生物技术制药详解

植物生物技术在药用植物中的研究摘要：生物技术的发展为药用植物的研究和中药现代化的发展提供了重要机遇。

本文综述了近几年来生物技术在我国药用植物研究中的应用进展关键词：组织培养；细胞培养；药用植物引言W hite 和Gautheret 在1939 年建立了植物组织无菌培养技术, 开启了生物工程的大门, 目前已成为21 世纪研究的热点和焦点。

组织培养和细胞培养是药用植物生物工程的主要内容。

1.组织培养植物组织培养就是在无菌和人工控制条件下，将离体的植物器官、组织、细胞，培养在人工配制的培养基上植物组织培养是现代生物技术在药用植物学领域中研究与应用的一个重要组成部分，是指在无菌和人为控制的营养(培养基)及环境条件下对药用，给予适宜的培养条件，诱导其产生愈伤组织、丛芽，最终形成完整的植株。

药用植物器官、组织或细胞进行培养，用来生产药用活性成分或进行药用植物无性快速繁殖的技术。

另一个重要突破是利用组织培养技术进行试管育苗，开辟了药用植物大规模种植的新天地，近10来，约有200药用植物通过试管育苗获得了成功[1]。

1.1外植体: 用于进行组织培养的材料称为外植体。

根据不同的药用植物, 用于诱导培养的外植体不尽相同。

常用的组织和器官有无菌实生菌、根、须根、茎、块茎、鳞茎、球茎、芽、子叶、吉片、叶柄、鳞片、花蕾、花序、花芽、花瓣、花药、花丝、子房、果肉、果实、原生质体、珠芽等植物体的各个部位, 其中最常用的有鳞茎、顶芽、茎尖、腋芽、叶、花茎、花蕾等, 相关研究很多。

涂红艳等对细茎石斛的组织培养研究, 表明细茎石斛种子在M S 不含激素的培养基上有较高的萌发率, 种子萌发后形成的原球茎保持阶段十分短暂, 极易分化, 2 个月后形成小苗。

外植体类型对拟原球茎的诱导有较大的影响, 成熟茎段很难脱分化, 幼嫩组织的诱导率相对较高, 但幼芽段褐化较高, 适宜做外植体是丛生幼芽。

姜维梅等研究抗癌药用植物猫人参以茎段(至少带一个节)、叶片外植体离体培养, 表面以茎段作为外植体效果较好, 容易消毒, 能很快诱导腋芽萌发; 以叶片作为外植体, 成功诱导出愈伤组织, 但此愈伤组织的分化能力极低[2]。

胡益明等研究药用植物粉花绣线菊的组织培养, 表明幼叶、茎尖、叶柄等外植体均能诱导出愈伤组织, 其中以茎尖外植体诱导的效果最好。

贝丽霞等研究了刺五加组织培养, 选用刺五加的叶片、茎尖、当年生根为材料, 表明来源于叶片的愈伤组织的分化能力最强。

雒晓芳对当归的组织培养表明, 各种外植体的诱导效果依次为叶柄、根尖、叶片。

1.2培养基及培养条件: 培养基是外植体生长的营养基础, 常用的培养基有M S、B5、White、Heller、ER、N itsch、N T 等, 最常用的是M S 培养基, 激素(生长素和细胞分裂素) 使用范围一般在0.5- 30g/L[3]。

诱导外植体的生长与分化和促进中间体增殖的培养基一般只具有较小的差别, 诱导壮苗与生根培养基用量减轻。

不同植物所使用的培养基有所差别, 氮源、碳源和激素对培养影响显著。

光照、温度、气体状况、季节、pH 等因素对培养有较大的影响。

李明芳等研究激素对盾叶薯蓣愈伤组织细胞生长和薯蓣皂苷元合成的调控表明, 不同生长素对盾叶薯蓣愈伤组织细胞生长量的影响差异大小为NAA >IAA > 2, 4-D, 而对薯蓣皂苷元合成的影响是2, 4-D> IAA > NAA。

在有生长素存在的条件下, 光照24h, 另加0.5 mg/L KT 可促进愈伤组织细胞的生长,而附加0.5 mg/L BA 可促进薯蓣皂苷元的合成; 相反, 光照12 h, 另加0.5mg/L BA 促进愈伤组织细胞生长, 附加0.5 mg/L KT 促进薯蓣皂苷元合成, 愈伤组织生长越旺, 薯蓣皂苷元积累越少[4]。

盛长忠等进行了pH 对红豆杉愈伤组织生长、苯丙氨酸解氨酸(PAL ) 活性和紫杉醇量的影响研究, 表明不同红豆杉愈伤组织所需最适pH 值不同, 而有利于愈伤组织生长的pH 值均不利于PAL 活性的提高和紫杉醇的积累, pH 值明显影响红豆杉愈伤组织的生长及次级代谢水平, 从而影响了紫杉醇的合成与积累。

陈书安等对藏红花研究表明,M S 是藏红花芽愈伤组织的最佳诱导培养基, 而B5 是叶子和花愈伤组织的最佳培养基, 藏红花芽、叶和花愈伤组织的最佳诱导温度分别是18、25 和21 ℃, 光照是叶子愈伤组织诱导的有利因素, 但不利于芽和花愈伤组织的诱导, 1.5-2.0 mg/L NAA 和0.25 mg/L 6-BA 是愈伤组织诱导的最佳激素组合。

涂红艳等对细茎石斛的组织培养研究, 表明激素TDZ 对拟原球茎的诱导有明显的促进作用, 但TDZ 会导致苗矮化, 茎细, 根短而少;M S+ BA 1 mg/L + NAA 0.1 mg/L+ TDZ 0.1 mg/L 组合的培养基拟原球茎诱导率最高, 拟原球茎的增殖以1/2 M S+ NAA 1 mg/L +3% 蔗糖为佳, 且拟原球茎的生长需要一定的光照,高浓度的BA 和低浓度的NAA 组合, 可加快拟原球茎的分化进程, 拟原球茎分化形成小苗后, 在幼苗壮苗过程中,BA 和NAA 有不同的作用,BA 会促进植株的分蘖, 而NAA 利于植株生长, 但浓度过高会抑制苗生长, 因此壮苗期间用低浓度的NAA 和BA 组合效果更好[5]。

1.3抗逆性: 组培苗的抗逆性研究是药用植物组织培养的一个方面, 目前已经有相关的研究报道, 如陈华等进行了蒲公英的耐盐性研究, 陈玉珍等进行了母雪莲愈伤组织的抗冻性研究。

李冬杰等进行了红豆杉细胞培养过程中抗褐变剂的总结研究。

1.4药效成分: 为了明确组培药用植物的质量, 需将药效成分量与普通植物进行比较研究以确定组培药材质量, 有应用价值和组培植株获得的有效成分通常不低于普通植物。

研究表明, 中华芦荟组培苗与正常苗的水溶性多糖量相当。

王跃华等对川黄柏的离体培养物的药效成分抑菌试验表明, 培养物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌具有良好的抑菌效果。

孙瑞强等利用FT IR 和HPLC 法对栽培藏红花和组培藏红花的药用成分进行比较研究表明, 组培藏红花的代谢产物种类较少, 主要成分种类与栽培的相同,但是具有抗癌活性的藏红花素A 的量高于栽培藏红花2-3 倍。

谢德玉等通过愈伤组织培养获得的青蒿植株青蒿素可达到0.92% (干重) , 较栽培植株(0.52% ) 高。

赵沛基等研究青阳参嫩枝和芽诱导的愈伤组织表明, 在33 d 时次生代谢产物的量最高, 并从中分离到7 个化合物, 首次报道从植物愈伤组织中分离到多羟基十八碳烯酸。

赵琳等研究了肉苁蓉药材与盐生肉苁蓉培养细胞的苯乙醇苷类成分差异表明, 盐生肉苁蓉培养细胞中所含成分种类较多, 且大部分量较高, 其中洋丁香酚苷(类叶升麻苷) 和松果菊苷的量明显高于肉苁蓉药材[6]。

1.5培养脱毒苗: 脱毒苗是指除去病毒的组培苗。

脱毒苗具有无杂菌、适应能力较强、繁育较快、质量优、抗性好、分蘖性强、繁殖系数高、大批量生产、周年供应、便于运输等优点。

植物脱除平凡毒有热处理、茎类培养和抗病毒药剂3 种方法。

茎尖脱毒往往采用0.1-0.3 mm 的茎尖。

热处理(38.5 ℃培养1 周) 可以让2mm 的罗汉果茎尖脱毒率达到100%。

李明军等对怀地黄、怀山药进行了组培脱毒研究表明, 脱毒产量提高30% 以上。

冯英等总结研究表明,生姜脱毒苗田间不受病菌和线虫感染, 其他指标与栽培者相同。

徐品三等研究了百合不定芽培养脱毒种球生产, 表明百合不定芽培养再生植株的病毒脱毒效果因百合品种和病毒种类而有所差异, 卡萨布兰卡百合晨病毒容易脱去, 脱毒率达76%;魅丽黄瓜花叶病毒能全部脱去[7]。

1.6人工种子: 人工种子是指把植物组织培养出来的胚体或芽孢在含有营养物质并具有保护功能的凝胶胶囊中, 使其保持种子的机能直接用于播种, 在适宜的条件下能与自然种子一样发芽出苗。

张铭等应用黏土和蛭石粉作基质包埋铁皮石斛种胚来制作人工种子表明, 当黏土2蛭石粉2M S 培养液为2∶1∶2时萌发率可达56.8%。

在此系统中单独添加1.0% 活性炭或同时添加1.0% 活性炭和0.5% 淀粉制作的铁皮石斛人工种子, 平均萌发率分别达76.7% 和80.3% , 分别比对照提高了18.4% 和24.2% , 还研究了壳聚糖等作为外种皮以及原球茎的失水率对铁皮石斛人工种子萌发及贮藏的影响。

郭顺星等以原球茎为材料, 建立了铁皮石斛人工种子的初步制作流程, 以改良1/2 M S 培养基各种成分附加蔗糖为人工胚乳的人工种子存活率、发芽率、成苗最好, 其发芽率可达80% 以上。

朱长甫等用4% 海藻酸钠包埋直径2- 3 mm 的半夏小块茎制成的人工种子, 在无菌培养基上的萌发率可达70% , 在未灭菌泥炭土中约为30% , 人工种皮内添加适当激素可促进萌发, 而添加的营养物质作用不大, 适当脱水有利于人工种子贮藏。

2.细胞培养细胞培养是生物技术领域里的一个重要分支,通过药用植物的细胞培养, 产生重要的次生代谢产物以及进行生理生化和遗传学研究, 大部分传统药材的有效成分是次生代谢产物, 采用大规模细胞培养是解决濒危药用植物及药效成分低的药用植物满足用药需求的重要途径, 细胞培养具有生长速度快、周期短、产物均一可控、药效成分高于天然植物等优点。

目前已经建立细胞体系的有人参(生产人参皂苷)、西洋参(人参皂苷)、长春花(长春花碱)、红豆杉( 紫杉醇)、三七(三七皂苷)、水母雪莲(藏药, 黄酮类, 抗风湿)、青蒿(青蒿素)、紫草(紫草宁) 等[10 ]。

已经从400 多种植物中建立了组织和细胞培养物, 从中分离出600 多种代谢产物, 其中40 多种化合物在数量上超过或等于原植物, 通过筛选高产细胞系, 改进培养条件和技术, 以及设计适合植物培养细胞的发酵罐, 为工业化生产代谢产物奠定了基础。

2.1培养路径: 细胞培养的路径为待培养愈伤组织的诱导和培养→单细胞分离→优良细胞株的建立→扩大培养→发酵罐发酵。

2.2培养基和培养条件: 通常采用液体培养, 常用的培养基和激素与组织培养相似, 常用的培养基有MS、B5、White、Heller、ER、Nitsch、NT 等。

液态M S 培养基仍然是最常用的培养基, 激素(生长素和细胞分裂素) 使用范围一般在0.5-30 mg/L 。

不同的植物细胞所要求的能源、矿物质和激素有较大的差别,碳源、磷源、氮源的数量和种类对培养效果影响显著, 需经过筛选确定较佳培养基。

胡萍等进行了南方红豆杉悬浮培养过程中碳、氮、磷的补加对细胞生长影响的研究, 表明碳源在悬培养中期消耗殆尽, 后期碳源的缺乏限制了细胞的生长, 补加碳源组与对照组相比, 细胞生长率和细胞密度明显提高, 其中细胞生长率约提高了83% 。