18 平面色谱法
第十八章平面色谱法
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六、薄层扫描法
• 薄层扫描法是用一定强度光束照射薄层上的斑点， 用仪器测量照射前后光束强度的变化，从而求得 物质含量的方法。
• • • •
检测方法 测量方法 扫描方式 定量方法
吸收测定法和荧光测定法 投射法和反射法 单波长和双波长 外标两点法定量
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《分析化学》系列课件
平面色谱法
贵阳医学院药学院 分析化学教研室
第十八章
平面色谱法
• 定义：平面色谱法(plane chromatography)是在平面上进 行分离的一种色谱方法；主要包括薄层色谱法、纸色谱 法和薄层电泳法。
• 第一节 平面色谱法的分类和原理
一、平面色谱法的分类
薄层色谱法 纸色谱法 薄层电泳法
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参考书及文献
1.《分析化学》（第四版）下册，孙毓庆主编，人民卫生出版社 2．周同惠等．纸色谱和薄层色谱。分析化学丛书．第三卷．第 五册．北京：科学出版社，1989． 3．林珍安等译．高效薄层色谱．上海：上海科技出版社， 1984． 4.孙毓庆主编．薄层扫描法及其在药物分析中的应用．北京，人 民卫生出版社，1990． 5.Fried Band Sherma J．Thin-layer Chromatography．New York： Marcel Dekker lnc，1982． 6. Grinberg N．Modern Thin-layer Chromatography．New York： Marcel Dekker lnc，1990。 7.Sherma J and Fried B．Handbook of Thin-Layer Chromatography. New York：Marcel Dekker lnc，1991.
HPLC的常用术语解释
HPLC的常用术语解释高效液相色谱法(HighPerformanceLiquidChromatography\HPLC)又称"高压液相色谱'、"高速液相色谱'、"高分别度液相色谱'、"近代柱色谱'等。
它是在生化和分析化学中常用的柱层析仪。
接下来我为大家整理了HPLC的常用术语解释，希望对你有关怀哦!第一部分色谱曲线1、色谱图(chromatogram)：色谱柱流出物通过检测器系统时所产生的响应信号对时间或流淌相流出体积的曲线图，或者通过适当的〔方法〕观看到的纸色谱或薄层色谱斑点、谱带的分布图。
2、(色谱)峰(chromatographic peak)：色谱柱流出3、峰底(peak base)：峰的起点与终点之间的连接的直线4、峰高(h ，peak height)：色谱峰最大值点到峰底的距离(图1 中的BE)。
5、峰宽(W ，peak width)：在峰两侧拐点(图1 中的F ，G)处所作切线与峰底相交两点的距离6、半高峰宽(W h/2 ，peak withd at half height)：通过峰高的中点作平行于峰底的直线，此直线与峰两侧相交两点之间的距离(图1 中的HJ)。
7、峰面积(A ，peak area)：峰与峰底之间的面积8、拖尾峰(tailing peak)：后沿较前沿平缓的不对称的峰。
9、前伸峰(leading peak)：前沿较后沿平缓的不对称的峰。
(又叫伸舌峰、前延峰)10、假峰(ghost peak)：除组分正常产生的色谱峰外，由于仪器条件的转变等缘由而在谱图上出现的色谱峰，即并非由试样所产生的峰。
这种色谱峰并不代表具体某一组分，简洁给定性、定量带来误差。
(又叫鬼峰)11、畸峰(distrorted peak)：样子不对称的色谱峰，前伸峰、拖尾峰都属于这类。
12、反峰(negative peak)：也称倒峰、负峰，即出峰的方向与通常的方向相反的色谱峰。
平面色谱法(山西医科大学)
第十九章平面色谱法平面色谱法（plane chromatography）是组分在以平面为载体的固定相和流动相之间吸附或分配平衡而进行的一种色谱方法。
该法具有操作简单，不需要昂贵的仪器设备，分析速度快，结果直观，并有较高的分离能力。
平面色谱法主要包括薄层色谱法（thin layer chromatography；TLC）和纸色谱法（paper chromatograph）。
纸色谱法出现于20世纪的40年代，主要用于微量分析，特别在生化和医药分析中的应用十分广泛。
但色谱纸的机械强度较差，传质阻力大，使该法的应用和推广受到了限制。
20世纪60年代，薄层色谱法的发展和普及，使得纸色谱法的应用逐渐减少。
20世纪80年代出现了仪器化薄层色谱法（instrumental thin layer chromatography），薄层色谱的每一步骤均由仪器来代替以往的手工操作，再配以薄层扫描仪，这样就使在较长时期内被认为只能用来定性和半定量的薄层色谱法定量结果的重现性和准确度大大提高，成为一种有价值的分离分析方法。
第一节平面色谱法的分类和原理一、平面色谱法的分类平面色谱法按操作方式可分为：1．薄层色谱法薄层色谱法是把固定相均匀地涂布在玻璃板、塑料板或铝箔上形成厚薄均匀的薄层，在此薄层上进行混合组分分离的色谱法。
按照薄层色谱法的分离机制不同，薄层色谱法又可分为吸附薄层色谱法、分配薄层色谱法和分子排阻薄层色谱法。
2．纸色谱法纸色谱法的固定相一般为纸纤维上吸附的水分，流动相为与水互不相溶的有机溶剂，根据被分离混合组分在水和有机溶剂中的溶解能力不同，在色谱纸上产生差速迁移而得到分离的方法。
纸色谱分离原理属于分配色谱的范畴。
3．薄层电泳法 薄层电泳法是带电荷的被分离物质（蛋白质、核苷酸、多肽、糖类等）在纸、醋酸纤维素、琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶等惰性支持体上，以不同速度向其电荷相反的电极方向泳动，产生差速迁移而得到分离的方法。
平面色谱法-su
汇报人：XX
01 单 击 添 加 目 录 项 标 题 02 平 面 色 谱 法 的 概 述 03 平 面 色 谱 法 的 技 术 发 展 04 平 面 色 谱 法 的 实 验 操 作 05 平 面 色 谱 法 的 应 用 实 例 06 平 面 色 谱 法 的 未 来 展 望
目录
01 添加章节标题
实验步骤：样 品处理、色谱 展开、显色、
测量等
实验注意事项： 避免阳光直射、 保持色谱板平 整、防止样品
污染等
实验步骤
准备实验材料：色谱板、样品、溶剂、显色剂等 制作色谱板：在色谱板上均匀涂抹样品，晾干 展开色谱：将色谱板放入溶剂中，使样品在色谱板上展开 显色：在色谱板上喷洒显色剂，使样品显现出来 观察结果：在紫外线灯下观察色谱，分析样品的组成和含量
检测生物体内的有机污染 物
在其他领域的应用
医药领域：分 离药物中的有
效成分
食品领域：检 测食品中的添 加剂和污染物
环境领域：监 测环境中的污 染物和生态变
化
化工领域：分 离化工产品中 的杂质和副产
物
06 平面色谱法的未来 展望
技术创新和改进
提高分辨率：通过改进色谱仪和检测器，提高分辨率，使分析结果更加精确。
对未来科学发展的影响
平面色谱法在药 物分析中的应用
平面色谱法在环 境监测中的应用
平面色谱法在食 品分析中的应用
平面色谱法在生 物医学研究中的 应用
THNK YOU
汇报人：XX
加快分析速度：通过优化色谱条件，提高分析速度，缩短分析时间。
扩展应用范围：通过开发新的色谱模式和检测方法，扩展平面色谱法的应用范围，使其能 够应用于更多领域。
提高自动化程度：通过引入自动化设备和软件，提高平面色谱法的自动化程度，降低操作 难度，提高分析效率。
平面色谱法
3.扫描方式 直线扫描和曲折扫描。 （二）定量分析法 常用外标一点法。
m样 A样 m标 A标
2014~2015学年
第三节 纸色谱法简介
以纸做载体进行的液-液分配色谱法
固定相：纸纤维吸附的水 流动相：与水不互溶的有机溶剂（饱和正丁醇） 分离机制：同液-液分配色谱 定性参数：
L 1 Rf L0 1 K VS Vm
讨论：Rf与组分性质、流动相及溶解度有关 极性组分→易保留，Rf 小（流动相极性↑， Rf ↑） 非极性组分→易流出，Rf大（流动相极性↑，Rf ↓）
2014~2015学年
（二） 相对比移值Rr
相对比移值：是在一定条件下，被测组分的比移值与参 考物质的比移值之比。
原点到组分斑点中心的距离 L1 Rr R f（参） 原点到参考物斑点中心的距离 L2
讨论
•
R f（组）
参考物与被测组分在完全相同条件下展开，可以消除系统 误差，大大提高重现性和可靠性. 参考物可以是后加入的纯物质，也可是样品中已知组分。 相对比移值Rr与组分、参考物性质及色谱条件有关，范围 可以大于或小于1.
吸附剂裝于柱中。都是经典液相色谱法的一种。
2014~2015学年
（四）薄层色谱操作方法
操作步骤:制板、点样、展开、斑点定位 1.制板 ⑴薄层板的选择：表面光滑、平整、洁净、厚度均匀
⑵薄层板的涂布： 软板（不加粘合剂)：干,湿法铺 硬板（加粘合剂）：湿法铺板(匀浆） 要求：涂布均匀 ，厚度0.25mm ~ 0.5mm 常用硅胶： 硅胶G——自含粘和剂 硅胶H——不含粘和剂，铺板时另加入CMC-Na 硅胶G254——含荧光剂，254nm紫外光照发绿光 硅胶HF356——含荧光剂，356nm紫外光照发光
第十八章 平面色谱法-分析化学
d
28
5、显色
xe 仪 器 分 析
第 十 八 章 经 典 液 相 色 谱 法
日光下观察有色物质的色斑 紫外灯下观察荧光或无荧光色斑 通用显色剂：碘、硫酸、荧光黄
专用显色剂：茚三酮、三氯化铁
显色方法：直接喷雾法、浸渍法
d
29
四、定性与定量分析方法
xe 仪 器 分 析
第 十 八 章 经 典 液 相 色 谱 法
一般在105℃～110℃加热30分钟。但加热 温度不可太高，否则易使硅胶失活：
O H + Si O H Si O 5000C Si Si + H2O
d
硅胶具有微酸性，适用于分离酸性和中 性物质，如有机酸、氨基酸、甾体等
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2、氧化铝
xe 仪 器 分 析
第 十 八 章 经 典 液 相 色 谱 法
目视法：直接比较样品斑点与对照 品斑点的颜色深度或面积大小； 薄层扫描法
d
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五、高效薄层色谱法(HPTLC)
xe 仪 器 分 析
第 十 八 章 经 典 液 相 色 谱 法
1、高效薄层板
由较小颗粒的吸附剂(或其他固定相) 用喷雾法制备而成的均匀薄层。
2、点样 要求：原点直径小；铂-铱合金点 样毛细管、专用点样器
第 十 八 章 经 典 液 相 色 谱 法
被分离物质的结构和性质 薄层板的性质，固定相的粒度， 薄层的厚度，吸附剂的活度 温度（主要对分配层析）
d
展开室内的展开剂蒸气饱和程度
7
3、分离参数
xe 仪 器 分 析
第 十 八 章 经 典 液 相 色 谱 法
分离度
2d R W1 W2 R
d
12
第十八章平面色谱法(五版)
(2) 硬板的铺制方法：
薄层板是用专门的涂布器把浆状的吸附剂（硅胶 或氧化铝，200～250目）均匀地涂在长条形玻璃板上 （厚度0.15～0.5mm）。干燥后即可使用。
第十八章平面色谱法(五版）
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4. 活化:
硅胶板先晾干，再在 105 ～ 110C 活化 0.5～1 小时。
层上展开，比较组分与对照品的Rf值。
第十八章平面色谱法(五版）
25
（二）定量分析
1. 洗脱测定法： 斑点定位斑点取下洗脱适当方法测定。
2. 直接测定法： •目视比较法: 比较样品斑点与对照品斑点的 颜色深度或面积大小 •薄层扫描法: 测量斑点的面积大小。
第十八章平面色谱法(五版）
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六.薄层扫描法简介
以一定波长的光照射展开后的薄层色 谱板，侧定其对光的吸受或所发出的 荧光，进行定量分析的方法。
第十八章平面色谱法(五版）
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双 波 长 薄 层 扫 描 仪 光 路 示 意 图
第十八章平面色谱法(五版）
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波长的选则： 测定波长：斑点中化合物的 max 参比波长：斑点中化合物无吸收的波长
目的：消除背景吸收
冷却即可使用．也可保存于干燥器中备用。
第十八章平面色谱法(五版）
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（二）点样
1. 样品溶液的制备：
应尽量避免用水作溶剂， 一般用甲醇、乙醇、丙酮、氯仿等挥发性有机溶剂 溶解样品。
2. 点样：用微量注射器或玻璃毛细管吸取一定量试样
点在原点上。试样点的直径一般应小于4mm。可并 排点多个试样同时展开。
第十八章平面色谱法(五版）
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注意：➢ 点样线距底边1.5 ～2cm处。 ➢ 斑点面积越小越好。
平面色谱法习题答案
第十八章 平面色谱法思考题和习题1．名词解释平面色谱法 比移值 相对比移值 分离度 分离数 荧光薄层板 高效薄层色谱 边缘效应2．在吸附薄层色谱中如何选择展开剂？欲使某极性物质在薄层板上移动速度快些，展开剂的极性应如何改变？主要应根据被分离物质极性、展开剂极性以及吸附剂的活度三方面来选择。
被分离物质极性 吸附剂的活度 展开剂极性 大 小 大 小 大 小欲使某极性物质在薄板上移动速度快些，展开剂的极性应增大。
3．薄板有哪些类型？硅胶-CMC 板和硅胶-G 板有什么区别？见教材P381页4．薄层色谱的显色方法有哪些？①在日光下观察，划出有色物质的斑点位置。
②在紫外灯（254 nm 或365 nm ）下观察有无暗斑或荧光斑点，并记录其颜色、位置及强弱。
能发荧光的物质或少数有紫外吸收的物质可用此法检出。
③荧光薄层板检测。
适用于有紫外吸收物质，荧光薄层板在紫外灯下，整个薄层板呈黄绿色荧光，被测物质由于荧光猝灭作用而呈现暗斑。
④既无色，又无紫外吸收的物质，可采用显色剂显色。
薄层色谱常用的通用型显色剂有碘、硫酸溶液和荧光黄溶液等。
5．在薄层色谱中，以硅胶为固定相，氯仿为流动相时，试样中某些组分R f 值太大，若改为氯仿－甲醇(2:1)时，则试样中各组分的R f 值会变得更大，还是变小？为什么？以硅胶为固定相的应为吸附薄层色谱，氯仿为流动相时，试样中某些组分R f 值太大，若改为氯仿－甲醇(2:1)时，则试样中各组分的R f 值会变得更大，此时应加入适量极性小的溶剂如环已烷，以降低展开剂的极性。
6．在硅胶薄层板A 上，以苯－甲醇(1:3)为展开剂，某物质的R f 值为0.50，在硅胶板B 上，用相同的展开剂，此物质的R f 值降为0.40，问A 、B 两种板，哪一种板的活度大？B 板的活度大。
7．已知A ，B 两物质在某薄层色谱系统中的分配系数分别为100和120。
问哪一个的R f 值小些？ 根据kV K V V R s m m f +=⋅+=11可知，分配系数K 越大， R f 越小，因此分配系数为120的物质R f 小些。
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练 习
1. 已知某混合试样a、b、c三组分的K分别为400、 450、500，则a、b、c在薄层上的Rf值的大小顺序 为：
A Rf(a)> Rf(b)> Rf(c)
C Rf(b)> Rf(a)> Rf(c)
B Rf(c)> Rf(b)> Rf(a)
D Rf(a)> Rf(c)> Rf(b)
练 习
第十八章 经典液相色谱法
内容回顾
色谱分离原理： 利用物质在固定相与流动相之间的 分配系数差异而实现分离。
Cs ms K k Cm mm Vs kK Vm t` k R
t0
概述
经典柱色谱法 经典 液相 色谱 平面色谱法 现代柱色谱法
薄层色谱法 (TLC) Thin layer Chromatography 纸色谱法 Paper Chromatography
经典柱色谱法
18.2 液－固吸附柱色谱法
18.2.1 分离原理
固定相：固体吸附剂 吸附剂一般是多孔性微粒状物质，具有较大的
比表面积，表面有许多吸附中心。
吸附是溶质在吸附剂表面的集中浓缩现象。
吸附色谱法的分离原理（P449）
吸附剂一般是多孔性微粒状物质，具有较大的比表 面积，表面有许多吸附中心。 吸附与竞争
三、平面色谱操作方法
制板 点样
定性分析
展开
显色 分析
定时展开
定位 定性分析、定量分析
洗脱法 直接定量法
六、薄层扫描法（p472）－定量方法
尿中雌三醇含量的测定
取尿液5mL，加3.0g硫酸 铵，离心后取沉淀，然 后在pH9.5条件下用乙醚 萃取；在碱性条件下， 萃取液的雌三醇与丹酰 氯作用，生成丹酰雌三 醇。用薄层展开荧光扫
2. 有性质相近的A、B两物质，其混和试样用TLC
分离时，Rf值分别为 0.45、0.63，欲使分离后两组
分色斑中心的间距为 2.00cm ，问溶剂前沿至样品 原点的距离为多少厘米？ 解：设A组分的展距为X,则组分的展距为X＋2 X X 2 R fA 0.45 R fB 0.63 L0 L0 2 X 11.1cm 0.63 0.45
11木糖 12鼠李糖
三、平面色谱操作方法
制板 点样
定性分析
展开
显色 分析
定时展开
定位 定性分析、定量分析
四、定性参数（P463）
1、比移值
原点到组分斑点质量中 心的距离 L1 Rf 原点到溶剂前沿的距离 L0
Rf范围：0< Rf <1 （组分迁移速度和距离小于展开剂 迁移速度和距离） Rf = 0.2——0.8（常用） 0.3——0.5（最佳）
2. 相对比移值Rr
R f（i） 原点到组分斑点质量中 心的距离 Li Rr R f（s） 原点到参考物斑点质量 中心的距离 Ls
•
• •
讨论 参考物与被测组分在完全相同条件下展开 可以消除系统误差，大大提高重现性和可靠性； 参考物可以是后加入纯物质，也可是样品中已知组分 相对比移值Rs与组分、参考物性质及色谱条件有关， 范围可以大于或小于1
硅胶GF254
三、平面色谱操作方法（p468）
制板 点样 展开 显色 分析 定时展开 定位
有色物质：日光
定位
显色
有紫外吸收 或有荧光物质：紫外光 用荧光板
石油醚（60～90℃） -乙酸乙酯（9:1）
用显色剂
1乙二醇
2丙三醇 3丁四醇
4糖醛酸
5甘露糖 6阿拉伯糖
7果糖
8半乳糖 9葡萄糖
10岩藻糖
描法检测.
第三节 纸色谱法
将固定相放在纸上，以纸做载体进行点样、展开、
定性、和定量的液-液分配色谱法
固定相：纸纤维吸附的水 流动相:与水不互溶的有机溶剂（水饱和正丁醇）
分离机制：液-液分配色谱，溶解度的不同 1 定性参数： R f 1 K VS Vm
1 Rf 1 K VS Vm
讨论：Rf与组分性质、流动相及溶解度有关 极性组分→易保留，Rf 小（流动相极性↑， Rf ↑）
非极性组分→易流出，Rf大（流动相极性↑，Rf ↓）
CHO H HO H H OH H OH OH CH2OH
CHO HO HO H H CH3 H H OH OH
CHO
H H H H CH3
H OH OH OH
在吸附剂上被吸 附的流动相分子
吸附 Xm + nYa 解吸附
流动相中 的溶质分子 在吸附剂上被 吸附的溶质分子
Xa + nYm
二、常用吸附剂
1. 硅胶（SiO2· H2O） 结构：内部——硅氧交联结构→多孔结构
表面——有硅醇基→氢键作用→吸附活性中心
吸附活性次序：活泼型>游离型>束缚型
1. 硅胶（SiO2· H 2O ）
3 相平衡参数
1 Rf 1 k
(1) K R f
1 Rf 1 KVs / Vm
（2）薄层板一定，对于极性组分 展开剂极性↑大，Rf↑大（容易洗脱） 展开剂极性↓小，Rf↓小 （不容易洗脱）
4 分离参数
R 2(L2 L1 ) /( W1 W2 ) 2d /( W1 W2 )
（3）流动相的极性
18.2.3 色谱条件的选择
（1）被测物质的结构与性质 物质极性
a. 基本母核相同，则分子中基团的极性越强，整个 分子的极性也越强 b. 分子中双键越多，吸附能力越强，共轭双键多， 吸附力也增强
（2）吸附剂的选择(活度)
（3）流动相的选择 极性相似相溶原理
分离极性大的组分，选用极性大的溶剂作为流动相； 分离极性小的组分，选用极性小的溶剂作为流动相; 吸附与竞争
1）吸水→失活
a) 硅胶的活性与含水量有关，含水量高，活度级数 高，吸附力弱。
b) 105～110℃烘干30分钟(可逆失水)→吸附力最大
OH Si + OH Si Si O Si + H2O
c）500℃烘干(不可逆失水)→活性丧失，无吸附力
1. 硅胶（SiO2· H2O）
2）与极性物质或不饱和化合物形成氢键 物质极性↑，吸附能力↑→强极性吸附 中心，不易洗脱
薄层色谱法（p469）
将固定相均匀地涂铺在玻璃板、铝箔或 塑料板上形成薄层，点样后用展开剂 （流动相）将其展开，然后将薄层板斑
点定位后分析的方法。
薄层扫描仪
一、薄层色谱法的主要类型
吸附薄层色谱法 固定相－吸附剂
硅胶H 硅胶G
吸附剂：硅胶(10~40um)、 硅胶HF254 氧化铝 分配薄层色谱法 固定相－液体
适用：分析酸性或中性物质 如有机酸、氨
基酸、甾体。
2. 氧化铝
碱性氧化铝 pH 9～10 适于分析碱性、中性物质 中性氧化铝 pH＞7.5 适于分析酸性碱性和中性物 质
酸性氧化铝 pH 4～5 适于分析酸性、中性物质
18.2.3 色谱条件的选择
洗脱作用 洗脱作用 实质上是流动相分子与被分离
的组分分子竞争占据吸附剂表面活性中心的过程。 优化实验条件，使各组分分离： （1）试样的结构和性质 （2）吸附剂的选择(活度)