takara宝生物公司限制酶双酶切buffer表
Note:
1) It is confirmed that 10 units of each enzyme completely digest 1 μg of DNA at 37°C in one hour in 50 μl reaction mixture.
2) The concentration of Glycerol should be less than 10% to minimize star activity.
3) DNA may not be digested completely, when recognition sequences of two enzymes are close each other, or when DNA takes high-structure conformation.
反应体系（20ul）：
10* M Buffer 2ul
质粒T-5.3kb Gt13ul XbaⅠ、HindⅢ各0.5ul（7.5U）无菌水14ul 37℃水浴保温2h
生物安全柜使用操作步骤
生物安全柜的使用制度 1、在做保养前，应先切断电源。 2、由于对操作时间的统计直接影响对维护需要的判断，因此在使用此柜时应备有 操作时间的详细记录以备参考和查询。 3、表面的清洁： 非工作区的不锈钢：用浸泡在浓缩肥皂液中的柔软毛巾清洁表面，然后用浸泡在干净的热水或温水中的另一块棉布或毛巾擦净工作区的不锈钢：使用医用 酒精擦净。禁止使用强氧化性的试剂或溶液。 外部涂层：任一种非研磨的家庭用清洁剂，使用柔软的棉布或毛巾擦净。 4、在使用过程中每日清洁： 1）消毒和清洗操作区 2）对控制面板进行消毒 3）用柔软的清洁剂或玻璃专用清洁剂清洗箱体外表面和玻璃 4）对设备的各种功能进行检查 5) 将本次工作记录在案 5、每月清洗： 1）用清洗剂将所有外表面的尘埃消除， 2)对设备的工作台面 内壁表面、观察窗内面应以75﹪酒精擦拭。 3）将本次清洗记录在案 6 每年维护： 1）检查前玻璃门驱动装置的松紧度 2）检查紫外线灯管和荧光灯管 3）每年申请厂家对安全柜的整体性能检测 4）将本次维护记录在案。
生物安全柜使用操作步骤 准备工作： 1、物品准备： ⑴操作人员防护用品：无粉乳胶手套及聚氯乙烯手套各1副，一次性防渗透防护衣1件，一次性口罩、帽子（有条件者备N95口罩）、防护镜等； ⑵治疗盘：常规消毒用物1套，无菌纱布、棉球； ⑶一次性注射器、一次性防渗透防护垫、防渗透专用污物袋； ⑷根据医嘱备化疗药物、输液袋等。 2、人员准备：洗手，佩戴一次性口罩、帽子、更鞋，换工作服，外套一次性防渗透防护衣；配药时带双层手套，即：聚氯乙烯手套外戴1副无粉乳胶手套。 操作流程： 1、配药前洗手，穿防渗透护服，佩戴口罩，帽子，带聚氯乙烯手套，其外套一副乳胶手套。 2、配药前启动紫外线灯进行生物安全柜内操作空气消毒30分钟，并在操作前用75%究竟擦拭柜内面及台面，保持洁净的备药环境，柜内操作台面铺一次性防渗防护垫，减少药液污染。 3、取合适的注射器及注射针并检查 4、再次查对医嘱及治疗卡 5、割据安剖前应轻弹其颈部，使附着的药粉降至瓶底，打开安剖时应垫一纱布，以防划破手套。瓶装药物稀释及抽取药液时，应插入双针头以排除瓶内压力,防止针栓脱出造成污染。并且要求在抽取药液后, 瓶内进行排气和排液后再拔针, 不可使药液排于空气中。加药时将化疗药加入瓶装液体后应抽尽瓶内空气, 避免瓶内压力过大导致更换液体时药液外溢。 6、抽取药液时可选用一次性注射器，并注意抽取药液以不超过注射器容量的3 /4为宜。抽取药液后放以垫有聚乙烯薄膜的无菌盘内备用，每次用后按污物处理。 7、再次查对 8、完成配置后，保持安全柜运行5--10分钟，使飞散的气溶胶完全附着到过滤器上，关闭。再用75%酒精擦拭操作台面。 9、整理用物，操作中使用的注射器、输液器、输液袋、敷料及放置化疗药物的安瓿等物品应放在专用的塑料袋内集中封闭处理, 以免药液蒸发污
生物安全柜标准操作规程
1. 目的: 规范生物安全柜的操作与维护保养工作，确保设备的正常运作，以保障操作人员的安全。 2. 范围: 无菌实验室阳性间菌检员使用的BHC-1300A2生物安全柜。 3．职责：菌检员负责设备的正常操作与维护保养，由质量部经理复核相关文件记录。 4. 内容 4.1 安全柜应放置于十万级以下的初级净化间。操作前应打开紫外灯，照射30min，后将本次操作所需的全部物品移入安全柜，避免双臂频繁穿过气幕破坏气流；并且在移入前用75%酒精擦拭物品表面消毒，以去除污染。 4.2 打开风机10min，待柜内空气净化并气流稳定后再进行实验操作。将双臂缓缓伸入安全柜内，至少静止2min，使柜内气流稳定后再进行操作。 4.3 生物安全柜内不放与本次实验无关的物品。物品应尽量靠后放置，不得挡住气道口，以免干扰气流正常流动。 4.4 操作时应避免交叉污染。为防止可能溅出的液滴，应准备好75%的酒精棉球或用消毒剂浸泡的小块纱布，避免用物品覆盖住安全柜的格栅。 4.5 在实验操作时，不可完全打开玻璃视窗，应保证操作人员的脸部在工作窗口之上。在柜内操作时动作应轻柔、舒缓，防止影响柜内气流。 4.6 安全柜应定期进行检测与保养，以保证其正常工作。工作中一旦发现安全柜工作异常，应立即停止工作，采取相应处理措施，并通知质量部经理。 4.7 检验完成后，关闭玻璃视窗，保持风机继续运转10min，同时打开紫外灯，照射30min。 4.8 安全柜应定期进行清洁消毒，可用75%酒精或0.2%新洁尔灭溶液擦拭工作台面及柜体外表面；每次检验工作完成后应全面消毒。 4.9 柜内使用的物品应在消毒缸消毒后再取出，以防止将标准菌株残留带出而污染环境，造成生物危害。 4.10 使用方法： 4.10.1 安全柜采用LED液晶面板控制，控制面板包括的功能键有：电源开关键、杀菌灯键、风挡键（快速、慢速、无风）、照明键。 4.10.2 插上220V交流电源后，按下控制面板上的所示电源开关开启即可使用；需要灭菌时，按灭菌灯键；风挡键有三级（快速、慢速、无风）循环，默认为无风，按一次为慢速，再按为快速，第三次则回到无风，如此循环；平时操作照明，只需按照明键即可。 5.设备的维护保养 5.1 每次检验操作后用75%的酒精（其他杀菌剂视用户使用的材料而定）彻底对安全柜内部工作区域表面、侧壁、后壁、窗户进行表面净化。切勿使用含有氯的杀菌剂，因为它可能对安全柜的不锈钢结构造成损坏。同时对紫外灯和电源输出口表面进行清洁。当清洁安全柜内部区域时，操作人员除了手放以外，身体的其他任何部位不能进入安全柜。 5.2 长时间未实验时也得每两周进行清洁维护，按5.1进行，定期清洁不锈钢表面会使之保持表面的光滑美观。 5.3 每月用湿布对安全柜外部表面进行擦拭，尤其是安全柜的前面和上部，把堆积的灰尘打扫干净。并检查所有的维护配件的合理使用情况。 5.4 根据实际情况，每个季度或者半年检查安全柜的任何物理异常或故障，如有异常及时报修；将初效过滤器拆下清洗，防止积尘将导致进风量不足，而降低洁净效果。 5.5 每年请具备资格的认证技术人员对安全柜进行性能认证，依据紫外灯使用寿命效果，进行紫外灯的更换；当正常调节或清洗初效空气过滤器后，仍达不到理想的截面风速时，则应调节风机的工作电压（旋动旋钮），从而达到理想的均匀风速（将调节风速旋钮从左向右，从低速向高速缓慢调节，新工作台不应调至最高风速）。 5.6 在使用十八个月后当风机工作电压调整至最高点时，仍不能达到理想风速时，则说明高效空气过滤器积尘过多（滤料上滤孔已基本被堵，要及时更新），一般高效空气过滤器的使用期限为十八个月；更换高效空气过滤器时，应注意型号规格尺寸（原生产厂家配置），按箭头风向装置，并注意过滤器的周边密封，绝对无渗漏现象发生。
双酶切实验
双酶切概述 双酶切反应(Double Digests) 1、同步双酶切 同步双酶切是一种省时省力的常用方法。选择能让两种酶同时作用的最佳缓冲液是非常重要的一步。NEB每一种酶都随酶提供相应的最佳NEBuffer，以保证100%的酶活性。NEBuffer的组成及内切酶在不同缓冲液中的活性见《内切酶在不同缓冲液里的活性表》及每支酶的说明书。能在最大程度上保证两种酶活性的缓冲液即可用于双酶切。由于内切酶在非最佳缓冲液条件下的切割速率会减缓，因此使用时可根据每种酶在非最优缓冲液中的具体活性相应调整酶量和反应时间。 2、分步酶切 如果找不到一种可以同时适合两种酶的缓冲液，就只能采用分步酶切。分步酶切应从反应要求盐浓度低的酶开始，酶切完毕后再调整盐浓度直至满足第二种酶的要求，然后加入第二种酶完成双酶切反应。 3、使用配有特殊缓冲液的酶进行双酶切（图） 使用配有特殊缓冲液的酶进行双酶切也不复杂。在大多数情况下，采用标准缓冲液的酶也能在这些特殊缓冲液中进行酶切。这保证了对缓冲液有特殊要求的酶也能良好工作。由于内切酶在非最佳缓冲液中进行酶切反应时，反应速度会减缓，因此需要增加酶量或延长反应时间。通过《内切酶在不同缓冲液里的活性表》可查看第二种酶在特殊缓冲液相应盐浓度下的作用活性。 双酶切建议缓冲液 注： 只要其中一种酶需要添加BSA，则应在双酶切反应体系中加入BSA。BSA不会影响任何内切酶的活性。 注意将甘油的终浓度控制在10%以下，以避免出现星号活性，详见《星号活性》。可通过增加反应体系的总体积的方法实现这一要求。 某些内切酶的组合不能采用同步双酶切法，只能采用分步法进行双酶切。上表中这些组合以“se q”标注。 [编辑本段] 双酶切的注意事项 1、做转化的时候，进行酶连接反应时，注意保持低温状态，因为LIGASE酶很容易降解.为保险起见，一般连接3小时，16度。 2、对含有AMP-RESISTENCE的质粒铺板时，注意加AMP时的温度，温度过高，会使克隆株无法筛选出来.我的方法是培基高温消毒后放在烤箱里，烤箱一般温度为55-60度，然后做的时候拿出来，这样好掌握温度。铺板前后注意用吹风机吹干。 3、对照的设立：为验证双酶切是否成功，可做如下对照： 酶切反应时加各单酶分别切，两管，用同一种BUFFER，跑胶，看单切的两管是否成线性.如两管均成线性可初步判断双酶切成功.做转化时，也要进行对照。 [编辑本段] 双酶切连接反应之全攻略 1、回收PCR产物：
双酶切连接反应之全攻略
双酶切连接反应之全攻略 1、回收PCR产物：在进行PCR扩增时候，给引物两端设计好酶切位点，一般说来，限制酶的选择非常重要，尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶，如BamHI,HindIII,提前看好各公司的双切酶所用公用的BUFFER，以及各酶在公用BUFFER里的效率。选好酶切位点后，在各个酶的两边加上保护碱基，其原则可参照： 双酶切时间及其体系：需要强调的是很多人建议酶切过夜，其实完全没有必要，我一般酶切3个小时，其实1个小时已经足够。应用大体系，如100微升。 纯化问题：纯化PCR产物割胶还是柱式，我推荐柱式，因为割胶手法不准，很容易割下大块的胶，影响纯化效率。现在的柱式纯化号称可以祛除引物，既然如此，酶切掉的几个碱基肯定也会被纯化掉了。所以，PCR产物和双酶切产物的纯化均可应用柱式纯化。我用的是TAKARA的纯化柱试剂盒 酶量的问题：以TAKARA的为例，其对1单位酶的定义如下：在50 μl 反应液中，30℃温度下反应1小时，将1 μg 的λDNA完全分解的酶量定义为1个活性单位(U)。 而该酶浓度约为15单位/ 微升，在除外酶降解的 因素外，该酶可分解15μg的DNA，而一般从1-4ml菌液提出的 DNA约 为3μg，而PCR纯化后的产物（50体系）约为3μg，所以即便全部加进去，只要纯化的 质量好，酶切完全切得动。 2、酶切、回收后的PCR产物与载体的连接 摩尔比的计算: 很多人凭经验也可以。但对于初学者从头认真计算则 非常有必要。回收的载体片段：回收的PCR产物片段=1：10 ，一般取前者0.03pmol，后者取0.3pmol。 pmol为单位的DNA转换为为μg单位的DNA：（X pmoles×长度bp×650）/ 1,000,000 （注：长度bp×650是该双链DNA的分子量）所得数值即为μg,也可以直接用这个公式套.1pmol 1000bp DNA=0.66μg,如载体是5380bp，则0.03pmol为 0.03×5.38×0.66=0.106524μg。 测DNA浓度: 可以在专用机子上测，注意OD值，一般约1.8-2.0.另外，如果嫌麻烦，也可用MARKER 进行估测，如MARKER2000，5微升的 MARKER每个条带约50ng。 连接反应：TAKARA的 连接酶上的 说明写的过夜，而其对连接酶单位的定义为：在20 μl的连接反应体系中，6 μg的λDNA-Hind III的分解物在16℃下反应30分钟时，有90%以上的DNA片段 被连接所需要的酶量定义为1个活性单位（U）。而它的浓度为350 U/μl ，所以完全够用。连 接酶容易失活，注意低温操作，最好在冰上。时间3个小时足已。 3、转化： a、全量（10 μl）加入至100 μl JM109感受态细胞中，冰中放置30分钟。 b、42℃加热45秒钟后，再在冰中放置1分钟。 c、加入890 μl AMP阴性培养基，37℃振荡培养60分钟。 取100μl铺板。也可离心后余100μl 几个非常重要的问题 1 做转化的时候,进行酶连接反应时,注意保持低温状态,因为LIGASE酶很容易降解.为保险起见,一般 连接3小时,16度.
双酶切
【原创】双酶切连接反应之全攻略（原创） 双酶切连接反应之全攻略 前一阵子一直在做双酶切质粒重组，失败了很多次，不过很快改善了实验方法，用2周重组了 14个质粒。现就自己的体会，结合战友的宝贵经验，谈一下质粒重组的一些个人经验。 1、回收PCR产物：在进行PCR扩增时候，给引物两端设计好酶切位点，一般说来，限制酶的选择非常重要，尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶，如BamHI,HindIII,提前看好各公司的双切酶所用公用的BUFFER，以及各酶在公用BUFFER里的效率。选好酶切位点后，在各个酶的两边加上保护碱基，其原则可参照：https://www.360docs.net/doc/3d10427674.html,/upload/2006/08/13/31219184.pdf。 双酶切时间及其体系：需要强调的是很多人建议酶切过夜，其实完全没有必要，我一般酶切3个小时，其实1个小时已经足够。应用大体系，如100微升。 纯化问题：纯化PCR产物割胶还是柱式，我推荐柱式，因为割胶手法不准，很容易割下大块的胶，影响纯化效率。现在的柱式纯化号称可以祛除引物，既然如此，酶切掉的几个碱基肯定也会被纯化掉了。所以，PCR产物和双酶切产物的纯化均可应用柱式纯化。我用的是TAKARA的纯化柱试剂盒 酶量的问题：以TAKARA的为例，其对1单位酶的定义如下：在50 μl 反应液中，30℃温度下反应1小时，将1 μg 的λDNA完全分解的酶量定义为1个活性单位(U)。而该酶浓度约为15单位/微升，在除外酶降解的因素外，该酶可分解15μg的DNA，而一般从1-4ml菌液提出的 DNA约为3μg，而PCR纯化后的产物（50体系）约为3μg，所以即便全部加进去，只要纯化的质量好，酶切完全切得动。 2、酶切、回收后的PCR产物与载体的连接 摩尔比的计算，很多人凭经验也可以。但对于初学者从头认真计算则非常有必要。回收的载体片段：回收的PCR产物片段=1：10 ，一般取前者0.03pmol，后者取0.3pmol。 pmol为单位的DNA转换为为μg单位的DNA：（X pmoles×长度bp×650）/ 1,000,000 （注：长度bp×650是该双链DNA的分子量）所得数值即为μg,也可以直接用这个公式套.1pmol 1000bp DNA=0.66μg,如载体是5380bp，则0.03pmol为 0.03×5.38×0.66=0.106524μg。 测DNA浓度可以在专用机子上测，注意OD值，一般约1.8-2.0.另外，如果嫌麻烦，也可用MARKER进行估测，如MARKER2000，5微升的 MARKER每个条带约50ng。 连接反应：TAKARA的连接酶上的说明写的过夜，而其对连接酶单位的定义为：在20 μl的连接反应体系中，6 μg的λDNA-Hind III的分解物在16℃下反应30分钟时，有90%以上的DNA片段被连接所需要的酶量定义为1个活性单位（U）。而它的浓度为350 U/μl ，所以完全够用。连接酶容易失活，注意低温操作，最好在冰上。时间3个小时足已。
双酶切编辑
双酶切编辑 做转化的时候，进行酶连接反应时，注意保持低温状态，因为LIGASE酶很容易降解。为保险起见，一般连接3小时，16度；对含有AMP-RESISTENCE的质粒铺板时，注意加AMP 时的温度，温度过高，会使克隆株无法筛选出来。我的方法是培基高温消毒后放在烤箱里，烤箱一般温度为55-60度，然后做的时候拿出来，这样好掌握温度。铺板前后注意用吹风机吹干；对照的设立：为验证双酶切是否成功。 目录1简介 2连接反应 3注意事项 1简介编辑双酶切反应(Double Digests) 1、同步双酶切 同步双酶切是一种省时省力的常用方法。选择能让两种酶同时作用的最佳缓冲液是非常重要的一步。NEB每一种酶都随酶提供相应的最佳NEBuffer，以保证100%的酶活性。NEBuffer 的组成及内切酶在不同缓冲液中的活性见《内切酶在不同缓冲液里的活性表》及每支酶的说明书。能在最大程度上保证两种酶活性的缓冲液即可用于双酶切。由于内切酶在非最佳缓冲液条件下的切割速率会减缓，因此使用时可根据每种酶在非最优缓冲液中的具体活性相应调整酶量和反应时间。 2、分步酶切 如果找不到一种可以同时适合两种酶的缓冲液，就只能采用分步酶切。分步酶切应从反应要求盐浓度低的酶开始，酶切完毕后再调整盐浓度直至满足第二种酶的要求，然后加入第二种酶完成双酶切反应。 3、使用配有特殊缓冲液的酶进行双酶切（图） 使用配有特殊缓冲液的酶进行双酶切也不复杂。在大多数情况下，采用标准缓冲液的酶也能在这些特殊缓冲液中进行酶切。这保证了对缓冲液有特殊要求的酶也能良好工作。由于内切酶在非最佳缓冲液中进行酶切反应时，反应速度会减缓，因此需要增加酶量或延长反应时间。通过《内切酶在不同缓冲液里的活性表》可查看第二种酶在特殊缓冲液相应盐浓度下的作用活性。 双酶切建议缓冲液 注： 只要其中一种酶需要添加BSA，则应在双酶切反应体系中加入BSA。BSA不会影响任何内切酶的活性。 注意将甘油的终浓度控制在10%以下，以避免出现星号活性，详见《星号活性》。可通过增加反应体系的总体积的方法实现这一要求。 某些内切酶的组合不能采用同步双酶切法，只能采用分步法进行双酶切。上表中这些组合以“seq”标注。 2连接反应编辑1、回收PCR产物： 在进行PCR扩增时候，给引物两端设计好酶切位点，一般说来，限制酶的选择非常重要，尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶，如BamHI，HindIII，提前看好各公司的双切酶所用公用的BUFFER，以及各酶在公用BUFFER里的效率。选好酶切位点后，在各个酶的两边加上保护碱基。 双酶切时间及其体系：需要强调的是很多人建议酶切过夜，其实完全没有必要，我一般酶切3个小时，其实1个小时已经足够。应用大体系，如100微升。 纯化问题：纯化PCR产物割胶还是柱式，我推荐柱式，因为割胶手法不准，很容易割下大块的胶，影响纯化效率。现在的柱式纯化号称可以祛除引物，既然如此，酶切掉的几个碱基
生物安全柜使用与维护作业指导书
1 目的 建立确保正确使用生物安全柜，特规范生物安全柜的使用方法。 2 范围 适用于生物安全柜的操作。 3 责任人 生物安全柜操作人员。 4 内容 4.1工作原理 安全柜在运行中，通过一台外置外排风机所排出的空气所形成箱内负压，从室内吸入部分空气进入操作区前格栅，从而在安全柜操作口形成一个流速大于0.5m/s的气幕（理论或实测值），同时在安全柜内置送风风机的驱动下，从安全柜顶部进风口吸进的实验室内（或室外）的空气，通过送风过滤器过滤后形成垂直下降的洁净气流。从上向下的垂直气流在接近工作台面时，在外排风机的作用下分成前后二路进入底部负压风道，与从工作台开口面进入的气流混合后，经排风过滤器过滤后，通过管道排到室外。这样就形成了B2型安全柜运行时的完整气流模式，保证了安全柜的运行。 4.2操作步骤 4.2.1准备 4.2.1.1按实验室等级要求穿戴好防护服、头盔、口罩、眼罩、手套等个人防护品； 4.2.1.2工作之前，生物安全柜的工作台面、内壁表面、观察窗内面应以70%浓度的乙醇擦拭，再用无菌水再擦拭一遍清除残余的氯，减小实验时的交叉感染； 4.2.1.3将电源插头插入固定插座后，将前窗操作口开启到200mm高度，首先应启动外排风机，在风机运转稳定后再启动安全柜风机，应使安全柜的风机至少运行3～5min以净化安全柜内空气，工作之前，应按实验所需物品清单先将实验材料置于安全柜内，并将工作椅高度调整到确保自己的脸部在工作窗开口之上，并使自己的手
臂操作时保持适宜位置； 4.2.1.4开始工作前应关闭工作台下方的排水阀，这样，当有溢溅发生时，污染物就不会逸出安全柜外。 4.2.2操作 4.2.2.1操作开始时，应使手缓慢进入工作室，同时要注意手臂进入操作口后，应让流入气流流过手臂约一分钟后开始操作，这样能保持气流的稳定； 4.2.2.1操作应在操作台面上距进风格栅100mm距离内进行； 4.2.2.1为减少操作中的溢洒和气溶胶的产生，应严格执行生物安全操作规程 4.2.2.2操作中应避免使用明火，保持操作室正常气流流态； 4.2.2.3操作结束后，所有物品从安全柜内取出前，必须进行表面除污消毒，取出工作室内物品后，应对工作室内壁四周用消毒剂进行消毒灭菌。 4.2.3结束 4.2.3.1在确认所有内壁已消毒完毕且已干燥后，建议让安全柜继续运行3～5min，以便净化柜内气体； 4.2.3.2关闭灯、风机，关闭前窗； 4.2.3.3按规定处理污染物品和搬移实验材料 4.3日常维护保养 4.3.1实验室应编制日常使用保养计划，每次的操作后保养，均应有记录； 4.3.2每次操作前和操作后，都应对操作区作清洁消毒，以确保安全柜的正常使用； 4.3.3操作中若发生喷溅，应及时用吸水纸巾清除，放入生物危险灭菌袋内，大量的喷溅可按实验室已编制的危害处理程序处理(如用消毒液浸泡、冲洗等)。清理应在安全柜运行状态中进行； 4.3.4紫外线灯应每周进行表面清洁，以保证紫外线幅照的强度； 4.3.5安全柜在安装和使用一定周期后，应按法定程序对安全柜的整体运行性能进行确认，这种工作应有资质的专业机构或专业人员进行。 4.4故障处理 4.4.1故障判断与处理
海尔生物安全柜操作规程
海尔生物安全柜操作规程 1. 目的 为了规范海尔生物安全柜使用与维护，保证仪器正常运行，确保设备、环境、人员和血液的安全，建立本操作规程。 2. 范围 2.1适用于海尔生物安全柜使用及维护。 3. 职责 3.1检验科工作人员严格遵守本操作规程对核酸标本试管开盖、平衡温度以及对仪器进行使用维护，并填写《重点设备运行、保养记录》。 3.2 实验室负责人负责仪器的综合管理。 4. 环境要求 温度：18℃-25℃，湿度：30%-80% 5. 操作方法 5.1接通电源。 5.2抬高前窗玻璃，使玻璃门体下沿对正门高标志线（红点处）。 5.3安全柜自洁净运转，直至“please wait”消失。 5.4清洁安全柜工作台和内壁。 5.5实验操作。 5.6取出全部实验物品。 5.7安全柜自运行3分钟。 5.8清洁安全柜工作台和内壁。 5.9关闭前窗玻璃，将门体拉至最底部。 5.10切断电源。 6紫外灯设定步骤 6.1连续按“↑”或“↓”键，直至出现紫外灯设置页面。 6.2按动“设置”键，指示灯亮。 6.3在“U.V AUTO MODE:NO”中”NO“闪动时按动“↑”或“↓”键，进行转换，
显示“YES“表示启动紫外灯自动运行模式。 6.4“TIME1“闪动可按动“↑”或“↓”键为紫外灯自动运行设定时间，最多可设置3个时间。 6.5按动“设置“键，指示灯灭，设置完成。 7维护和保养 7.1生物安全柜的维护和保养 7.1.1全面保养的周期 每年或每1000个工作时，以及每次重新启动都应当进行维护。 7.1.2清洁 在通常情况下，清洁只需用少量中性清洁剂，将它溶于水后直接擦拭，就可将设备表面的污物擦掉。 7.1.3在使用过程中每次清洁 （1）使用结束后，自运行5-10分钟。 （2）使用医用酒精消毒和清洗工作室。 （3）使用医用酒精对操作面板进行消毒和清洗。 （4）清洁剂清洁外表面及玻璃门。 7.1.4每周75%酒精擦拭紫外线灯管。 7.1.5每月清洗 （1）用清洁剂将所有外表面的尘埃清除。 （2）对设备内部进行消毒处理。 （3）对设备进行风速等功能检验，并在通常使用时检查设备安全。 7.1.6每年维护 （1）检查前玻璃门驱动装置的松紧度。 （2）检查紫外灯管。 8 支持性文件 8.1 《设备管理程序》 9 质量记录 9.1 《重点设备运行、保养记录》
生物安全柜使用与维护作业指导书
建立确保正确使用生物安全柜，特规范生物安全柜的使用方法。 2 范围 适用于生物安全柜的操作。 3 责任人 生物安全柜操作人员。 4 内容 4.1工作原理 安全柜在运行中，通过一台外置外排风机所排出的空气所形成箱内负压，从室内吸入部分空气进入操作区前格栅，从而在安全柜操作口形成一个流速大于0.5m/s的气幕（理论或实测值），同时在安全柜内置送风风机的驱动下，从安全柜顶部进风口吸进的实验室内（或室外）的空气，通过送风过滤器过滤后形成垂直下降的洁净气流。从上向下的垂直气流在接近工作台面时，在外排风机的作用下分成前后二路进入底部负压风道，与从工作台开口面进入的气流混合后，经排风过滤器过滤后，通过管道排到室外。这样就形成了B2型安全柜运行时的完整气流模式，保证了安全柜的运行。 4.2操作步骤 4.2.1准备 4.2.1.1按实验室等级要求穿戴好防护服、头盔、口罩、眼罩、手套等个人防护品； 4.2.1.2工作之前，生物安全柜的工作台面、内壁表面、观察窗内面应以70%浓度的乙醇擦拭，再用无菌水再擦拭一遍清除残余的氯，减小实验时的交叉感染； 4.2.1.3将电源插头插入固定插座后，将前窗操作口开启到200mm高度，首先应启动外排风机，在风机运转稳定后再启动安全柜风机，应使安全柜的风机至少运行3～5min 以净化安全柜内空气，工作之前，应按实验所需物品清单先将实验材料置于安全柜 臂操作时保持适宜位置； 4.2.1.4开始工作前应关闭工作台下方的排水阀，这样，当有溢溅发生时，污染物就不会逸出安全柜外。 4.2.2操作 4.2.2.1操作开始时，应使手缓慢进入工作室，同时要注意手臂进入操作口后，应让流入气流流过手臂约一分钟后开始操作，这样能保持气流的稳定； 4.2.2.1操作应在操作台面上距进风格栅100mm距离内进行； 4.2.2.1为减少操作中的溢洒和气溶胶的产生，应严格执行生物安全操作规程 4.2.2.2操作中应避免使用明火，保持操作室正常气流流态； 4.2.2.3操作结束后，所有物品从安全柜内取出前，必须进行表面除污消毒，取出
酶切连接经验之谈
酶切 本实验室条件下酶切连接经验之谈 1、PCR产物可以切胶回收后酶切，用Elution buffer溶解即可，不影响后续实验。 2、50ulPCR产物切胶回收后用35ul Elution buffer溶解后只需取一半体积用于后续实验即可 满足要求。 3、PCR产物可以用乙醇沉淀法获得DNA用于后续反应，但需取少于一半的量用于后续实验， 否则会不能完全切开而导致实验失败。 4、双酶切时，若2种酶不是同一厂家时，可以根据Thermo厂家该2种酶的共同buffer， 选用Tango缓冲液，一般50ul体系各加1ul酶，而快切酶只需0.5ul,切3小时即可。 5、添加酶切试剂时，应先将buffer和样品振荡均匀后再加入相应的酶，轻弹混匀即可。 6、观察酶切后的载体片段会比质粒大很多，PCR产物双酶切后的片段也比未酶切时要大， 并且酶切后产物有时会呈现稍微弥散的宽带，由此可以判断是否切开。 7、部分限制性内切酶对甲基化的DNA不能切割，如FbaI和MboI等，一般生物公司提供的内切酶说明中均有说明。 大多数酶切位点的甲基化不影响切割，而有些会影响，如XbaI, BclI等。而且甲基化只发生在特定序列，以XbaI为例，只有在位点序列旁出现GA或TC，该XbaI位才会被甲基化。 而要解除这种限制修饰作用通常有两种方法： （1）选用上述酶的同功酶，如Sau3AI，DNA识别切割位点与MboI相同；但不受甲基化影响； （2）利用甲基化酶缺失的受体细胞进行DNA的制备，如E.coli JM110和链霉菌等，前者Dam和Dcm甲基化酶已敲出，而后者细胞内本就没有甲基化酶，从这些细胞中抽提的DNA就能被上述酶切割。 8：E.coli JM110 要排除dam,dcm甲基化的影响，需要用特定的dam-,dcm-的菌株，如JM110 如果由JM110或SCS110等甲基化缺失的菌株产生的质粒，则不会被甲基化. 若酶切不成功可以考虑以下因素的影响 a)有些内切酶对PCR产物酶切效率较低 b)双酶切无共同buffer时，可以采用分步酶切 c)PCR产物直接双酶切不成功，可以选择先做TA克隆后再双酶切 d)当载体的2个酶切位点很接近，或者其中一个酶切效率很差时，可以对载体进行去磷酸 化，该酶为牛小肠碱性磷酸酶，在大多数限制酶缓冲液中均有活性 e)导致“星星活性”可能是体系中甘油浓度过高、高PH、较低的离子强度所致。 连接 1、一定要选择未经过反复冻融的连接buffer，并准确加入，确保其终浓度准确。 2、目的片段和载体比例不是影响连接成功与否的关键原因，依据经验，取相等质量的的目 的片段和载体即可，载体可以尽量少加一点。3ug 载体（5kb）相当于2pmol 线性DNA 或者4pmol双酶切产物。 3、多个片段连接时，体系中，终浓度的各个片段与载体相同即可。
双酶切连接反应的注意要点
双酶切连接反应的注意要点 双酶切： 1、在双酶切载体时如果2个酶切位点靠得很近，必须注意酶切顺序。因为有的限制性内切酶要求其识别序列的两端至少保留有若干个碱基才能保证酶的有效切割。有的酶要求识别序列两端有多个碱基的，则必须先切，否则就可能造成酶切失败。 2、回收PCR产物：回收的PCR产物片段=1：10，一般取前者0.03pmol，后者取0.3pmol。pmol为单位的DNA转换为为?g单位的DNA：（X pmoles×长度bp×650）/ 1,000,000 （注：长度bp×650是该双链DNA的分子量）所得数值即为?g,也可以直接用这个公式套.1pmol 1000bp DNA=0.66μg,如载体是5380bp，则0.03pmol为0.03×5.38×0.66=0.106524?g。 3、双酶切时间及其体系：需要强调的是很多人建议酶切过夜，其实完全没有必要，一般酶切3个小时，对于PCR产物，可以过夜酶切，效果会很好。酶切体系不宜过大，会影响质粒和酶的碰撞机会，效果降低；质粒量不应该超过酶切要求的最大量，否则酶切不完全，酶的用量控制在1U酶在15-20ul体系中酶解1ugDNA。 4、两种酶切的条件不同时，分别进行两次酶切，切完一个纯化后再切：温度要求不同，先酶切低温要求的，再酶切高温要求的；若盐浓度要求不同，先酶切低盐浓度要求的，再酶切高盐浓度要求的。 5、若质粒是在TE中保存的，TE 中的EDTA可能与酶的激活因子螯合，影响酶切效果，可放大酶切体积或重新浓缩质粒。 6、限制酶的选择非常重要，尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶，提前看好各公司的双切酶所用公用的BUFFER，以及各酶在公用BUFFER里的效率。选好酶切位点后，在各个酶的两边加上保护碱基。 7、纯化问题：纯化PCR产物割胶还是柱式，推荐柱式，因为割胶手法不准，很容易割下大块的胶，影响纯化效率。现在的柱式纯化号称可以祛除引物，既然如此，酶切掉的几个碱基肯定也会被纯化掉了。所以，PCR产物和双酶切产物的纯化均可应用柱式纯化。 8、酶量的问题：以TAKARA的为例，其对1单位酶的定义如下：在50 μl 反应液中，30℃温度下反应1小时，将1 μg 的λDNA完全分解的酶量定义为1个活性单位(U)。而该酶浓度约为15单位/微升，在除外酶降解的因素外，该酶可分解15μg的DNA，而一般从1-4ml 菌液提出的DNA约为3μg，而PCR纯化后的产物（50体系）约为3μg，所以即便全部加进去，只要纯化的质量好，酶切完全切得动。 9、酶切、回收后的PCR产物与载体的连接：摩尔比的计算，很多人凭经验也可以。但对于初学者从头认真计算则非常有必要。回收的载体片段：回收的PCR产物片段=1：10，一般取前者0.03pmol，后者取0.3pmol。pmol为单位的DNA转换为为?g单位的DNA：（X pmoles×长度bp×650）/ 1,000,000 （注：长度bp×650是该双链DNA的分子量）所得数值即为?g,也可以直接用这个公式套.1pmol 1000bp DNA=0.66μg,如载体是5380bp，则0.03pmol 为0.03×5.38×0.66=0.106524?g。测DNA浓度可以在专用机子上测，注意OD值，一般约1.8-2.0.另外，如果嫌麻烦，也可用MARKER进行估测，如MARKER2000，5微升的MARKER 每个条带约50ng。 10、连接反应：TAKARA的连接酶上的说明写的过夜，而其对连接酶单位的定义为：在20 μl的连接反应体系中，6 μg的λDNA-Hind III的分解物在16℃下反应30分钟时，有90%以上的DNA片段被连接所需要的酶量定义为1个活性单位（U）。而它的浓度为350 U/μl ，所以完全够用。连接酶容易失活，注意低温操作，最好在冰上。时间3个小时足已。
双酶切反应
双酶切buffer的选择： 1、U ：Supplied with its own unique reaction buffer that is different from the four standard NEBuffers. Its compatibility with the four standard NEBuffers is indicated by the chart. 2、BSA ：Supplied with a separate vial of bovine serum albumin (10 mg/ml). To obtain 100% activity BSA should be added to the 1X reaction mix to a final concentration of 100 μg/ml. 3、SAM ：Supplied with a separate vial of S-adenosyl-methionine (SAM). To obtain 100% activity, SAM should be added to the 1X reaction mix as specified on the product data card. 4、dd ：When performing a double digest with this enzyme, this NEBuffer is recommended because it minimizes star activity. Purified by scientists at SibEnzyme and supplied with a SibEnzyme buffer (B, K, O, W or Y) which ensures 100% activity. Its compatibility with the NEBuffer System is indicated on the chart. 5、NR :This buffer is not recommended for use with with this enzyme。 6、Buffer Compositions ：(1X): NEBuffer 1 (yellow): 10 mM Bis Tris Propane-HCl, 10 mM MgCl2, 1 mM DTT (pH 7.0 at 25℃). NEBuffer 2 (blue): 10 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, 50 mM NaCl, 1 mM DTT (pH 7.9 at 25℃). NEBuffer 3 (red): 50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 1 mM DTT (pH 7.9 at 25℃). NEBuffer 4 (green): 20 mM Tris-acetate, 10 mM magnesium acetate, 50 mM potassium acetate, 1 mM DTT (pH 7.9 at 25℃). 双酶切连接反应的经验谈： 双酶切： 1、在双酶切载体时如果2个酶切位点靠得很近，必须注意酶切顺序。因为有的限制性内切酶要求其识别序列的两端至少保留有若干个碱基才能保证酶的有效切割。有的酶要求识别序列两端有多个碱基的，则必须先切，否则就可能造成酶切失败。 2、回收PCR产物：回收的PCR产物片段=1：10，一般取前者0.03pmol，后者取0.3pmol。pmol为单位的DNA转换为为?g单位的DNA：（X pmoles×长度bp×650）/ 1,000,000 （注：长度bp×650是该双链DNA的分子量）所得数值即为?g,也可以直接用这个公式套.1pmol 1000bp DNA=0.66μg,如载体是5380bp，则0.03pmol为0.03×5.38×0.66=0.106524μg。 3、双酶切时间及其体系：需要强调的是很多人建议酶切过夜，其实完全没有必要，一般酶切3个小时，对于PCR产物，可以过夜酶切，效果会很好。酶切体系不宜过大，会影响质粒和酶的碰撞机会，效果降低；质粒量不应该超过酶切要求的最大量，否则酶切不完全，酶的用量控制在1U酶在15-20ul体系中酶解1ugDNA。
生物安全柜的使用说明(详细)
生物安全柜介绍 1. 概述 生物安全柜是生物实验室的一级隔离屏障设备。所谓生物安全柜，实质就是一种负压过滤排风柜（见有关标准：YY0569、JG170、ANSI/NSF49、EN12469对生物安全柜作出的定义），其本身可分为部分隔离和完全隔离。 生物危害的隔离措施通常由一次隔离和二次隔离措施实现。采用生物安全柜的目的是为了把生物实验室污染区域及污染风险降到最低，以实现一次隔离目的。为防止生物危害从实验室漏到外部环境，把实验室和外界隔断，即为二次隔离，二次隔离的目的是防止实验室外的人被生物感染。 由于生物危险的事例几乎都发生在实验室内，一次隔离措施越严格、充分，则可降低实验室污染的风险，从源头上抑制生物危害的发生。 由于目前生物实验室以及医院临床医学检验和研究应用最广的是Ⅱ级生物安全柜，本文将着重对Ⅱ级生物安全柜进行阐述。 2. 依据 GB 19489—2007《实验室生物安全通用要求》； 《实验室生物安全手册》（WHO）； ISO 15190—2003《医学实验室—安全要求》； YY0569-2005 生物安全柜； JG170-2005 生物安全柜； JGxxx-xxxx 洁净工作台（报批稿）。 3. 生物安全柜的特殊防护设计 3.1 生物安全柜的级别类型和适用范围 生物安全柜分成Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ共三个等级，其中：Ⅱ级生物安全柜又细分为A1、A2、B1、B2四个类型，A1、A2、B1分别为循环气流结构，B2为气流100%直接排放结构。实验领域对于A1类生物安全柜应用极少，其流入气流流速相对较低，对人员防护隔离能力相对较低，不能满足生物危害的高风险场合应用。通常， A1类生物安全柜仅用于医学教学或对已知的低风险病原体操作。B1类生物安全柜的排风气流流量是系统总风量的70%，尚有30%循环气流，这样的特性决定了它仍然不能用于化学毒性场合。常用的是Ⅱ级生物安全柜中的A2、B2类生物安全柜。 生物安全柜应用气流围场、空气负压、物理过滤、风险预警及联锁控制等综合隔离技术，实现生物危害防护，实现保护人员或保护人员、保护实验对象、保护环境目的。 ●Ⅰ级生物安全柜 Ⅰ级生物安全柜从前部操作口吸入空气，经排风口高效空气过滤器滤除病原体颗粒后排出空气。它依赖吸入空气实现生物隔离，其应用目的是保护人员免遭病原体感染。 注：Ⅰ级生物安全柜不对样本保护。 适用范围：仅适用于对第1、2、3、4类病原体的操作时的人员保护场合。 ●Ⅱ级生物安全柜
NEB酶切buffer
Home > Tec hnic al Refer enc e > Restriction Endonucleases > NEBuffer A ctivity Chart NEBuffer Activity Chart for Restriction Enzymes For your c onvenienc e, N ew England Biolabs offers a simple 4 buffer system. A c olor-c oded 10X NEBuffer is supplied with every r e endonuclease, ensuring 100% activity. Over 170 r estriction enzymes exhibit 100% activity in NEBuffer 4, r esulting in increase d eff and ease of use especially when per for ming double digests. To help select the best c onditions for double digests, this c hart shows the optimal (supplied) NEBuffer and appr oximate activity in NEBuffer s and NEBuffer Ec oRI for eac h enzyme. If BSA is supplied with an enzyme, it is inc luded in all NEBuffer activity r eac tions table shows r ecommended reaction temperatur e, heat inactivation temper atur e, r ec ommended diluent buffer and whether the enzym qualified (i.e., cleaves substr ate in 5 m inutes under r ec ommended c onditions). N ote: The values listed in this table ar e appr oxima obtained using each enzyme's specific unit assay substr ate DNA. Please chec k out other technic al r efer enc e infor mation r elated to r estriction enzymes: Double Digestion | Heat Inactivation | Activity at 37°C | Diluent Buffer s | Time-Saver Enzymes | High Fidelity (HF) Restriction Enz Click for the Chart Legend, Ic on Description A | B | C | D | E | F | H | I | K | L | M | N | P | R | S | T | X | Z | NEBuffer 4 NEBuffer 3 NEBuffer 4 NEBuffer 3 NEBuffer 4 NEBuffer 4 NEBuffer 4 NEBuffer 4 NEBuffer 3 NEBuffer 1 NEBuffer 4 - NEBuffer 4