生物发光检测
ATP生物发光检测方法
ATP生物发光技术以生物体内的ATP作为检测 对象，不仅包括细菌（大肠杆菌，沙门氏菌， 志贺氏菌等），也包括体细胞在内的食品残 渣等食品污染物，因此适合在食品卫生检测 领域对卫生状况进行快速检测。 ATP生物发光检测方法具有检测速度快、成本 低、易于操作等特点
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检测原理
• ATP即三磷酸腺苷，是广泛存在于生物体内的一种能量物
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检测仪器
• 结构原理 • 主要有三部分：自动进样单元、光电转换
单元和信号采集处理及控制单元
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• 其中，自动进样单元包括三套蠕动泵 。根据测试需要，
蠕动泵在控制单元控制下，向光电转换单元中的样品池加 入对应反应试剂。光电转换单元包括检测样品池和光电转在暗盒中。光电转换器件将反应释放荧光转化为电信号， 由信号采集处理单元采集并处理，并对测试结果进行实时 显示和存储。
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• 图中各响应曲线400 s内的测量值进行积分，作为各浓度
样品的输出信号。输出信号与浓度的关系如图5所示。由 图可以看出，输出信号随浓度增加而增加，且有明显梯度， 两者的线性相关系数达到0.986。这一结果说明本检测系 统可以对ATP浓度进行快速检测。由于细菌细胞中所含 ATP含量基本一致，因此，本检测仪可实现对细菌总数的 现场快速检测。
放荧光强度的时间响应曲线。
• 本设计的针对细菌总数的检测仪具有检测速度快、
自动化程度高、操作简单、小型便携等特点，在 口岸、卫生监管部门、食品生产部门等对产品、 环境等的卫生状况进行现场快速检测领域具有很 好的应用前景。
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• 实验选择标准ATP样品作为检测对象，浓度
范围为10-6～10-14mol／L，实验中所用荧 光素及荧光素酶购自美国普洛麦格公司。 实验采用联机测量方式，将本检测仪与计 算机通过。RS232接口相连接，仪表信号采 集单元采集荧光信号后直接上传至计算机 并将测试结果实时显示。测量结果如图4所 示。
生物学发光检测法(ATP)解析
权威机构研究了1000个以上的样品，这种只需十几秒就能完
成检测的快速检测法所得实验结果90%以上与24-48小时标 准细菌培养法/平皿法所得结果一致 使细菌检查的工作量大幅度减轻，实现卫生监控的简捷化、 效率化，但只能用于细菌的定量分析，定性分析可用常规方 法进行培养检测。 应用于HACCP的关键环节监测，方便有效。
[INSERT AND DETECT]
将检测管放入ATP荧光检 测仪中，盖上盖子，倒 计 时开始并检测。
ATP检测反应原理
D-虫荧光素 荧光素酶 O2+Mg2+
氧化荧光素 PPi+AMP
AT P
荧 光 光 度 计 测 量
光（RLU ）
植物 微生物
细胞 数量
现场ATP检测的意义
ATP检测技术实验结果准确可靠，值得信赖。美国多个专业
当时，除个别省级卫生监督单位装备，主要在一些外资、
合资企业用于自检 2002年我国卫生部颁发了食品加工企业的HACCP实施 指南，鼓励食品加工企业引入ATP检测技术 2005年3月卫生部新出台《卫生监督机构建设指导意 见》，要求省、市、地配置
什么是ATP
ATP——三磷酸腺苷 【adenosine triphosphate， C10H16N5P3O13】存在于所有 生物体中，在细胞内主要作用 是提供能量 通过检测ATP ，可以间接地 证明生物体的存在
生物学发光检测法（ATP）
• 原理：ATP荧光检测仪基于萤火虫发光原理，利 用“荧光素酶—荧光素体系”快速检测三磷酸腺 苷（ATP）。由于所有生物活细胞中含有恒量的 ATP，细菌细胞裂解时会释放出ATP，ATP自细 菌细胞释放出来后，使用荧光虫素和荧光虫素酶 可使之释放出能量，这些能量产生莹光，光的强 度就代表ATP的量。ATP含量可以清晰地表明样 品中微生物与其他生物残余的多少，用于判断卫 生状况
化学发光分析和生物发光分析在医学检验中的应用
化学发光分析和生物发光分析在医学检验中的应用化学发光分析是一种利用化学反应产生发光的分析方法。
它与其他分析方法相比具有高灵敏度、宽线性范围和较低检测限等优点。
在医学检验中，化学发光分析主要应用于药物浓度检测、肿瘤标志物检测、生化指标检测等方面。
首先，化学发光分析在药物浓度监测中发挥着关键的作用。
根据化学发光分析原理，通过测定药物产生的发光信号强度，可以准确测定药物在体内的浓度。
这对于临床医生调整药物剂量、监测药物疗效和副作用等具有重要意义。
例如，青霉素药物浓度检测是常见的应用之一，药物在血液样品中与含有发光底物的系统发生反应，并发出可测定的发光信号，进而确定药物浓度。
其次，化学发光分析在肿瘤标志物检测中具有广泛应用。
肿瘤标志物是指一些特定蛋白质、多肽或糖类，其在肿瘤形成和发展过程中会发生相应的变化。
通过检测肿瘤标志物的浓度变化，可以对肿瘤的诊断和疾病进展进行评估。
化学发光分析可以通过特定反应体系，使样品中的肿瘤标志物与发光底物结合，从而测定其浓度。
这种方法具有灵敏度高、准确性强的优势。
例如，CA125标志物检测在卵巢癌的诊断中被广泛应用，通过化学发光分析可以对CA125标志物进行测定，帮助医生判断病情。
最后，生物发光分析是利用生物体内发光反应产生的发光信号进行分析的方法。
生物发光分析主要通过测定生物发光反应的光强来确定需要分析的物质的浓度和活性。
在医学检验中，生物发光分析常用于病原体检测、DNA检测和免疫分析等方面。
生物发光分析在病原体检测中发挥重要作用。
通过使用特定的生物发光分析试剂盒，可以对多种常见的致病菌如大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等进行快速检测。
这种检测方法不仅具有高灵敏度、快速和准确性，还可以提供特定病原体的定量结果。
此外，生物发光分析还可应用于基因检测和免疫分析。
例如，在基因检测中，可以使用荧光标记的探针进行基因突变的检测，通过测定发光信号的强度来确定是否存在基因异常。
在免疫分析中，可以通过测定免疫反应的特定生物发光信号来定量分析免疫指标的含量。
生物发光技术在医学检测中的应用
生物发光技术在医学检测中的应用生物发光技术，是指利用生物体内的发光物质，在光辐射的作用下发出光信号。
生物发光信号的检测可以应用于许多领域中的生物学和医学研究，常常用来检测蛋白质、核苷酸、酶活性等。
在医学检测方面，生物发光技术非常有用，因为它以其高灵敏度、高通量和易操作等特点，成为了一种有效的检测方法。
一、生物发光技术的原理生物发光技术主要利用生物发光物质——荧光素、琥珀酸酯和ATP等，这些物质可以被加入细胞培养基中。
当这些物质受到激发，它们会发出光信号，这个信号可以通过检测仪器检测到，从而用来定量分析生物体内的物质。
其次，生物发光技术还可以通过酶介导的化学反应来实现。
常用的系统包括荧光素酶（Luciferase）和过氧化物酶（Horse radish peroxidase, HRP）。
对于荧光素酶系统，荧光素酶能将荧光素和ATP反应生成荧光素腺苷酸（L-AMP），L-AMP经过一系列反应，使氧气和荧光素反应，在光子的作用下产生强烈的荧光信号。
而对于过氧化物酶系统，金标法就是利用过氧化物酶催化产生的生物发光信号。
二、生物发光技术在医学领域中的应用生物发光技术在医学检测中已经被广泛应用，其中最重要的应用就是实时定量PCR（qPCR）。
qPCR就是通过荧光素酶或其他发光物质对PCR过程中生成的产品进行定量分析，以便确定模板中具体的基因组或RNA分子的数量。
生物发光技术作为PCR技术中的一个致命环节，其高灵敏度和高通量检测能力已经被普遍认可。
在临床检测中，生物发光技术也得到了广泛的应用。
例如，通过检测某些抗体来确定某些疾病的关联性。
同时，酶标法等技术已经成为最广泛使用的生物发光技术之一，在检测蛋白质、核酸和抗体等时起到了积极的作用。
除此之外，生物发光技术在药物筛选、基因功能研究等领域也有较广泛的应用。
因为药物对于特定目标蛋白的影响可以通过检测药物对该蛋白的影响而得到，而某些基因的活性与荧光素酶活性有关，因此可以通过检测荧光素酶活性来检测基因的表达与活性变化。
临床微生物 发光法
临床微生物发光法
生物发光是由于生命活体、生物体本身所产生的一类特殊的化学发光现象，促进生物体本身发光需要利用激发能，这种激发能来自于生物体内酶的崔化反应。
生物发光法是一种快速的微生物检验法，由于生物发光法具有操作简更、灵敏度高、能够随时进行检测等一系列优点，所以其在微生物的检验中应用的非常广泛。
微生物的检验涉及到的方面非常广泛，特别是在食品加工的过程中对食品的质量进行严格的监控。
如果对食品中的细菌检验采用常规的方法检验，就必须采用琼脂平板菌数计数法，但是这种检验方法需要2-3天的时间才能出结果，所以这种检验结果对食品检验有很大的滞后性，由于很多食品必须在生产的当天进行出售，所以采用常规的琼脂平板菌计数法显然不能满足实际的检验需要，因此对于生物菌的快速测定需要有即时性的微生物检测方法进行快速、准确的检测。
所以有需求就有市场，生物发光法以其快速、准确的测定优势得到了国内外的广泛关注，目前在微生物检验中得到了广泛的应用。
生物发光法是属于化学发光范畴的，是由于生命活性生物体产生的发光现象[B]，发光需要生物体内的激发能，激发能来自于生物体内的荧光素酶的催化作用，生物发光主要有两种类型：萤火虫生物发光和细菌生物发光等，萤火虫生物体发光又需要有ATP参与，所以萤火虫生物发光又被称为ATP依赖性生物发光。
生物发光技术在生物医学检测中的应用
生物发光技术在生物医学检测中的应用生物发光技术指的是利用生物体自身或特殊试剂体系产生的光信号对生物物质进行检测和研究的技术。
它与传统的色谱分离、酶标记、荧光标记等技术相比，具有高灵敏度、高特异性、简单快速、操作方便、不需标记等特点。
因此，在生物医学检测领域中得到了广泛的应用。
生物发光技术在生物医学检测中的应用涵盖了多个领域。
下面将从基因检测、蛋白质检测、细胞分析和药物筛选四个方面来介绍。
基因检测方面，生物发光技术广泛应用于核酸检测领域。
核酸分子在一定条件下可以发出强烈的光信号，因此利用生物发光技术对核酸进行检测可以达到非常高的灵敏度。
例如，用荧光素酶标记的单链DNA探针与目标DNA杂交后，经过多轮放大后，每个DNA杂交物就可以发出可观的荧光信号来。
这种技术可以用来检测病毒、细菌等微生物的核酸，也可以用来诊断基因突变等遗传性疾病。
蛋白质检测方面，生物发光技术在高通量筛选、特异性识别等方面发挥着重要作用。
例如，利用蛋白质激酶与底物结合后产生的ATP放射性同位素进行检测，一些商业化的生物发光分析仪器可以自动完成高通量的蛋白质激酶酶活测定。
此外，利用荧光素酸和荧光素酸酯等特殊底物，可以对多个蛋白质进行检测和鉴定。
例如，荧光素酸酯可以结合酯酶发生反应，释放荧光素酸，由此来判断酶的活性和抑制剂的特异性等。
细胞分析方面，生物发光技术的应用也非常广泛。
例如，利用荧光素酶标记的细胞可以实现对细胞增殖、迁移等生物学特性的研究。
此外，激活的白细胞可以释放分泌的酶类物质使类固醇、干扰素等药物失去活性，荧光素酶标记的类固醇受体可以很好地实现对类固醇药物的筛选。
药物筛选方面，生物发光技术所具备的优点让其在新药筛选中占据了重要位置。
例如，利用荧光素酶标记的细胞株筛选出既对肿瘤细胞具有特异性、并且有显著的细胞毒性的化合物。
此外，基于生物发光技术的高通量药物评价也是当今药物研发领域的主流之一。
总的来说，生物发光技术在生物医学检测中的应用极其广泛，不仅可以检测基因、蛋白质、细胞，还可以用于药物筛选等领域。
生物学发光检测法(ATP)
目
CONTENCT
录
• 引言 • ATP发光检测法的基本原理 • ATP发光检测法在生物学研究中的
应用 • ATP发光检测法的实验方法与技术 • ATP发光检测法的数据分析与解读 • ATP发光检测法的发展趋势与挑战
01
引言
目的和背景
研究目的
通过生物学发光检测法（ATP）快速、准确地检测和评估生物样本中 的活性细胞数量及其代谢状态。
ATP纯化
通过离心、过滤或层析等方法 去除提取液中的杂质和干扰物 质，以获得纯净的ATP溶液。
ATP定量
利用标准曲线法或比色法等方 法对提取的ATP进行定量，以 确定其浓度。
发光反应条件优化与信号检测
发光反应条件
优化反应体系中各组分的浓度和比例， 如荧光素、荧光素酶和ATP等，以获 得最佳的发光效果。
• 高通量筛选
适用于高通量药物筛选和细胞毒性评价，提高研究效率。
• 临床应用
可用于评估肿瘤细胞对药物的敏感性、预测疾病预后等， 为个性化医疗提供依据。
• 环境监测
可用于检测水体、土壤等环境中的微生物活性，评估环境 质量及生态毒性。
02
ATP发光检测法的基本原理
ATP与生物发光的关系
ATP（腺苷三磷酸）是生物体内能量传递的重要分子， 广泛存在于所有活细胞中。
生物发光现象与ATP水平密切相关，ATP浓度越高， 发光强度越大。
通过测量生物体内的发光强度，可以间接反映ATP含 量，从而评估细胞的活性、微生物污染程度等。
ATP发光检测法的反应机制
ATP与荧光素酶（Luciferase） 反应，生成氧化荧光素 （Oxyluciferin）并释放能量。
释放的能量激发荧光素 （Luciferin），使其从基态跃 迁到激发态。
ATP生物发光检测方法
优点
• 目前生物荧光反应法被广泛用于食品加工
条件的快速评价和食品中微生物的快速检 测，同时在HACCP管理中也被广泛用于关 键控制点检测，与传统检测方法不同之处 在于几分钟内可获得结果，而且荧光光度 计是便携式的，使用方便，适合现场检测， 不仅可以检测微小的污染物水平，还能检 测食品加工设备及其表面的清洁程度。
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检测仪器
• 结构原理 • 主要有三部分：自动进样单元、光电转换
单元和中，自动进样单元包括三套蠕动泵 。根据测试需要，
蠕动泵在控制单元控制下，向光电转换单元中的样品池加 入对应反应试剂。光电转换单元包括检测样品池和光电转 换器件。为消除外界光的干扰，整个光电转换单元被密封 在暗盒中。光电转换器件将反应释放荧光转化为电信号， 由信号采集处理单元采集并处理，并对测试结果进行实时 显示和存储。
放荧光强度的时间响应曲线。
• 本设计的针对细菌总数的检测仪具有检测速度快、
自动化程度高、操作简单、小型便携等特点，在 口岸、卫生监管部门、食品生产部门等对产品、 环境等的卫生状况进行现场快速检测领域具有很 好的应用前景。
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atp生物发光检测方法具有检测速度快成本低易于操作等特点aa22检测原理检测原理atpatp即即三磷酸腺苷三磷酸腺苷是广泛存在于生物体内的一种能量物是广泛存在于生物体内的一种能量物检测检测atpatp含量的一种方法是用含量的一种方法是用荧光光度计法荧光光度计法生物发光是生物发光是活细胞在活细胞在荧光素酶荧光素酶催化下发出的荧光目前使用的荧光素催化下发出的荧光目前使用的荧光素酶来源于北美的萤火虫相对分子质量为酶来源于北美的萤火虫相对分子质量为6200062000的蛋白质的蛋白质萤火虫荧光素酶简称萤火虫荧光素酶简称虫光素酶虫光素酶是一种能将化学能转变为是一种能将化学能转变为光能的活性蛋白质即生物催化剂
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一 ATP生物发光法检测原理
ATP生物发光技术的原理是荧光素酶（Lu ciferase）以荧光素（Luciferin）、 三磷酸腺苷（ATP）和O2为底物，在Mg2＋ 存在时，能将化学能转化为光能。 ATP既是荧光素酶催化发光的必需底物，又 是所有生物生命活动的能量来源。在荧光素 酶催化的发光反应中，ATP在一定的浓度范 围内，其浓度与发光强度呈线性关系。
AT P 生 物发光法是利用ATP与虫荧光素一虫荧光素酶反应， 产生光子，再用荧光照度计检测发光值，从而得到ATP的量.
海肾荧光素酶海肾荧光素酶(Renilla luciferase)催化的发光反应， 具有很好的浓度线性范围，酶的检测灵敏度达到10-18 mol。
二、ATP生物发光法检测过程
发光生物
有许多微小甲壳动物和腔肠动物，在 被惊动时会发出闪光。有一些动物虽 然自己不闪光，但把荧光素和荧光素 酶分泌入水中，让它们相互作用，产 生光雾，掩护自己逃走。 但后来在好多鱼类、鱿鱼类和甲壳类 中，也都找到了这种腔肠动物型的荧 光素。 多年前，科学家已经将生物萤光应用 到生命科学领域。与化学荧光 （fluorescence）相比，生物萤光 （bioluminescence）更灵敏、更 可信、效果更好。
●ATP生物发光法检测微生物，需要先将微 生物体内的ATP提取出来，测量其发光值， ●对照由标准ATP试剂测量所得发光值和 ATP的浓度标准曲线，根据发光值得到ATP 的浓度，最后转化为微生物的浓度。
1、试剂与仪器
主要试剂： 荧光素/荧光素酶试剂 标准ATP试剂 缓冲液 ATP提取剂 主要仪器： TD-20/20荧光光度计 抽滤器及真空泵 pH计
第五讲 ATP生物发光检测技术
自然界有很多发光生物体
真菌、甲虫、蠕虫、海星，等等，还有我们 最熟悉的萤火虫 海洋中有好几千种发光生物。深夜，在海中 游泳或岸边漫步时，都会看到海上的“磷光” 现象。这往往是大群甲藻——一种单细胞浮 游生物——受到机械干扰后留下的道道光痕 它们几乎对任一种刺激，如海水中化学成份 的波动、压力突变、超声波和激光刺激等 等，都会有闪光反应, 大多海洋生物都靠荧光 素——荧光素酶系统发光 . 不同的荧光素——荧光素酶反应产生不同的 光
食品细菌快速测定仪
量程范围 0--107cfu/ml 检出时间 : 小于5分钟，
所得试验结果90%以上与标准培养 法所得结果一致。精确度和重复性也 和培养法测定菌落总数相差无几
萤光素酶做报告基因
报告基因是研究基因调控的有力工具，利用萤光素 酶做报告基因的基本的研究方法，是将一段待研究 的DNA序列这段序列——可以是启动子、增强子 或具有潜在调节功能的一段DNA序列——克隆在 一个含有萤光素酶基因的载体上 再将这个载体转染真核细胞，经过一段时间的培养 和不同的外界刺激后，收获细胞并将细胞裂解，然 后测量细胞裂解物的萤光强度。 通过与对照组（未经外界刺激的）细胞裂解物萤光 强度的比较，确定这一段DNA序列的调节功能 （即：启动子功能，增强子功能， 等等）。 萤火虫萤光素酶作为报告基因:因为该蛋白不需要 翻译后加工，所以一旦翻译立即产生报告活性
2、ATP的提取
1)在测量微生物的ATP前，需要将ATP从微生 物内提取出来，ATP的提取效率直接影响生 物量测定结果。因此，ATP的提取也就成为 ATP生物发光法测定生物量的重要步骤之一。 2)提取方法:TCA(三氯醋酸)法和加热煮沸法提 取ATP。
3、 ATP的检测
1)先用标准ATP试剂作一条标准曲线。测量得到样品 的相对发光值. 2)测定样品发光值,与标准曲线对比，得到样品中的 ATP含量, ATP含量可以转化为微生物的浓度. 3)测量荧光所用的仪器: TD-20/20荧光光度计 。
海肾荧光素酶
相 对 光 单 位
三、ATP生物发光法的食品应用研究
1பைடு நூலகம்
食品微生物检测:与传统微生物检测方法相比，ATP生
物发光法具有简便、灵敏、快速等优点，小型化的测试仪器便 于随身携带，非常适合现场卫生监测。在现场使用，可迅速发 现可能存在的污染环节，及时采取措施，从而尽可能避免产品 和资金的浪费。
2 可以用于食品、饮品及空气卫生检测中细菌总数的现场测定。 用于卫生监督,口岸监察及企业自检。
检测原理
各生长期的微生物均有较恒定水平的ATP含 量，微生物死亡后，ATP将很快被分解掉, 因此，提取细菌的ATP，利用生物发光法测 出ATP含量后，即可推算出样品中的含菌 量，整个过程仅为几分钟。 优点: 由于生物发光法无需培养微生物过 程，操作简便、灵敏度高，在短时间内即可 得到检测结果，具有其他微生物检测方法无 可比拟的优势，是目前检测微生物最快的方 法之一。