非无菌产品微生物限度检查中控制菌检查原理

非无菌药品微生物限度检查中控制菌检查及原理一、大肠埃希菌1.菌体特性大肠埃希菌属于肠杆菌科埃希菌属，菌体细胞两端钝圆，为革兰染色阴性无芽孢杆菌，细胞大小为1.1～1.5×2～6.0 µm。

周身鞭毛、运动或不运动。

能形成荚膜和微荚膜。

最适生长温度37℃，可在15～46℃生长。

最适pH为7.4～7.6。

在营养肉汤培养基中，37℃培养24小时后，形成菌膜，管底粘液状沉淀，培养物有粪臭味。

在伊红美兰琼脂（EMB）平板上，典型的菌落呈紫黑色，有金属光泽，菌落扁平，低度凸起，光滑湿润。

也有呈粉红色、无金属光泽、中心紫色的菌落。

在麦康凯琼脂（MaCC）平板上，菌落扁平、圆形、光滑湿润。

呈桃红色、微红色或菌落中心桃红色。

2. 生化实验原理（1）MUG试验97％的大肠埃希菌含有β—葡萄糖醛苷酶，可分解4—甲基伞形酮β－D－葡萄糖苷酸，生成的4—甲基伞形酮在366nm紫外灯下产生蓝白色荧光。

（2）靛基质试验（I实验)有些细菌具有色氨酸酶，在蛋白胨水培养基中生长时，能分解蛋白胨中的色氨酸，生成靛基质（吲哚）。

靛基质无色，不能直接观察，加入靛基质试液（对二甲氨基苯甲醛试液），产成红色的玫瑰靛基质。

色氨酸酶活性的最适pH为7.4～7.8。

pH降低，靛基质产生减少，可能出现假阴性或弱阳性反应，故培养基pH应为7.4～7.6 。

因产生靛基质的细菌都能发酵糖类而产酸，增加培养基的酸度，不宜用含葡萄糖的培养基进行此试验。

（3）甲基红试验（M）肠杆菌科细菌均可发酵葡萄糖产生酸性代谢产物，使培养基pH值下降，最初可使甲基红指示液［变色域pH4.5－5.4（红→黄）］变色而呈现阳性反应。

但继续培养后，产气杆菌能将两分子的丙酮酸脱羧生成一分子的中性乙酰甲基甲醇而使培养基pH值上升至5.4以上，使甲基红指示液变为桔黄色（甲基红试验阴性）。

而大肠埃希菌则继续产生大量的酸，如甲酸、乙酸、乳酸、琥珀酸等，保持高氢离子浓度，故甲基红试验为阳性反应。

2CH3COCOOH→2CO2+CH3CO·CHOHCH3丙酮酸乙酰甲基甲醇（4）乙酰甲基甲醇生成试验(V－P)此项实验主要用于鉴别大肠埃希菌和产气杆菌这两种细菌在分解葡萄糖后的进一步反应。

大肠埃希菌于产生丙酮酸后，丙酮酸进一步分解形成甲酸、乙酸、乳酸等。

产气杆菌可使丙酮酸脱羧变为中性的乙酰甲基甲醇。

乙酰甲基甲醇在碱性环境下被空气中的氧气氧化成二乙酰（丁二酮），丁二酮与蛋白胨中的精氨酸所含的胍基作用，生成红色化合物。

试验中加入的α—萘酚试液起到催化剂的作用，使反应的颜色增强。

（5）枸櫞酸盐利用试验（C）枸椽酸盐培养基中仅含有无机盐和唯一的有机物—枸椽酸。

一般细菌能利用磷酸二氢铵作为氮源，但不一定能分解枸椽酸盐而取得碳源。

因此，根据能否利用枸椽酸盐，能鉴别某些菌种。

产气杆菌可以分解枸椽酸盐而取得碳源，能在含有枸椽酸盐的培养基上生长形成菌落, 并分解枸椽酸盐生成碳酸钠，使原来在pH7.0以下的培养基转为碱性，用溴麝香草酚兰作指示剂，接菌后的枸櫞酸盐培养基经过培养，培养基颜色由最初的绿色变为深兰色。

大肠埃希菌不能分解枸椽酸，所以得不到碳源不能生长，接菌后的枸櫞酸盐培养基经过培养，培养基中的溴麝香草酚兰指示剂也不会变色，培养基保持原来的绿色。

二、大肠菌群大肠菌群为水质粪便污染的指示菌。

是指37℃生长时能发酵乳糖，24小时内产酸产气的革兰阴性无芽孢杆菌。

大肠菌群不是分类学上的名称，符合此定义的细菌包括埃希菌属、克雷伯菌属、肠杆菌属和枸櫞酸菌属等菌属的细菌。

涵盖了正常人畜肠道内全部需氧或兼性厌氧的革兰阴性无芽孢杆菌。

乳糖发酵实验原理：各种细菌含有发酵不同糖的酶，能分解不同的糖而产酸、产气，有的仅产酸，而不产气。

大肠菌群分解胆盐乳糖发酵培养基中的乳糖产酸，使培养基中的溴甲酚紫指示液由紫色变为黄色；产气可使液体培养基中的倒置小管内出现气泡。

三、沙门菌1.沙门菌特性沙门菌为肠杆菌科沙门菌属细菌，是人畜共患的肠道病原菌，常引起伤寒、肠炎、肠热症和食物中毒。

可通过人、畜、禽的粪便或带菌者接触，直接或间接地污染药品原、辅料及生产的各个环节，以动物来源的药物，如脏器、粪便、全虫体等污染机率更高。

因此，药品微生物限度标准规定，以动物来源的药物、生物脏器制品（不包括蜂蜜、王浆、动物角、阿胶）等的口服给药制剂不得检出沙门菌。

沙门菌为革兰阴性无芽孢短杆菌，菌体大小在0.4～0.9µm×1～3µm，两端钝圆,具周身鞭毛，能运动，一般无荚膜，少数有包膜。

沙门菌属营养条件要求不高，在营养琼脂平板上为无色半透明、表面光滑、湿润、隆起的菌落；直径在2～3mm。

生长温度10～42℃,最适温度37℃, pH范围4.5～9, 最适pH为6.8～7.8。

需氧或兼性需氧。

有时有粗糙型菌落，干燥、无光泽、边缘不整齐、中心和边缘不一致。

胆盐硫乳琼脂（DHL）、沙门、志贺菌属琼脂（SS）、麦康凯琼脂（Macc）及曙红亚甲兰琼脂（EMB）培养基中，都含有乳糖。

埃希菌属能发酵乳糖产酸产气，沙门菌则不能。

另外，埃希菌属不能分解含硫氨基酸生成硫化氢，而沙门菌属90%以上的菌H2S为阳性反应。

产生的H2S遇培养基中的铁盐生成FeS沉淀物（黑色沉淀物）。

因此，沙门菌在含有糖指示剂的EMB 和Macc培养基平板上，菌落为无色至浅橙色，透明或半透明，光滑湿润。

在DHL和SS琼脂平板上，因培养基中含有糖和H2S指示系统，菌落中心带黑色或几乎全黑色。

2. 三糖铁琼脂培养基上的特征及其生化反应原理三糖铁琼脂培养基高层斜面：沙门菌在TSI斜面的反应为：(1)斜面呈碱性（红色），底层呈酸性（黄色），H2S阳性（底层黑色）或阴性（无黑色）。

(2)斜面及底层均为黄色，底层黑色。

实验原理：三糖铁琼脂培养基含二套指示系统，可检查糖类发酵情况和硫化氢产生。

培养基中含乳糖、蔗糖和葡萄糖（比例为10:10:1)；硫酸亚铁和还原剂硫代硫酸钠；酸碱指示剂为0.2%酚磺酞指示液[pH6.8～8.4（黄→红）]。

培养基灭菌后的pH值约为7.3。

若待检菌能够发酵乳糖或蔗糖，则产酸量较多，使整个培养基（斜面及底层）均呈黄色：如仅发酵葡萄糖，产酸量少，斜面部分由于细菌生长分解蛋白胨而产生氨，使培养基pH上升，酚磺酞指示剂显示碱性色（红色）。

而底层部分由于氧压较低，仍保持酸性反应呈酸性色（黄色）。

产生H2S的细菌使硫代硫酸钠分解，产生的H2S与Fe2+形成FeS不溶性黑色沉淀。

反应需在较为厌氧的条件下进行，故观察到的黑色反应在培养基底层。

三糖铁琼脂斜面系半固体培养基，细菌发酵糖产生气体，可使琼脂层出现气泡甚至断裂，绝大多数沙门菌的细菌均产生气体。

另外，穿刺接种部分还可观察细菌有无动力。

有动力的细菌生长后，可由穿刺线扩展到整个底层，使培养基变浊，无动力的细菌仅沿穿刺线生长，形成一条清晰的生长线。

沙门菌仅发酵葡萄糖，不发酵乳糖及蔗糖，产生H2S (90％以上）。

大肠埃希菌能发酵葡萄糖、乳糖，部分能发酵蔗糖而产酸、产气，不产生H2S。

它可使TSI斜面和底层整个变为酸性色（黄色），琼脂层出现气泡甚至断裂。

Na2S203 + 2H＋→H2S↑+ Na2S03H2S + Fe2＋→FeS↓+ 2H+细菌还原硫代硫酸钠产生硫化氢，须在酸性环境和厌氧条件下，培养基中糖的成分可提供酸性环境，培养基底层需要一定高度，以保持较为厌氧的环境，故在三糖铁高层培养基斜面的底层可有黑色FeS沉淀物产生。

如出现疑似沙门菌的三糖铁琼脂管应继续分别作革兰染色、镜检，生化反应及血清学凝集试验。

3.靛基质试验用接种环沾取少许培养物接种至蛋白胨水培养基管，照大肠埃希菌靛基质试验操作，判断结果。

沙门菌应为阴性反应。

4. 脲酶试验变形杆菌属的细菌具有尿素酶，能分解培养基中的尿素，产生大量的氨，使培养基呈碱性，酚磺酞指示剂显红色。

沙门菌属和志贺菌属的细菌无此反应。

其他肠道细菌的尿素酶试验多数为阴性反应。

试验以培养基产碱为判断依据，某些细菌能利用培养基中的蛋白陈水解后，也可使培养基pH升高，造成假阳性。

因此，须用无尿素的相同培养基作为对照管。

4.赖氨酸脱羧酶试验细菌分解氨基酸使其脱羧，生成胺和CO2，此反应由细菌产生的脱羧酶来完成。

各种细菌产生不同的氨基酸脱羧酶，均可使培养基变碱，由培养基中的指示剂显示出来。

沙门菌属除伤寒沙门菌和鸡沙门菌外，此反应均呈阳性。

志贺菌属除宋氏和鲍氏志贺菌外均为阴性。

注意事项：(1)沙门菌经培养1-2天，大多数出现阳性结果，亦有3-4天出现的。

(2)经培养后，阴性对照管必须为黄色，否则试验无效。

(3)判断结果时，必须与未接种的培养基进行比较，试验管只要有紫色痕迹出现都可判为阳性结果。

培养时间最长不得超过4天。

否则，可因蛋白胨中的氨基酸分解产碱而出现假阳性。

6. 氰化钾试验氰化钾是细菌呼吸酶系统的抑制剂。

细胞色素、细胞色素氧化酶、过氧化氢酶和过氧化物酶的辅基为铁卟啉，氰化钾能与铁卟啉结合，使这些酶失活，从而抑制细菌生长。

但有的细菌在一定浓度的氰化钾存在下仍能生长。

借此特性可以鉴别不同种属的细菌。

当培养基中氰化钾的含量在1:104或1:1.33 ×104时，肠杆菌科的沙门菌属，志贺菌属和大肠埃希菌属的细菌生长受到抑制，其他细菌仍可生长。

注意事项：(1) 氰化钾为剧毒品，操作时须特别慎重，勿用口吸溶液，用后的培养管加少量硫酸亚铁和0.5ml的20%氢氧化钠去毒，再高压灭菌、洗涤。

(2) 氰化钾培养基试管灭菌后换橡胶塞封口，以防止氰化钾分解成氰氢酸气体，使氰化钾浓度下降，抑制作用减弱，造成假阳性。

(3) 接种1环肉汤培养基培养物即可，过量接种在未培养前就产生混浊，造成假阳性。

7. 血清凝集试验沙门菌的抗原有三种：菌体抗原（O抗原）、表面抗原（K抗原）和鞭毛抗原（H抗原）。

表面抗原是菌体抗原的一种，是荚膜或鞘物质。

存在于细胞壁之外。

荚膜是疏松透明的多糖类胶状物，能耐受100℃或更高的温度。

鞘物质存在于少数沙门菌中，又称Vi抗原，经60℃加热或石碳酸处理即被破坏。

Vi抗原能阻止O抗原与O抗体凝集，加热破坏Vi抗原后，O抗原与相应的O抗体能发生凝集。

鞭毛抗原（H抗原）存在于细菌鞭毛中，不耐热，经60～70℃15分钟或者经乙醇或酸处理后即失去抗原性。

另在培养基中加入0.1％的石碳酸即可暂时抑制鞭毛的形成。

H抗原与H 抗体形成疏松状易摇散的絮状凝集。

菌体抗原也称为O抗原，能耐受100℃2.5小时，并能抵抗乙醇与0.1％石碳酸的破坏，与特异性血清形成颗粒状凝集。

形成慢，不易摇散。

现已知有50多种O抗原成份，分别以阿拉伯数字1, 2, 3……表示。

有的沙门菌有一种O抗原，多数沙门菌为两种以上O抗原；有的O抗原为一种菌独有，有的为几种菌共有。