肌营养不良症DMD基因检测
DMD基因检测
实验报告课程名称：分子医学实验 指导老师： 成绩： 实验名称： DMD 基因检测 实验类型： 同组学生姓名：一、实验目的及原理三、实验结果 二、操作步骤 四、讨论分一、 实验目的 及原理掌握Duchenne 型肌营养不良症基因DMD 检测的简便方法。
本实验采用多重PCR 法检测。
PCR 是一种体外由引物介导的特定DNA 序列的酶扩增方法，全过程由“变性”、“退火”、“延伸”三部曲若干次循环组成。
一般的PCR 反应通常只有一对反应引物，而多重PCR 则是用几对引物在同一个PCR 反应体系中进行扩增，这样可以同时扩增出多个不同专一靶区域的片段。
Duchenne 型肌营养不良症是由于DMD 基因变异引起的。
DMD 基因由79个外显子组成，通常选择DMD 基因中9个缺失热点的外显子扩增，可检出缺失突变中的90%。
为节省经费，本实验设计为扩增DMD 基因中4个外显子。
二、 操作步骤1、 正常对照DNA 样本、DMD 患者DNA 样本，分别进行PCR 扩增。
PCR 操作如下：每一个薄壁PCR 管中加入（反应总体积为25µL）DMDmix 22µLPrimer R+F 1.5µLDNA 模版 1.5µLDMD-e8、DMD-e19、DMD-e45、DMD-e48、DMD 对照组石蜡油 1滴放置在PCR 循环仪上，循环参数设置为：Step1 （1个循环） 94℃ 5分钟Step2 （30个循环） 94℃ 30s56℃ 30s72℃ 30sStep3 （1个循环） 72℃ 7分钟2、PCR扩增结束后进行琼脂糖凝胶电泳。
（1）配制2%的琼脂糖凝胶配制1×TBE电泳缓冲液70ml于三角烧瓶中，称取1.4g的琼脂糖粉放入后，沸水锅加热熔化，冷却至60℃，加入溴化乙锭至终浓度为0.5µg/ml,混匀凝胶，倒入电泳槽中，插入梳子，待凝固。
（2）向电泳槽中倒入1×TBE，其量以没过胶面2mm为宜，小心移去梳子。
MLPA和多重PCR法检测假肥大性肌营养不良患者DMD基因突变
【 关键 词】 假肥 大性肌 营养不 良症 ；多重连接 依赖式探针扩增 ；多重 Ｐ Ｒ； 失／ Ｃ 缺 重复 突变
假肥大性肌营养不 良症是一种严重的神经肌 肉疾 病， 为 Ｄ 分 ＭＤ（ ｕｈｎ ｅｍ ｓｕａ ｄｓ ｏｈ ）和 Ｂ Ｄ ｄｃｅ ｎ ｕｃｌ ｙｔ ｐｙ ｒ ｒ Ｍ （ ｅｋｒｍ ｓｕａ ｄｓ ｏｈ ） 均 是 由 于 Ｄ ｂｃｅ ｕｃｌ ｙｔ ｐ ｙ ， ｒ ｒ ＭＤ 基 因 （ ｐ １２ 突变所 致 。它是人类 已知 的最长 的基 因， Ｘ ２． ）
ｃＮ Ｄ Ａ长 达 １ ｋ ， ７ ４ ｂ 含 ９个 外 显 子 ， 码 ３ ８ 编 ６ ５个 氨 基 酸 。
度计测定 Ｄ Ａ纯度和浓度 。将 Ｄ Ａ浓度控制在 ５ Ｎ Ｎ ０～
２ ０ ｒ／ｔ ０ ｇ ｘ ｉ Ｌ。
１２ ２ Ｍ Ｐ ． ． Ｌ Ａ检 测
所 有 反 应 在 标 准 的 盖 温 为 １５Ｉ ０ ｃ ＝
中 国 医科 大 学盛 京 医 院 儿科 就 诊 的 ５ 例 Ｄ ｌ ＭＤ患 者 和 ８例 Ｂ ＭＤ 患 者 。 采 用 Ｍ Ｐ 法 对 经 多重 Ｐ Ｒ 法检 测 过 的 ＬＡ Ｃ 患者 的 Ｄ ＭＤ基 因 的缺 失 ／ 复 突 变 进 行 突变 筛查 ， 时 对 先 证 者 的 母 亲 进 行 基 因的 缺 失 ／ 复 突 变检 测 。 结 果 重 同 重
的 Ｐ Ｒ仪上进行 。（ ） Ｎ Ｃ １ Ｄ Ａ变性 和 Ｓ Ｌ Ａ Ｍ Ｐ Ａ Ｓ Ｌ Ａ探针 杂 交 ， 应 体 系 如 下 ： 释 Ｄ Ａ 样 品 （ ０～ ０ ｇ 加 反 稀 Ｎ ５ ２０ ｎ ） Ｔ Ｅ至 ５ Ｌ ８ 。９ ℃加 热 ５ｍ ｎ 开 盖之 前冷 却 到 ２ ￣ ｉ， ５Ｃ。 分别 加 入 １５ ｔ ０ ４ Ｐ ３ ． ｘ Ｐ ３ ／ ０ ５探 针 混 合 物 和 １５ Ｌ Ｌ ． ＭＬ Ａ ｂｆ ｒ Ｐ ｕ ｅ。小 心 混 匀 ，５【孵 育 １ｍ ｎ ６ ℃ ３ １卷第 １ ６期
假肥大型进行性肌营养不良2个核心家系DMD基因分析
外显子的杂合缺失突变 ； 先证者 ２为 Ｄ ＭＤ基 因 ２ ０— ３ ４号外显 子缺 失 ， 其母亲为 ２ ０—３ ４号外显子 的杂合 缺失 突变。 结论 ＭＬ Ｐ Ａ进行 Ｄ ＭＤ基因检测是确诊 Ｄ ｕ ｃ ｈ ｅ ｎ ｎ ｅ ／ Ｂ ｅ ｃ ｋ ｅ ｒ 肌 营养不 良的快速方法 ， 同时可进行 携带者筛查 ， 为遗 传咨询 提供准确 信
Ａ ｂ ｓ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ ： Ｏ ｂ ｊ ｅ ｃ ｔ ｉ ｖ ｅ Ｔ ｏ ｅ ｘ ｐ ｌ ｏ ｒ ｅ ｔ ｈ ｅ ｇ ｅ ｎ ｅ ｄ ｉ ａ ｇ ｎ ｏ ｓ ｉ ｓ ｏ ｆ ｓ ｕ ｓ ｐ ｅ ｃ ｔ ｅ ｄ Ｄ ｕ ｃ ｈ ｅ ｎ ｎ ｅ ｍ ｕ ｓ ｃ ｕ ｌ ａ ｒ ｄ ｙ ｓ ｔ ｒ ｏ ｐ ｈ ｙ（ Ｄ Ｍ Ｄ） ／Ｂ ｅ ｅ ｋ ｅ ｒ ｍ ｕ ｓ ｃ ｕ ｌ ａ ｒ ｄ ｙ ｓ ｔ ｒ ｏ ｐ ｈ ｙ （ Ｂ ＭＤ） ｐ ａ ｔ ｉ ｅ ｎ ｔ ｓ ａ ｎ ｄ ｓ ｃ ｒ ｅ ｅ ｎ ｔ ｈ ｅ ｃ ａ ｒ ｒ ｉ ｅ ｒ ． Ｍｅ ｔ ｈ ｏ ｄ ｓ Ｃ ｌ ｉ ｎ ｉ ｃ ａ ｌ ｆ ｅ ａ ｔ ｕ ｒ ｅ ｓ ｏ ｆ ２ Ｃ ｈ ｉ ｎ ｅ ｓ ｅ ｆ ａ ｍ ｉ ｌ ｉ ｅ ｓ ｗ ｅ ｒ ｅ ｃ ｏ ｌ ｌ ｅ ｃ ｔ ｅ ｄ ． Ｇ ｅ ｎ ｏ ｍ ｉ ｃ Ｄ Ｎ Ａ ｗ ａ ｓ ｅ ｘ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ ｅ ｄ
杜氏肌营养不良症(DMD)与遗传
Dystrophin 抗肌萎缩蛋白
• 全长型dystrophin 是一种427 kDa的棒状蛋白, 长约150 nm, 分为4 个区域 ，
• 氨基端区域 • 中央棒状区 • 富含半胱氨酸区域 • 羧基端区域
Dystrophie musculaire de Becker
• le gène de la dystrophie • Beaucoup plus atténué 缓和
• Après l’âge de 16 ans • 之后多年也可行走
parvient à marcher
DMD与BMD的差异
• DMD——致死 • BMD——存活率非常高(70%),易产生 新的突变
用力逐渐减弱，最终被洗脱下来 • 检测柱洗脱液在260 nm处的吸光度，样品中各成分在色谱图中显示为不同的吸收峰
• 优点: 灵敏度高、分析快捷以及可以进行半自动化分析
Merci de votre attention !
参考文献
• DMD／BMD基因诊断研究进展，徐晓雪 张朝东 李嘉姝
• DMD 患者骨骼肌抗肌萎缩蛋白表达与临床病理改变，陈琳 郭玉璞 邹丽萍 赵燕环 任海涛
； • （4）由于男性患者的子女都正常，故可见隔代遗传； • （5）女性患者的父亲一定是患者,母亲一定是携带者。
DMD —男女差异
• 男性致死
Duchenne, un neu•rol1og/ist3e frnanéçaois,ma dounntéautneiodensc,ri2pt/io3n commplèèterdee 1p3 moalratdieesuatstaeints
怎么看懂dmd基因检测报告
怎么看懂dmd基因检测报告
DMD基因检测报告是一份关于Duchenne肌营养不良症（DMD）的基因
检测结果的文件。
要读懂DMD基因检测报告，可以按照以下步骤进行：
1. 了解报告的结构：一份完整的DMD基因检测报告通常包括以下几个部分：样本信息、检测方法、基因变异解读等。
2. 查看样本信息：这部分内容通常包括被检测者的姓名、年龄、性别、样本来源等信息。
这些信息有助于确保报告与正确的个体匹配。
3. 关注检测方法：这部分描述了基因检测所采用的技术和流程。
了解检测方法有助于理解结果的可靠性和准确性。
4. 查看基因变异解读：这是报告的核心部分，其中列出了被检测基因的所有变异，并对每个变异进行了解读。
每个变异都会被注明其在基因中的位置、可能的影响以及是否为已知的疾病相关变异等信息。
5. 关注结论与建议：报告的结论部分通常会总结被检测者的基因变异情况，并给出是否携带DMD相关变异的判断。
同时，还会提供与被检测者情况相关的医学建议或下一步的诊疗建议。
6. 注意异常指标：如果报告中出现了异常的指标，如特定的基因变异或生化指标，这可能意味着被检测者存在患DMD的风险。
这种情况下，应寻求医生的进一步咨询和评估。
7. 保存并备份报告：为了方便查阅和保存相关数据，建议将基因检测报告保存在安全可靠的地方，如电子设备或云存储。
总的来说，阅读DMD基因检测报告需要具备一定的生物医学知识背景，以便准确理解和解释检测结果。
如果你对报告的内容有任何疑问或不确定的地方，建议咨询专业的医学遗传学专家或医生进行解读和评估。
怎么看懂dmd基因检测报告
怎么看懂dmd基因检测报告全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：怎么看懂dmd基因检测报告近年来，随着医学科技的不断进步，基因检测逐渐成为一种重要的健康管理工具。
在基因检测中，dmd基因的检测尤为重要，因为这个基因与杜克内尔肌肉萎缩症（Duchenne muscular dystrophy，DMD）有密切关联。
而要正确理解和解读dmd基因检测报告，则需要一定的专业知识和技巧。
本文将为大家介绍如何看懂dmd基因检测报告，帮助大家更好地了解自身的基因状况。
要了解dmd基因检测报告，首先需要了解一些基本的知识。
dmd 基因位于X染色体上，是编码一种叫做dystrophin的蛋白质的基因。
这种蛋白质在肌肉细胞中起着非常重要的作用，能够维持肌肉细胞的结构和功能。
如果dmd基因发生突变或缺失，就会导致肌肉细胞受损，最终导致DMD疾病的发生。
在进行dmd基因检测时，实验室通常会对样本中的dmd基因进行测序分析，从而检测出有无突变或缺失。
检测报告通常会包括以下几个方面的信息：1. 基因突变类型：检测报告会详细列出检测到的突变类型，比如缺失、插入、错义突变等。
不同类型的突变会对疾病的发病风险和临床表现产生不同的影响。
2. 突变位置：报告还会指明突变发生的具体位置，有时还会提供基因组坐标或AA序列号。
这有助于进一步研究突变的影响和机制。
3. 突变的临床意义：报告通常会对检测到的突变进行解读，说明该突变对DMD的风险或临床表现有何影响。
一些高风险的突变可能会导致患者早期发病或病情严重。
4. 检测结果：报告会总结出是否检测到了dmd基因的突变，以及检测结果所带来的风险或建议。
要正确理解和解读dmd基因检测报告，需要具备一定的专业知识和技能。
以下是一些建议：1. 寻求专业指导：如果您对dmd基因检测报告不理解，可以咨询专业遗传顾问或医生帮助解读。
他们有经验和专业知识，可以为您解释报告中的复杂内容。
2. 关注突变类型和位置：要仔细研究报告中关于突变类型和位置的信息，了解突变的具体影响和可能风险。
dmd诊断标准
dmd诊断标准Duchenne muscular dystrophy (DMD) 是一种罕见的肌肉疾病，它会影响男性的肌肉功能，导致肌肉萎缩和无力。
以下是DMD的诊断标准，包括临床特征、家族史、基因检测、肌肉活检和其他辅助检查等方面。
1. 临床特征DMD患者在儿童期或青少年期出现进行性肌肉无力，通常首先出现在腿部和背部肌肉，然后逐渐影响到其他肌肉群。
随着病情的发展，患者可能会出现呼吸肌无力、脊柱侧弯、关节挛缩等症状。
在检查患者时，医生会特别注意观察患者的步态、姿势和肌肉状态。
2. 家族史DMD是一种遗传性疾病，通常在家族中有遗传史。
医生会询问患者的家族史，了解患者的亲属是否患有DMD或其他神经肌肉疾病。
如果患者的家族中有DMD患者，那么患者患有DMD的风险会更高。
3. 基因检测基因检测是诊断DMD的金标准。
医生可以通过提取患者的血液或其他组织样本进行基因检测，寻找与DMD相关的基因突变。
如果检测到特异的基因突变，例如缺失或重复的X染色体，可以确诊DMD。
4. 肌肉活检肌肉活检是一种通过手术获取患者肌肉样本的检查方法。
通过观察肌肉样本的显微结构，可以发现DMD患者肌肉中的异常变化，例如肌肉纤维萎缩、坏死和修复等。
肌肉活检对于DMD的诊断和与其他神经肌肉疾病的鉴别诊断具有重要意义。
5. 其他辅助检查其他辅助检查包括心电图、肌肉功能测试、神经传导速度等。
这些检查可以帮助医生评估患者的肌肉功能和神经传导功能，从而协助诊断DMD。
总结：DMD的诊断需要结合临床特征、家族史、基因检测、肌肉活检和其他辅助检查结果。
医生需要根据患者的具体情况进行综合评估，以确定最终的诊断结果。
如果您有任何疑问或需要更多信息，请咨询专业医生。
怎么看懂dmd基因检测报告
怎么看懂dmd基因检测报告全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：随着生物技术的不断发展，基因检测已经成为一种常见的方式来了解个体的遗传特征和疾病风险。
DMD（Duchenne muscular dystrophy）基因检测是一种用于检测患有杜兴氏肌萎缩症（Duchenne muscular dystrophy）遗传性疾病的检测方法。
了解如何看懂DMD 基因检测报告对于患者和家属来说是非常重要的，可以帮助他们更好地了解患病风险和未来的治疗方向。
要理解DMD基因检测报告，我们需要了解一些基本的遗传知识。
杜兴氏肌萎缩症是一种由于DMD基因突变导致的遗传性疾病，通常会导致肌肉无力和进行性肌肉萎缩。
DMD基因位于X染色体上，因此主要影响男性。
检测报告中通常会包含基因突变的具体信息，包括发生的位置、类型和对应的致病性。
当阅读DMD基因检测报告时，需要注意以下几个方面：1. 检测结果：报告中会显示具体的检测结果，包括是否患有DMD基因突变。
一般来说，如果检测结果为阳性，即表示携带有致病性突变，存在患病的风险。
如果检测结果为阴性，则表示未发现有相关的致病性突变，较少患病的可能性。
2. 遗传风险：DMD基因遗传疾病通常呈X连锁显性遗传。
男性携带有致病性DMD基因突变的患病风险较高，女性携带1个突变的患病风险较低，但有可能成为携带者并传递给下一代。
3. 患病风险评估：报告中可能会包含有关患病风险的具体评估，包括患病的可能性、发病年龄、疾病的临床表现等信息。
这些评估可以帮助患者和家属更好地了解疾病风险和预防措施。
4. 与医生沟通：在阅读DMD基因检测报告时，如果有任何疑问或不明白的地方，建议及时与医生进行沟通。
医生可以根据具体的检测结果为患者提供个性化的建议和治疗方案。
了解如何看懂DMD基因检测报告对患者和家属来说是非常重要的。
通过对报告中的信息进行逐步分析和理解，可以帮助患者更好地了解自己的遗传特征和患病风险，从而制定有效的预防和治疗方案。
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• DMD基因定位于Xq21.2-21.3之间，79个外显 子组成，编码3685个氨基酸、分子量为427 kD 的蛋白质一抗肌营养不良蛋白(dystrophin)，这 种蛋白具有稳定细胞膜和细胞内钙调节的功能。
• 抗肌营养不良蛋白的编码基因有多种突变形 式，60％是外显子缺失突变，通常选择DMD 基因中9个缺失热点的外显子扩增，可检出缺 失突变中的90%。
Step 1 (1个循环)
94C
5分钟
Step 2 (30个循环) 94C
30秒
56C
30秒
72C
30秒
Step 3 (1个循环)
72C
7分钟
琼脂糖凝胶电泳(agarose gel electrophoresis ):
① 配制2%的琼脂糖凝胶
配制1×TBE电泳缓冲液70ml于三角烧瓶中，称取1.4克的琼脂 糖粉放入后，微波炉加热熔化,冷却至60℃，加入溴乙锭(EB)，倒 入电泳槽中，插入梳子，待凝固。
45
547
aaacatggaacatccttgtggggac
48
506
ttgaatacattggttaaatcccaacatg
引物R ggcctcattctcatgttctaattag gatggcaaaagtgttgagaaaaagtc cattcctattagatctgtcgccctac cctgaataaagtcttccttaccacac
PCR操作如下：
每一个薄壁离心管中加入试剂的量为：（反应总体积为25l）：
双蒸水
17.8 l
10XBuffer
2.5 l
MgCl2 dNTPs
2 l 0.5 l
Primer R+F (混合)
1.4 l
DNA 模板
0.5 l
Taq-DNA聚合酶
0.3 l
石蜡油
1滴
放置在PCR循环仪上，循环参数设置为：
② 向电泳槽中倒入1×TBE，没过胶面2mm，小心移去梳子。
③ 取PCR扩增样品15l加入3l的6×载样缓冲液，混匀后，加入 样品孔内。
④ 接通电源，一般红色为正，极黑色为负极，切记DNA样品由 负极往正极泳动(靠近加样孔的一端为负)。140V，电泳2小时左 右。
⑤ 卸下凝胶，于紫外仪上观察电泳条带，并与核酸分子量标准 PUC19/MspⅠ(marker)比较。
3、Mg2+浓度对扩增产物的特异性及产量有显著影响，Mg2+浓 度低，扩增产物的特异性好，但有时产量低；Mg2+浓度高，扩 增产物的特异性差，有非特异性条带。
4、PCR循环的次数主要取决于模板DNA的浓度。理论上25-30次 循环后，PCR产物积累即可达到最大值。在满足产物得率的前提 下，应尽量减少循环次数。
mutations are deletions, and about 6% are duplications , • Allelic mutations in the same gene cause a milder disorder, Becker muscular dystrophy.
Duchenne Muscular Dystrophy, DMD
• 本实验设计为扩增DMD基因中4个外显子， 其中外显子45 和48在中国患者中的检出率分 别为26%和48%。
DMD基因4个外显子的引物顺序见表：
外显子 PCR产物大小
Байду номын сангаас引物F
8
360
gtcctttacacactttacctgttgag
19
459
ttctaccacatcccattttcttcca
实验四 进行性肌营养不良症（DMD）基因检测
• 进行性肌营养不良症(Duchenne muscular dystrophy，DMD)是肌肉组织的遗传病，特点 是进行性加重的肌肉萎缩和无力。
• 本病呈X连锁隐性遗传，一般男性儿童发病。
Genetics of DMD OMIM# 310200
• occurring in about 1 in 3500 males, • X-linked recessive, lethal in males, • 1/3 of patients are new mutants; • 2/3 have carrier mothers, • Gene location Xp21, • large gene (more than 2000 kb), 79 exons. • High mutation rate, 60% to 65% of the
10l PCR产物
2 l 6*loading buffer
混匀 加样 电泳(140V,2hr) 紫外灯下观察
注意事项：
1、引物设计时长度 15～30个碱基为宜，G+C含量一般为40%～ 60%。
2、退火温度决定PCR反应的特异性，退火温度高PCR反应的特 异性好；温度低，有时会有非特异性条带。
聚合酶链反应（polymerase chain reaction, PCR）是一种体外 由引物介导的特定DNA序列的酶扩增方法，由于此方法对样本要 求的微量性以及它特异、敏感、高速的特性，近年来得到广泛应 用。全过程是基于一套“三步曲”的若干轮次的循环组合而成的。 依次为DNA模板热变性，双链DNA解链成单链；在低温下与引物 退火，引物与单链DNA互补配对；在适宜温度下Taq DNA聚合酶 催化引物延伸。以上三步为一个循环，循环25-35次，模板DNA可 扩增100万倍左右，整个反应可在2到3小时内完成。