双酶切体系
双酶切连接反应之全攻略(
双酶切连接反应之全攻略(双酶切连接（Double Digestion）是一种常用的分子生物学技术，用于在DNA分子上选择性地切割两个特定的限制性内切酶位点。
它可以用于构建重组DNA，进行基因克隆，等等。
下面是一个全面的双酶切连接反应的攻略，包括实验前的准备工作，实验步骤和注意事项。
实验前的准备工作：1.获得限制性内切酶：选择两个互不相容的限制性内切酶。
确保这两个酶能够在相同的反应缓冲液中活性工作。
2.准备DNA底物：获得需要连接的DNA片段。
可以通过PCR扩增，限制性消化或DNA合成等方法获得。
3.选择连接载体：选择合适的连接载体，如质粒。
确保载体具有想要插入的目标基因的适当特性，如选择性标记物（如抗生素抗性基因）和启动子等。
4.验证限制酶位点：使用限制性内切酶图谱检测DNA片段和连接载体中的限制酶位点。
这有助于确定两个限制酶是否能够溶解目标DNA片段。
实验步骤：1.提取DNA：从细菌培养基中提取所需的DNA片段。
可以使用商用试剂盒或自制提取方法。
2.酶切反应：在适当的反应条件下，将需要连接的DNA片段和连接载体分别与两个限制性内切酶一起孵育。
反应条件包括酶的浓度，缓冲液的类型和pH值，反应温度和孵育时间。
3.酶停止反应：通过加入酶停止缓冲液或加热短暂孵育，停止酶切反应。
这样可以避免过度消化和限制酶反应继续进行。
4.凝胶电泳：将切割后的DNA片段经过琼脂糖凝胶电泳分析。
这一步骤可以检测酶切效率和特异性。
将反应样品和相应的对照样品（未经酶切）加载到琼脂糖凝胶上，然后运行电泳以分离DNA片段。
5.库仑凝胶纯化：根据所选的DNA片段大小，可以选择不同浓度的琼脂糖凝胶切片进行纯化。
将所需大小的DNA片段切割下来并进行库仑凝胶分离。
6.连接反应：将纯化的DNA片段与连接载体进行连接反应。
可以使用商业化的连接试剂盒，其中包含待连接DNA和连接载体之间的连接酶，以及其他必要的试剂。
7.转化：将连接后的DNA样品转化到合适的宿主细胞中。
酶切
双酶切反应(Double Digests)1、同步双酶切同步双酶切是一种省时省力的常用方法。
选择能让两种酶同时作用的最佳缓冲液是非常重要的一步。
NEB每一种酶都随酶提供相应的最佳NEBuffer，以保证100%的酶活性。
NEBuffer的组成及内切酶在不同缓冲液中的活性见《内切酶在不同缓冲液里的活性表》及每支酶的说明书。
能在最大程度上保证两种酶活性的缓冲液即可用于双酶切。
由于内切酶在非最佳缓冲液条件下的切割速率会减缓，因此使用时可根据每种酶在非最优缓冲液中的具体活性相应调整酶量和反应时间。
2、分步酶切如果找不到一种可以同时适合两种酶的缓冲液，就只能采用分步酶切。
分步酶切应从反应要求盐浓度低的酶开始，酶切完毕后再调整盐浓度直至满足第二种酶的要求，然后加入第二种酶完成双酶切反应。
3、使用配有特殊缓冲液的酶进行双酶切（图）使用配有特殊缓冲液的酶进行双酶切也不复杂。
在大多数情况下，采用标准缓冲液的酶也能在这些特殊缓冲液中进行酶切。
这保证了对缓冲液有特殊要求的酶也能良好工作。
由于内切酶在非最佳缓冲液中进行酶切反应时，反应速度会减缓，因此需要增加酶量或延长反应时间。
通过《内切酶在不同缓冲液里的活性表》可查看第二种酶在特殊缓冲液相应盐浓度下的作用活性。
双酶切建议缓冲液注：只要其中一种酶需要添加BSA，则应在双酶切反应体系中加入BSA。
BSA不会影响任何内切酶的活性。
注意将甘油的终浓度控制在10%以下，以避免出现星号活性，详见《星号活性》。
可通过增加反应体系的总体积的方法实现这一要求。
某些内切酶的组合不能采用同步双酶切法，只能采用分步法进行双酶切。
上表中这些组合以“seq”标注。
注意事项1、做转化的时候，进行酶连接反应时，注意保持低温状态，因为LIGASE酶很容易降解.为保险起见，一般连接3小时，16度。
2、对含有AMP-RESISTENCE的质粒铺板时，注意加AMP时的温度，温度过高，会使克隆株无法筛选出来.我的方法是培基高温消毒后放在烤箱里，烤箱一般温度为55-60度，然后做的时候拿出来，这样好掌握温度。
双酶切体系
Double Digestion（双酶切反应）时Universal Buffer（通用缓冲液）的使用表
■说明
使用二种酶同时进行DNA切断反应（Double Digestion）时，为了节省反应时间，通常希望在同一反应体系内进行。
TaKaRa采用Universal Buffer表示系统, 并对每种酶表示了在各Universal Buffer中的相对活性。
尽管如此，在进行Double Digestion 时，有时还会难以找到合适的Universal Buffer。
本表以在pUC系列载体的多克隆位点处的各限制酶为核心，显示了在Double Digestion可使用的最佳Universal Buffer条件。
在本表中，各Universal Buffer 之前表示的［数字刃是指各Universal Buffer的反应体系中的最终浓度。
TaKaRa销售产品中添附的Universal Buffer全为10倍浓度的缓冲液。
终浓度为0.5 x
时反应体系中的缓冲液则稀释至20倍，1X时稀释至10倍，2X时稀释至5倍进行使用。
■注意
◊1 （i g DNA中添加10 U的限制酶，在50 口的反应体系中，37 C下反应1小时可以完全降解DNA。
◊为防止Star活性的产生，请将反应体系中的甘油含量，尽量控制在10%以下。
◊根据DNA的种类，各DNA的立体结构的差别，或当限制酶识别位点邻接时，有时会发生
Double Digestion不能顺利进行的可。
酶切技术1
1、同步双酶切同步双酶切是一种省时省力的常用方法。
选择能让两种酶同时作用的最佳缓冲液是非常重要的一步。
NEB每一种酶都随酶提供相应的最佳NEBuffer，以保证100%的酶活性。
NEBuffer 的组成及内切酶在不同缓冲液中的活性见《内切酶在不同缓冲液里的活性表》及每支酶的说明书。
能在最大程度上保证两种酶活性的缓冲液即可用于双酶切。
由于内切酶在非最佳缓冲液条件下的切割速率会减缓，因此使用时可根据每种酶在非最优缓冲液中的具体活性相应调整酶量和反应时间。
2、分步酶切如果找不到一种可以同时适合两种酶的缓冲液，就只能采用分步酶切。
分步酶切应从反应要求盐浓度低的酶开始，酶切完毕后再调整盐浓度直至满足第二种酶的要求，然后加入第二种酶完成双酶切反应。
3、使用配有特殊缓冲液的酶进行双酶切使用配有特殊缓冲液的酶进行双酶切也不复杂。
在大多数情况下，采用标准缓冲液的酶也能在这些特殊缓冲液中进行酶切。
这保证了对缓冲液有特殊要求的酶也能良好工作。
由于内切酶在非最佳缓冲液中进行酶切反应时，反应速度会减缓，因此需要增加酶量或延长反应时间。
通过《内切酶在不同缓冲液里的活性表》可查看第二种酶在特殊缓冲液相应盐浓度下的作用活性。
酶切技术 - 限制性内切酶PCR产物的NcoI限制性内切酶酶切鉴定限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上,并切割双链DNA。
它可分为三类:Ⅰ类和Ⅲ类酶在同一蛋白质分子中兼有切割和修饰(甲基化)作用且依赖于ATP的存在。
Ⅰ类酶结合于识别位点并随机的切割识别位点不远处的DNA，而Ⅲ类酶在识别位点上切割DNA分子,然后从底物上解离。
Ⅱ类由两种酶组成:一种为限制性内切核酸酶(限制酶),它切割某一特异的核苷酸序列;另一种为独立的甲基化酶,它修饰同一识别序列。
Ⅱ类中的限制性内切酶在分子克隆中得到了广泛应用，它们是重组DNA 的基础。
绝大多数Ⅱ类限制酶识别长度为4至6个核苷酸的回文对称特异核苷酸序列(如EcoRⅠ识别六个核苷酸序列:5'-G↓AATTC-3'),有少数酶识别更长的序列或简并序列。
双酶切连接反应之全攻略
双酶切连接反应之全攻略一、实验原理：1.首先，将待连接的两个DNA片段通过限制性内切酶酶切，产生两个具有互补末端的DNA片段。
2.再利用DNA连接酶，以这些互补末端为引导，将两个DNA片段连接在一起。
3.最后，通过热激励反应，将连接酶不活性化。
二、实验步骤：1.设计引物：根据待连接的两个DNA片段的序列，设计合适的引物，使得限制性内切酶切割后的末端具有互补性。
2.DNA酶切：将待连接的两个DNA片段与限制性内切酶一同反应，根据内切酶的适宜反应条件进行酶切反应。
3.酶切产物纯化：将酶切产物进行电泳分离，通过切胶取带的方式将目标片段分离出来，然后进行片段纯化。
4.连接反应：将纯化后的两个DNA片段与DNA连接酶一同反应，根据连接酶的适宜条件进行连接反应。
一般而言，反应体系中还需要包含ATP供能和缓冲液等。
5.连接产物纯化：对连接反应的产物进行纯化，一般选择柱层析法（如凝胶过滤法、离心柱法等）或酸酶消化法（如酚氯仿法）等方法。
6.验证连接效果：通过DNA测序等方法验证连接效果，确保连接成功。
三、实验注意事项：1.引物设计要合理：引物的设计要充分考虑到限制性内切酶的切割位点和连接效率。
合理选择引物长度和碱基组成，避免引物之间产生非特异性连接。
2.内切酶酶切条件的选择：根据所使用的内切酶的反应条件和切割位点，合理选择反应温度和反应时间，确保内切酶可以有效切割DNA片段。
3.DNA连接酶的选择和反应条件：根据实验需要，选择合适的DNA连接酶，考虑到连接效率和连接酶的活性等因素。
同时需要注意反应缓冲液的pH和温度等条件。
4.连接产物纯化：选择合适的纯化方法，确保连接产物的纯度和浓度。
同时注意纯化过程中的温度和pH等条件，避免产物降解或损失。
5.连接效果的验证：通过DNA测序方法验证连接效果，并且需要对连接的序列进行分析，确保连接正确。
四、实验应用：1.基因克隆：用于将外源基因克隆到载体上，以便于大规模扩增和表达。
各种酶切体系
－
2
6
2.4
10×buffer D
2
1
1
1
3
4
BSA(10µg/µl)
0.2
0.1
0.1
0.2
0.6
0.6
DNA(1µg/µl)
8.3
4
7.9
6
18
30
Not I(10U/µl)
0.5
0.3
0.5
0.4
1.2
1.5
Sal I(10U/µl)
0.5
0.3
0.5
0.4
1.2
1.5
反应条件
37℃，1~3hr，电泳检测
NheI单酶切
依DNA量定体系
20µl
10µl
灭菌去离子水
-
-
10×buffer
2
1
DNA(1µg/µl)
17
8.5
Nhe I
1
0.5
反应条件
37℃，1~3hr，电泳检测
Xbal I和Sal I双酶切体系鉴定
依DNA量定体系
20µl
10µl
10µl
灭菌去离子水
8.5
4.3
－
10×buffer
2
1
1
BSA(10µg/µl)
0.2
0.1
0.1
DNA(1µg/µl)
8.3
4
7.9
Xba I(10U/µl)
0.5
0.3
0.5
Sal I(10U/µl)
0.5
0.3
0.5
反应条件
EcoR I酶切鉴定
组分
体系
质粒DNA
双酶切法较单酶切法的优势浅析
双酶切法较单酶切法的优势浅析双酶切法与单酶切法都是常见的分子生物学实验中使用的酶切方法。
双酶切法是指在目标DNA分子中同时加入两个限制性内切酶来切割，而单酶切法是只使用一个限制性内切酶进行切割。
双酶切法相对于单酶切法具有以下优势：1.增加识别位点：在目标DNA分子中同时加入两个限制性内切酶，则需要两个酶的识别位点同时存在，这样能够增大酶切的效率。
相比之下，单酶切法只需要一个限制性内切酶的识别位点存在，相对较少。
2.提高酶切产物可见性：双酶切法中使用两个限制性内切酶切割，产生的酶切产物会相对较短，因此在分离和检测上会更加方便。
与之相比，单酶切法产生的酶切产物可能会较长，分离和检测上会相对困难。
3.增加连接适配体的效率：在一些实验中，需要将酶切产物连接到适配体上，然后进行下游操作，如克隆、测序等。
双酶切法中产生的酶切产物相对较短，连接适配体的效率相对较高。
而单酶切法产生的酶切产物相对较长，连接适配体的效率相对较低。
4.改变酶切产物的尺寸：通过选择不同的限制性内切酶和加入相应的测序引物，双酶切法可以在目标DNA分子中产生不同的酶切产物，从而用于分析不同的结构和序列信息。
而单酶切法只能产生一个固定的酶切产物。
5.提高酶切位点判读准确性：在一些情况下，限制性内切酶的识别位点可能会发生突变或者修饰，导致对于酶切位点的判断不准确。
通过使用两个限制性内切酶，双酶切法可以减少由于目标DNA分子中的位点突变或修饰引起的酶切位点判断不准确的影响。
相比之下，单酶切法在这种情况下容易受到影响。
总的来说，双酶切法相对于单酶切法具有更高的酶切效率、方便的分离和检测、更高的连接适配体效率、更大的实验灵活性和更准确的酶切位点判断。
然而，在具体实验中，双酶切法也存在一些局限性，如限制性内切酶之间有相互作用、酶切产物长度过短等问题。
因此，在使用双酶切法时，需要根据具体实验目的和需求来选择合适的酶切方法。
[基因工程][资料]酶切技术
![[基因工程][资料]酶切技术](https://img.taocdn.com/s3/m/ec6bd4fd18e8b8f67c1cfad6195f312b3069eb55.png)
[基因⼯程][资料]酶切技术DNA是真核⽣物的遗传物质，⼜脱氧核苷酸组成。
它是双链互补螺旋结构，定向酶切技术就是⽤限制性内切酶去切割DNA ⽚断，由于酶具有专⼀性，⼀种酶只能识别⼀种特定的脱氧核苷酸序列，所以可以⽤特定的这种酶去切割相应的DNA⽚断，进⽽达到定向切割的⽬的。
⼀、酶切技术-双酶切1、同步双酶切同步双酶切是⼀种省时省⼒的常⽤⽅法。
选择能让两种酶同时作⽤的最佳缓冲液是⾮常重要的⼀步。
NEB每⼀种酶都随酶提供相应的最佳NEBuffer，以保证100%的酶活性。
NEBuffer的组成及内切酶在不同缓冲液中的活性见《内切酶在不同缓冲液⾥的活性表》及每⽀酶的说明书。
能在最⼤程度上保证两种酶活性的缓冲液即可⽤于双酶切。
由于内切酶在⾮最佳缓冲液条件下的切割速率会减缓，因此使⽤时可根据每种酶在⾮最优缓冲液中的具体活性相应调整酶量和反应时间。
2、分步酶切如果找不到⼀种可以同时适合两种酶的缓冲液，就只能采⽤分步酶切。
分步酶切应从反应要求盐浓度低的酶开始，酶切完毕后再调整盐浓度直⾄满⾜第⼆种酶的要求，然后加⼊第⼆种酶完成双酶切反应。
3、使⽤配有特殊缓冲液的酶进⾏双酶切使⽤配有特殊缓冲液的酶进⾏双酶切也不复杂。
在⼤多数情况下，采⽤标准缓冲液的酶也能在这些特殊缓冲液中进⾏酶切。
这保证了对缓冲液有特殊要求的酶也能良好⼯作。
由于内切酶在⾮最佳缓冲液中进⾏酶切反应时，反应速度会减缓，因此需要增加酶量或延长反应时间。
通过《内切酶在不同缓冲液⾥的活性表》可查看第⼆种酶在特殊缓冲液相应盐浓度下的作⽤活性。
⼆、酶切技术-限制性内切酶限制性内切酶能特异地结合于⼀段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上,并切割双链DNA。
它可分为三类:Ⅰ类和Ⅲ类酶在同⼀蛋⽩质分⼦中兼有切割和修饰(甲基化)作⽤且依赖于ATP的存在。
Ⅰ类酶结合于识别位点并随机的切割识别位点不远处的DNA，⽽Ⅲ类酶在识别位点上切割DNA分⼦,然后从底物上解离。
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Double Digestion(双酶切反应)时Universal Buffer(通用缓冲液)的使用表
■ 说明
使用二种酶同时进行DNA切断反应(Double Digestion) 时，为了节省反应时间，通常希望在同一反应体系内进行。
TaKaRa采用Universal Buffer表示系统，
并对每种酶表示了在各Universal Buffer中的相对活性。
尽管如此，在进行Double Digestion时，有时还会难以找到合适的Universal Buffer。
本表以在pUC系列载体的多克隆位点处的各限制酶为核心，显示了在Double Digestion可使用的最佳Universal Buffer条件。
在本表中，各Universal Buffer 之前表示的[数字×] 是指各Universal Buffer的反应体系中的最终浓度。
TaKaRa销售产品中添附的Universal Buffer全为10倍浓度的缓冲液。
终浓度为×
时反应体系中的缓冲液则稀释至20倍，1×时稀释至10倍，2×时稀释至5倍进行使用。
?
■ 注意
◇1 μg DNA中添加10 U的限制酶，在50 μl的反应体系中，37℃下反应1小时可以完全降解DNA。
◇为防止Star活性的产生，请将反应体系中的甘油含量，尽量控制在10%以下。
◇根据DNA的种类，各DNA的立体结构的差别，或当限制酶识别位点邻接时，有时会发生Double Digestion不能顺利进行的可
能。