-1功能区,C区为DNA结合区,羧基端(E/F区)为AF-2功能区和配体结合区(LBD)[3,4]。由于已弄清ER的全长序列,目前临床上免疫组化法所用的ER抗体已经采用了基因重组人ER蛋白诱导的单克隆抗体,使得临床ER结果的假阳性率明显降低。但由于ER单抗的制备主要针对ER 蛋白氨基端或羧基端的某些区段,因此,无法有效地反映ER的变异情况。

二、ER基因水平变异的机制

(一)外显子丢失

主要是hnRN A剪接过程中发生外显子的缺失,使ERmRNA不同程度地缩短,在ER基因8个外显子中以2～7单一或联合缺失最常见,其联合丢失可发生在3/4、4/5、5/6和4/7等。在这些突变ERmRNA(M t ERmRNA)中以第5外显子缺失ER(ERΔ5或称ERdelta5)研究较多。由于第5外显子部分相当于ER 蛋白的配体结合区(激素结合区),在体外研究中发现ER(-)的BT-20细胞系和ER(+)的MCF-7细胞系中均可检测到ERdelta5mRN A,而且还首次分离到一种42kD的ER(m)蛋白。此外,有人认为在ER(-)/ Pg R(+)肿瘤细胞中ERΔ5mRNA表达量更高。ER ■5尽管缺少了激素结合区(HBD),但仍能在没有E2参与下和DNA结合并激活雌激素敏感基因的转录,诱导P gR等蛋白合成[5]。

(二)单个位点基因突变

1998年G arcia首先发现ER第257位核苷酸C※T突变,使B区第86位氨基酸由丙氨酸(Ala)变成缬氨酸(Val),并在66例ER(+)乳腺癌中检测到8例这种变异ERmRNA[1]。1997年Casta发现在人ER第167位(B区)丝氨酸(Ser)磷酸化后其转录活性降低70%,且被丙氨酸Ala取代后其与DNA结合的亲和力降低10倍[6]。1997年Henttu确定,ER羧基端(HBD)第366位赖氨酸在构成ERα-螺旋中起重要作用,当其被Ala替代后将降低A F-2的活性及ER和SRC-1的结合,但不影响RI P-140[7]。最近,Ekena在ER配体识别区(第515～535位氨基酸)中发现,第521位甘氨酸(Gly)、第524位组氨酸(His)、第525位亮氨酸(Leu)和第528位蛋氨酸(M et)发生改变将影响ER对

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2000年2月　第27卷第1期

配体的识别和结合[8]。

(三)核苷酸序列的插入

主要是mRNA形成过程中发现外显子序列的重复,而使ERmRNA和ER蛋白加长,如第6外显子、第3/4外显子等完全性重复。此外,还可出现一个与第5内含子同源的69个核苷酸序列插入在第5、6外显子之间,即相当于ER蛋白第412和第413氨基酸之间插入23个氨基酸序列,使ER(v)分子量增加到68.8kD。1997年Wang克隆和序列分析研究提示,hnRNA在剪接过程中错误地将第5内含子作为外显子保留下来,是由于其5′端邻近第6外显子的核苷酸由A※G发生突变所致,该位点正好为第5内含子的剪接位点[9]。

(四)基因甲基化或蛋白磷酸化修饰

ER基因在DNA水平的甲基化可能成为ER变异的重要原因之一,这些改变使hnRN A剪接过程发生错误而导致ERm RN A的异常。此外,ER蛋白中一些关键氨基酸的磷酸化作用也同样改变了ER的空间结构和功能,如B区118位Ser经磷酸化变成Ala,可使其转录活性降低30%～40%,而不影响其与配体(E2)或DNA(即ERE)的亲和力[10]。1999年Chen[11]发现C区第336位Ser在PKA(蛋白激酶)作用下磷酸化成谷氨酸(G lu),使ER的二聚作用受抑制,而不能与DNA结合,如转变为A la则上述作用仅受到一定影响;当加入17-雌二醇或4-羟三苯氧胺(4-O HT)后上述抑制作用可被逆转,而ICI182,780则不能。研究还发现ERα在无配体存在下可通过DBD之间的相互作用形成二聚体,只是当ER结合配体后L BD才对其二聚功能起调节作用,而ICI182,780则可通过LBD防止其形成二聚体。在ERα/ERβ细胞中,同样可在ERα第236位Ser被PK A磷酸化,但此时4-OHT不能克服P KA对ER二聚作用的抑制。

三、ER突变的检测及其应用

(一)ER(m)的检测

目前ER突变或变异的检测在mRNA水平报道较多,但至今尚没有检测到有临床价值的与mRNA突变一致的变异ER蛋白。1990年瑞典学者Zhang[12]以SSCP和DNA测序检测30例转移性乳腺癌的ERm R-N A突变,检测到3个突变类型:47位Ser※T hr,531位Ly s※Glu和537位Ty r※Asn。经进一步研究发现第3种类型ER(m)具有E2非依赖转录活性,其537位突变氨基酸正好位于羧基端E区第8外显子起始点,该位点的磷酸化与ER二聚功能、转录激活功能和激素结合过程有关,这种ER(m)在形态上的改变尽管可以模仿ER与激素结合并形成二聚体,但其复合物仅有基本的反向激活功能,在复发转移的乳腺癌中如果检测到这种ER(m)则可能与其进展或激素耐药有关。

1998年Umekita[13]在35例ER(+)乳腺癌的复发转移灶(或淋巴结)中以序列分析ER基因中HBD 的突变情况,发现316位Val※Ile、344位G ly※Val、430位Ala※V al和494位Gly※Val四种变异。将其所有的转移灶共117个标本以单克隆抗体ER和P R 进行免疫组化测定,发现尽管其ER仍持续高表达,但P R转阴在复发灶和淋巴结中分别为33%和6.7%,提示可能存在ER突变,而且其突变在转移灶较原发灶更常见,且PR(-)表型在某些乳腺癌中与疾病进展有关。

(二)ER(m)的应用

1997年Pink[14]分离到一种77kD的ER(m)蛋白,确定为6/7外显子(位于HBD)的完全重复,其特性为不与E2或合成配体结合,但可与DN A结合,体外研究发现其能在ER(+)乳腺癌细胞中抑制E2的诱导作用。此外,ER第537位酪氨酸磷酸化在ER结合E2及其结合容量的调节方面起重要作用。当该位点发生突变后其作用将下降甚至丧失,如被苯丙氨酸取代后的ER(m)与E2的结合力仅为野生型ER的1/10[15]。1997年G arcia将ER(m)转染到乳腺癌细胞后,发现E2和TAM可降低乳腺癌细胞的生长和侵袭力[16]。目前,把ER变异体作为乳腺癌的临床常规检测项目尚不适合,但ER蛋白的变异在乳腺癌生物学研究和临床治疗方面起越来越重要的作用。

至此,不难看出乳腺癌从激素依赖到激素非依赖的进展中起重要作用的可能是那些ER变异体或突变体的表达或改变,因为任何蛋白在结构上的异常都会导致其功能上的改变,ER作为一种具有广泛生物学意义的细胞生长因子也不例外。尽管这些ER(m) mRN A是否能在体内稳定翻译尚不清楚,但它们已经给乳腺癌内分泌治疗乃至基因治疗带来新的曙光。

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(收稿:1999-08-19　修回:1999-10-25)

肿瘤转移检测标志基因研究进展

厦门大学细胞生物学与肿瘤细胞工程教育部重点实验室(厦门361005)　乔玉欢

厦门大学抗癌研究中心 陈瑞川

综述

摘要　用聚合酶链反应(PCR)方法检测肿瘤转移标志基因的研究报道逐年增多,PCR法检测循环肿瘤细胞和微转移,不仅可确认癌转移,而且对检测治疗的效果、强度和持续时间有指导意义,对肿瘤转移规律的研究也将有深远的影响。

关键词　聚合酶链反应　肿瘤　转移　基因

肿瘤的浸润和转移是影响肿瘤患者预后的重要因素。肿瘤的转移大多通过淋巴及血液循环,因此检测淋巴结、骨髓及血液中的肿瘤细胞对肿瘤的诊断、分期、复发及预后判断、治疗方案的选择都有重要的指导意义。通常进入淋巴结、骨髓、血液中的肿瘤细胞数量极微量,用传统的病理学、免疫化学等方法较难检测到如此微量的癌细胞。高敏感性的聚合酶链反应(PCR)技术的应用大大促进了肿瘤微小残余病灶的检出。自1987年以来,相继出现了以PCR技术为基础的检测循环血液及淋巴结中各种微量转移肿瘤细胞的方法[1]。尤其是近年来,用PCR技术检测肿瘤微转移的研究报道逐年增多,本文就美国科学信息研究所〔In-stitute fo r Scientific Information(ISI)〕建立的最新文献数据库〔Current Contents on Diskette(CCoD)〕中1994年至1999年6月有关的研究文献,结合我们的课题研究工作作一综述。

一、基本原理及优点

用PCR方法检测肿瘤细胞的原理是通过在患者的血液、淋巴结、骨髓中扩增出肿瘤细胞标志性基因或靶RNA来证实肿瘤细胞的存在。目前,这一方法所用的标志性基因主要有两类:一是对肿瘤细胞中某些标志基因的异常突变进行PCR扩增及检测,即从肿瘤组织中或从淋巴结、血液中提取DNA进行PCR/ RF LP分析以检测癌基因是否突变,进而确定该肿瘤是否发生转移及转化,如表1中对ras基因突变的检测;另一类是通过反转录PCR(即RT-P CR)扩增组织特异性的或肿瘤特异性的mRNA(即靶RNA)。这个方法主要用于检测循环的肿瘤细胞和实体瘤的微转移。它是基于这样一个事实,即肿瘤细胞继续表达它的起源组织的特征标志物,而在正常循环血液或淋巴结、骨髓中的细胞不表达这种特征标志物,例如前列腺特异抗原(PSA)、黑色素瘤细胞中的酪氨酸酶m RNA,已成为检测前列腺癌、黑色素瘤的有用标志物。

检测组织特异的标志物mRNA比病理学、免疫组化等方法有几个优点[1]:第一,RN A在细胞外环境中是很不稳定的,因此检测到标志物mRNA应当表示所检查的组织或体液中有肿瘤细胞;PCR检测法已达到检测单个分子的能力,而其它方法还达不到。第二,在免疫组化等方法结果为阴性时,仍可用组织特异性标志物的m RNA检测来表明肿瘤细胞的存在。例如,在

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2000年2月　第27卷第1期