HLA-B27检测及其临床应用详解
HLA-B27检测操作程序
一、目的：保证流式细胞仪检测外周血淋巴细胞上HLA-B27表达量检验的工作质量，旨在保证HLA-B27检测的正确操作程序和控制检测结果的精确度。
二、修改程序：本标准操作程序的改动，可由任一使用本SOP的工作人员提出，并报经下述人员批准签字：质量主管、授权人（科主任），方可改动。
三、适用范围：外周血中T淋巴细胞HLA-B27表达量检测。
四、溯源：Anti-HLA-B27 Kit(美国BD Biosciences公司；CAT:340183)。
五、实验原理：HLA-B27属于1型MHC基因。
基本上表达在机体所有有核细胞上，特别是淋巴细胞表面有丰富的含量。
使用荧光定量标准微球，校正HLA-B27实验条件后，测定样本中T淋巴细胞HLA-B27表达水平。
若HLA-B27表达水平大于标准微球设定MARK，则为阳性结果；若HLA-B27表达水平低于标准微球设定MARK，则为阴性结果。
六、主要试剂：Anti-HLA-B27 Kit(美国BD Biosciences公司；CAT:340183)，其中包括：1、Anti-HLA-B27-FITC/CD3-PE2、HLA-B27 Calibration beads3、FACS Lysing Solution七、实验操作：抗凝真空采血管，抽取静脉血2ml。
1、标本采集：使用EDTA-K22、染色和固定细胞：（1）标本管编号A，取一只流式专用管A1。
（2） A1管加入Anti-HLA-B27-FITC/CD3-PE 30ul。
（3） A1管中再加入全血50Ul，混均。
（4）置室温，避光孵育15min。
（5）加入FACSLysing溶血液2.0ml，置室温，避光孵育10min。
（6） 300g离心5min，弃上清液。
（7） PBS洗涤细胞两次，300g离心5min，弃上清液。
（8） 1%多聚甲醛0.5mL。
3、上机检测；分析结果；打印实验报告。
八、参考值：HLA-B27:阴性九、临床意义：HLA-B27抗原表达与强直性脊椎炎发病具有高度的疾病相关性。
人白细胞抗原B27检测分析
论著·临床辅助检查CHINESE COMMUNITY DOCTORS中国社区医师2020年第36卷第10期人类白细胞抗原(HLA)是人类主要组织相容性复合体(MHC)的表达产物，在整个人体免疫系统中主要负责细胞之间的相互识别和诱导免疫反应，能调节人体的免疫应答功能。
人白细胞抗原B27(HLA-B27)属于1型组织相容性复合体，基本上表达在人类机体的所有有核细胞上，尤其是在淋巴细胞表面含量丰富。
HLA-B27属于HLA-B 的1类抗原，存在于所有有核细胞表面。
本文就HLA-B27检测结果进行探讨。
资料与方法收治进行HLA-B27检测的患者759例，男373例，女386例；年龄17～75岁。
标本采集：使用EDTA 抗凝剂的静脉血采血管，静脉血室温20～25℃静置保存，勿剧烈震荡。
试剂与仪器：①试剂：由深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司提供。
②检测原理：参照试剂说明书。
③仪器：迈瑞BriCyte E6流式细胞仪，离心机。
统计学方法：采用SPSS 10.0软件包进行数据处理。
结果759例患者中阳性198例(26.09%)。
198例阳性患者中，男122例(61.61%)，女76例(38.38%)；年龄10～20岁31例(15.66%)，20～60岁156例(78.79%)，＞60岁11例(5.56%)。
20～60岁156例患者中男96例(61.54%)，女60例(38.46%)。
讨论HLA-B27抗原的表达与强直性脊柱炎(AS)有一定的相关性，特别是检测外周血淋巴细胞中的HLA-B27抗原表达有利于AS 等疾病的辅助诊断。
在AS 的诊断上虽然主要依靠临床表现和影像学检查，但是HLA-B27的实验室检测更有利于AS 的早期诊断。
人类白细胞相关抗原的检测在一些疾病的诊断和人体器官移植中具有重要的临床意义，在AS 患者亲属中发病率比一般人高30倍左右[1]。
在实验室检测中要做好HLA-B27抗原检测的质量控制，检测前必须保证试剂的有效性，做好从标本采集前患者的准备，采集标本后的保存及运输，检测过程的整个环节质量控制，才能保障HLA-B27抗原检测结果的真实可靠性。
HLA-B27抗原检测在强直性脊柱炎诊断中的意义
Ｄ ＯＩ ： １ ０ ． ３ ９ ６ ９ ／ ｉ ． ｉ ｓ ｓ ｎ ． １ ６ ７ ３ — ４ １ ３ ０ ． ２ ０ １ ５ ． ０ ３ ． ０ ３ ６
Ｈ Ｌ Ａ － Ｂ ２ ７ 抗 原 的检 测 对 Ａ Ｓ患者 的 早 期诊 断和 鉴 别诊 断具 有 重 要 意 义 。
（ Ｉ ｎ ｓ ｔ ｉ ｔ ｕ ｔ ｅ ｏ 厂Ｃｌ ｉ ｎ ｉ ｃ ａ ｌ Ｍｅ ｄ ｉ ｃ ｉ ｎ ｅ， ｔ ｈ ｅ Ｆｉ ｒ ｓ ｔ Ｐｅ ｏ ｐ ｌ ｅ ｓ Ｈｏ ｓ ｐｉ ｔ ａ ｌ ｏ ｆ Ｆｏ ｓ ｈ ａ பைடு நூலகம் Ｃｉ ｔ ｙ， Ｆｏ ｓ ｈ ａ ｎ ， Ｇｕ ａ ｎ ｇｄ ｏ ｎ ｇ， ５ ２ ８ ０ ０ ０ ， Ｃｈ ｉ ｎ ａ ） Ａｂ ｓ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ ： Ｏｂ ｊ ｅ ｃ ｔ ｉ ｖ ｅ Ｔｏ ｉ ｎ ｖ ｅ ｓ ｔ ｉ ｇ ａ ｔ ｅ ｔ ｈ ｅ ｃ ｏ ｒ ｒ ｅ ｌ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｂ ｅ ｔ ｗｅ ｅ ｎ ｔ ｈ ｅ ｅ ｘ ｐ ｒ ｅ ｓ ｓ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ ｈ ｕ ｍａ ｎ ｌ ｅ ｕ ｋ ｏ ｃ ｙ ｔ ｅ ａ ｎ ｔ ｉ ｇ ｅ ｎ Ｂ２ ７ （ ＨＬＡ— Ｂ２ ７ ）ａ ｎ ｔ ｉ ｇ ｅ ｎ
国际检验 医学杂 志 ２ ０ １ ５年 ２月第 ３ ６卷第 ３期
Ｉ ｎ ｔ Ｊ Ｌ ａ ｂ Ｍｅ ｄ ， Ｆ ｅ ｂ ｒ ｕ ａ 型
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３ ７１ ・
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论
著 ・
ＨＬＡ— Ｂ ２ ７抗原 检 测 在 强 直性 脊 柱炎 诊 断 中的意 义
林 蔚， 肖 平， 吴祖 常
文 献标 识 码 ： Ａ 文章 编 号 ： １ ６ ７ ３ － ４ １ ３ Ｏ （ ２ ０ １ ５ ） ０ ３ － ０ ３ ７ １ 一 Ｏ ２
HLAB27检测及其临床应用详解
AS患病率 0.3% 1％ 很低
6～12％
AS患者B27阳性率 90～95% 80～100% 22% 57% 80～100%
8
HLA-B27检测方法及评价
➢ 抗原水平
微量细胞毒法 ELISA IMS-ELISA 流式细胞术法
➢ 基因水平
PCR-SSP
9
微量细胞毒法（microlymphocytotoxic test，MLCT）
4
血清阴性脊柱关节病共同特点
➢ 临床上有很多共同或重叠之处：
眼炎，尿道炎，前列腺炎， 口腔、肠道和生殖器溃疡 结节性红斑，银屑病样皮疹 坏死性脓皮病，血栓性静脉炎
➢ 基本病理变化以肌腱端周围和韧带附着于骨的部位为主(附着端炎)而
非滑膜，也可发生在眼、主动脉瓣、肺实质和皮肤，而不同于以滑膜 病变为主的类风湿性关节炎，而且无类风湿皮下结节。
5
HLA-B27相关疾病：强直性脊柱炎
Ankylosing Spondylitis，AS
➢ 患病率：0.3%，20-30岁，男女比例 10:1，有家族倾向； ➢ 主要侵犯：中轴关节（骶髂关节、脊柱骨突、脊柱旁软组织）
可伴发外周关节及关节外表现，严重者发生脊柱畸形和关节强直
➢ B27检测可作为有相关症状或高危人群AS早期的筛选方法！ ➢ AS不是RA的一种特殊类型！
12
流式细胞术法
➢ 利用荧光标记的HLA-B27单克隆抗体，与细胞表面的B27抗原结合，使
结合后的淋巴细胞具有一定的荧光强度，这种荧光强度可由流式细胞 仪测得的通道值来反映，以其值的高低判断HLA-B27抗原表达百分比 ，从而判断HLA-B27是否阳性。
➢ 优点：全自动仪器检测，减少了人为因素的影响，重复性高，结果判
流式细胞术检测HLA_B27及其临床意义
stranded conformation polymorphism analysis in the pres ence of poly － ethylene glycol［J］． Clin Chem，1997，43： 30 233． ［5］Ren J，Ueland PM． Teperature and pH effects on single － strand confor － mation polymorphism analys is by capillary electrophoresis ［J］． Hum Mutat，1999，13（ 6） ： 458 － 463． ［6］16． Bernard P，Tang P，Liu S，et al． Dimerization of SOX9 is required for chondrogenesis，but not for sex determination［J］． Hum Mol Genet，2003，12： 1755 － 65． ［7］Foster JW，Dominguez － Steglich MA，Guioli S，et al． Campomelic dysplasia and autosomal sex reversal caused by mutations in an SRY － related gene［J］． Nature，1994，372 ： 525 － 30． ［8］Wagner T，Wirth J，Meyer J，et al． Autosomal sex reversal and cam-
HLA-B27
HLA-B27与流式细胞术一、检测HLA-B27的意义HLA抗原是人类主要组织相容性复合体（Major Histocompatibity Complex，MHC）的表达产物，在免疫系统中主要负责细胞之间的相互识别和诱导免疫反应，调节免疫应答的功能。
根据HLA抗原结构，功能与组织分布的不同，可分为三类：Ⅰ类分子为HLA-A、-B、-C系列抗原，广泛分布于各组织有核细胞表面，包括血小板和网织红细胞，成熟的红细胞一般不含HLA抗原；Ⅱ类分子为HLA-D/DR、-DP、-DQ系列抗原，主要在B细胞和抗原提呈细胞上表达，这两类抗原都与移植有关，其中Ⅱ类抗原更为重要；Ⅲ类分子为补体成分。
近年来研究HLA与疾病相关性的资料表明，某些疾病的发生率与一些特殊型别的HLA检出率有关，这些病大多是发病机理不明并伴有免疫功能异常和有遗传倾向性的疾病，因此，分析HLA抗原表达情况不仅有助于了解发病机理，对于疾病的诊断、预防和预后判断都有重要意义。
HLA-B27基因属于Ⅰ型MHC基因，基本上表达在机体中所有含核的细胞上，尤其是淋巴细胞的表面有丰富的含量。
早在二十多年前，人们就已发现HLA-B27抗原的表达与强直性脊椎炎有着高度相关性，超过90%的强直性脊椎炎患者其HLA-B27抗原表达为阳性，普通人群中仅5-10%的为阳性，而强直性脊椎炎由于其症状与许多疾病相似而难以确诊，因此HLA-B27的检测在病情的诊断中有着重要意义。
在脊椎性关节病这一类的疾病中除了强直性脊椎炎以外，还有许多其它的疾病与HLA-B27抗原的表达有着或多或少的相关性，比如说Reiter，s综和症，HLA-B27阳性率为70-90%；银屑病性关节炎，HLA-B27阳性率为50-60%；葡萄膜炎（眼色素层炎），HLA-B27阳性率为40-50%；溃疡性结肠炎伴有关节病，HLA-B27阳性率为5-10%等等，因此HLA-B27的检测在这些疾病的诊断中是一个非常有价值的指标。
HLA-B27的检测——流式细胞术
HLA-B27的检测——流式细胞术【申请单】请完成申请单所要求项目×××市人民医院检验申请单姓名性别年龄门诊住院号诊断或症状检验标本检验目的送检科室医师送检日期【方法选择】表4-1 HLA-B27检测方法方法ELISA PCR 流式细胞术本次检查选择√【检测方法】单克隆抗体和荧光素的开发使得流式细胞仪在各个领域得到空前的发展，多参数同时测定使得流式细胞术得以快速，灵敏，特异地检测某一特定细胞群中某一特异性抗原的表达。
用流式细胞仪来检测HLA-B27的表达，无须分离淋巴细胞，操作简单，自动化程度高；灵敏度可达100%，特异性达97.4%；结果稳定，样本之间，不同仪器之间，不同实验室之间可重复性高。
【实验步骤】1.样本的收集和准备用K3EDTA或heparin或ACD抗凝的真空采血管收集至少1ml的外周血，若不能及时染色，则最好选用ACD或Heparin，因此两种抗凝剂对保存细胞表面抗原之抗原性，为保证实验结果的可靠性，持久性较佳。
请尽量在采血后24h内进行染色，染色前将抗凝血室温放置，无须冷藏。
固定保存、冷藏保存的样本和发生溶血的样本都不应该使用。
2. 染色和固定①取流式试管，加入30ul试剂Anti-HLA-B27 FITC/CD3 PE到试管中；②用微量移液器小心地将50ul充分混匀的抗凝血加到试管的底部，确保WBC的浓度在3.5×103-9.4×103WBC/ul之间，轻轻混匀，室温避光静置15-20min；③取出试管，每管加入10倍稀释的1×Lysing Solution 2ml，轻轻混匀，避光室温静置10-12min（不要超过12min）。
待管内液体透亮，然后1200转/min，离心5min，弃上清液。
④轻轻混匀，重悬细胞，每管中加入2ml PBS，轻轻混匀，1200转/min，离心5min，弃去上清液。
⑤每管加入0.3ml PBS 混匀，4℃避光1h内上机检测；若不能及时上机，加入0.3ml 1%的多聚甲醛保存液，放4℃冰箱保存，24h内上机检测。
HLA-B27检测SOP
HLA-B27检测操作程序一、目的：保证流式细胞仪检测外周血淋巴细胞上HLA-B27表达量检验的工作量，旨在保证HLA-B27检测的正确操作程序和控制检测结果的精确度。
二、修改程序：本标准操作程序的改动，可由任一使用本SOP的工作人员提出，并报经下述人员批准签字：质量主管、授权人（科主任），方可改动。
三、适用范围：外周血中T淋巴细胞HLA-B27表达量检测。
四、溯源：Anti-HLA-B27 kit(美国BD Biosciences 公司；CA T:340183)五、试验原理：HLA-B27属于1型MHC基因。
基本上表达在机体所有有核细胞上，特别是淋巴细胞表面有丰富的含量。
使用荧光定量标准微球，校正HLA-B27试验条件后，测定样本中T淋巴细胞HLA-B27表达水平。
若HLA-B27表达水平大于标准微球设定MARK,则为阳性结果；若HLA-B27表达水平低于标准微球设定的MARK，则为阴性结果。
六、主要试剂：Anti-HLA-B27 kit(美国BD Biosciences 公司；CA T:340183)其中包括：1、Anti-HLA-B27-FITC/CD3-PE2、HLA-B27 Calibration beads3、FACS Lysing Solution七、试验操作：1、标本采集：使用EDTA-K2抗凝真空管，抽取静脉血2ml。
2、染色和固定细胞：(1)取一只流式专用管，标本管编号A(2)A管加入Anti-HLA-B27-FITC/CD3-PE 10ul(3)再加入全血18ul,混匀。
(4)置室温，避光孵育15min.。
(5)加入FACSLysing溶血液2.0ml,置室温，避光孵育10min。
(6)3000r离心10min，弃上清液。
(7)PBS洗涤细胞两次，3000r离心10min,弃上清液。
(8)PBS或鞘液200ul。
3、上机检测：分析结果：打印试验报告。
八、参考值：HLA-B27：阴性九、临床意义：HLA-B27抗原表达与强直性脊柱炎发病具有高度的疾病相关性。
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银屑病性关节炎
Reiter’s综合症 反应性关节炎 沙门氏菌感染 志贺氏菌感染
55
37 29.7 20.7
耶尔森氏菌感染
淋病双球菌感染 正常人群
17.6
14.0 2～7
3
血清阴性脊柱关节病（脊柱关节炎）
这是一组慢性炎症性风湿性疾病，具有特定的病理生理、临床、放射
学和遗传特征，炎性腰背痛伴或不伴外周关节炎，加之一定特征的关
节外表现是这类疾病特有的症状和体征。这一类疾病包括：强直性脊 柱炎(ankylosing spondylitis，AS)，反应性关节炎(reactive arthritis，ReA)，
银屑病关节炎(psoriatic arthritis，PsA)，炎症性肠病性关节炎(arthropathy
与革兰氏阴性杆菌有一定相关性：
5
血清阴性脊柱关节病共同特点
临床上有很多共同或重叠之处：
眼炎，尿道炎，前列腺炎， 口腔、肠道和生殖器溃疡 结节性红斑，银屑病样皮疹 坏死性脓皮病，血栓性静脉炎
基本病理变化以肌腱端周围和韧带附着于骨的部位为主(附着端炎)而
非滑膜，也可发生在眼、主动脉瓣、肺实质和皮肤，而不同于以滑膜 病变为主的类风湿性关节炎，而且无类风湿皮下结节。
强直性脊柱炎 地区分布 性别分布 种族差异大 男＞女 类风湿性关节炎 世界性 女＞男
年龄
家族史 类风湿因子
20-30
明显 （－）
30-50
不明显 （）
7
HLA-B27与AS
HLA-B27阴性的AS
约5-10%的AS患者为HLA-B27阴性 AS患者的HLA-B27阳性率达90-95% 我国汉族人群HLA-B27阳性率2-7%（3千万-1亿），AS患病 率为0.3%（＞4百万），大部分HLA-B27阳性者并不发生AS。
of inflammatory bowel disease，IBD)，未分化脊柱关节炎和幼年慢性关节 炎。几种脊柱关节炎病情逐渐进展，都可能发展成典型的强直性脊柱
炎
4
血清阴性脊柱关节病共同特点
RF（一） 家族聚集现象
与HLA-B27不同程度相关
皆可影响脊柱，都有不同程度的骶髂关节炎，也可影响外周关节 ，下肢关节多于上肢关节，且呈不对称性。 强直性脊柱炎与肠道肺炎克雷白杆菌相关 Reiter综合征与沙眼衣原体、福氏痢疾杆菌相关 反应性关节炎与沙门杆菌、痢疾杆菌、耶尔森菌和HP相关
8
HLA-B27与AS
健康人群HLA-B27阳性率及AS患病率各地区、种族有显著的差异 HLA—B27与强直性脊柱炎的发病有很强的相关性
两种错误认识：HLA-B27阳性≠AS！
HLA-B27阳性不会转阴！ HLA-B27阳性率 中国人 欧洲白种人 南非黑人 美国黑人 印地安人 2-7% 4～13％ 1％ 2～4％ 9～50％ 6～12％ AS患病率 0.3% 1％ 很低 AS患者B27阳性率 90～95% 80～100% 22% 57% 80～100%
杨雅琼等．现代检验医学杂志，2002,17(2):60-62
13
流式细胞术法
利用荧光标记的HLA-B27单克隆抗体，与细胞表面的B27抗原结合，使
结合后的淋巴细胞具有一定的荧光强度，这种荧光强度可由流式细胞
仪测得的通道值来反映，以其值的高低判断HLA-B27抗原表达百分比 ，从而判断HLA-B27是否阳性。
优点：全自动仪器检测，减少了人为因素的影响，重复性高，结果判
断准确，为目前较为理想的方法，国外已将FCM法检测HLA-B27作为AS 诊断的常规检测方法。
缺点：仪器昂贵，目前只在较大医院应用，且荧光易淬灭。
9
HLA-B27检测方法及评价
抗原水平
微量细胞毒法 ELISA IMS-ELISA 流式细胞术法
基因水平
PCR-SSP
10
微量细胞毒法（microlymphocytotoxic test，MLCT）
原理：如果受试者淋巴细胞表面表达有相应的HLA-B27抗原，就可以
与B27抗体结合，形成Ag-Ab复合物激活补体，发生对细胞膜的破坏及
蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的
HLA-B27呈正相关。
其结果与MLCT法符合率为99％，且不受感染因素的影响，重复性好。
12
磁珠酶联免疫分析（IMS-ELISA）
磁珠分离与ELISA结合
B27单抗标记磁珠
HRP标记CD45单抗 通过磁场分离游离相
优点：
反应时间短（1ห้องสมุดไป่ตู้时完成） 对标本新鲜度要求不高 2～8℃静置4 d之内可用
数量或结构改变，影响MLCT的结果，易出现假阴性。
11
ELISA
原理：应用双抗体夹心酶标免疫分析法测定标本中HLA-B27水平。用
纯化的B27抗体包被微孔板，依次加入HLA-B27抗原（待检标本）、生
物素化的抗HLA-B27抗体、HRP标记的亲和素，形成双抗体夹心反应， 经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成
HLA-B27检测及其临床应用
徐美胜 2016年11月24日
1
HLA-B27及其临床应用
HLA-B27疾病相关
血清阴性脊柱关节病类型及特点 强直性脊柱炎特点及其与B27关联机制
HLA-B27 检测方法
MLCT、ELISA、IMS-ELISA、FCM、PCR-SSP
2
HLA-B27相关疾病
6
HLA-B27相关疾病：强直性脊柱炎
Ankylosing Spondylitis，AS
患病率：0.3%，20-30岁，男女比例 10:1，有家族倾向； 主要侵犯：中轴关节（骶髂关节、脊柱骨突、脊柱旁软组织）
可伴发外周关节及关节外表现，严重者发生脊柱畸形和关节强直
B27检测可作为有相关症状或高危人群AS早期的筛选方法！ AS不是RA的一种特殊类型！
细胞杀伤作用，通过染色法观察，死细胞的细胞膜通透性改变，染料 能够进入使之着色，而活细胞细胞膜完整不被染色。根据死细胞占全
部细胞的百分比，可以判断受试者淋巴细胞表面是否存在HLA-B27抗
原及其与抗体的反应强度。
优点：不需特殊仪器设备，易于操作，一般的实验室都可开展。
缺点：标本存放不能超过8小时；感染可以使细胞膜表面的B27分子的