实验九碘淀粉比色法测定血清淀粉酶课件
08@碘淀粉比色法
1、比色法测乳酸脱氢酶 正向反应生成的丙酮酸与溶于酸的2，4二 硝基苯肼作用生成丙酮酸－二硝基苯腙， 后者在酸性环境中呈草黄色，在碱性溶液 中显棕红色，颜色的深浅与丙酮酸的浓度 成正比，与标准浓度的丙酮酸生成的苯腙 进行比色，可推算LDH的活力。 单位定义：以100ml血清，37度，作用底物 15min，产生1umol丙酮酸为一个金氏单位。
3、血清碱性磷酸酶的磷酸苯二钠法测定
碱性磷酸酶在碱性环境中作用于磷酸苯二 钠，使之水解释放出酚和磷酸。酚在碱性 溶液中与4-氨基安替比林作用，经铁氰化钾 氧化形成红色醌类化合物，根据红色的深 浅确定ALP活性。 单位定义：100ml血清在37度与底物作用15 分钟，产生1mg酚为1个金氏单位。
再充分混匀后，波长630nm ，以蒸馏水调零。
试剂空白管溶液作拟标准液定标，测定 标准和测定管溶液的吸光度值，按公式计 算测定结果。 【计算公式】 血清淀粉酶＝空白管吸光度－测定管吸 光度/空白管吸光度 ×1000
血清淀粉酶= ×1000 尿液淀粉酶= ×2000
【正常参考范围】 血清：80～180u/L，尿液：100～1200u/L
3，唾液含有高浓度淀粉酶，须防止带入。
4，淀粉产品不同，其空白吸光度可有明显差异，一般空白 吸光度应在0.4以上。 5，缓冲淀粉溶液若出现混浊或絮状物，表示缓冲淀粉溶液 受污染或变质，不能再用，应重新配制。 6，本法亦适用于其他体液淀粉的测定，尿液先作20倍稀释 后测定。
【评价】
本法线性范围＜400U，批内3.1-9.0%，批间 12.4-15.1%，与对-硝基苯麦牙庚糖苷法比较，在 酶活性低时相关性较好，但酶活性较高时相关性 差，因此，该法不能认为是淀粉酶测定的理想方 法，但由于该法简单，易行，不需特殊设备，试 剂价廉，仍然为我国目前应用较为广泛的方法。
淀粉酶活力的测定方法
淀粉酶活力的测定方法淀粉酶是一类能够催化淀粉水解的酶，在生物体内和工业生产中都具有重要的作用。
准确测定淀粉酶的活力对于研究酶的性质、生物体的代谢过程以及相关工业应用都具有重要意义。
下面将介绍几种常见的淀粉酶活力测定方法。
一、碘淀粉比色法碘淀粉比色法是一种较为经典且常用的测定方法。
其原理是淀粉经淀粉酶水解后，剩余的淀粉与碘液反应生成蓝色复合物，颜色的深浅与剩余淀粉的量成正比。
通过比色法测定反应后溶液的吸光度，即可计算出淀粉酶的活力。
具体操作步骤如下：首先，准备一系列含有不同浓度淀粉溶液的试管，并向其中加入适量的淀粉酶溶液，在一定的温度和 pH 条件下反应一段时间。
然后，迅速向各试管中加入碘液，使反应终止。
最后，使用分光光度计在特定波长下测定各试管溶液的吸光度。
根据事先绘制的标准曲线，将吸光度值转换为剩余淀粉的浓度，从而计算出淀粉酶水解淀粉的量，进而得出淀粉酶的活力。
这种方法的优点是操作相对简单、成本较低，但缺点是灵敏度相对较低，对于低活力的淀粉酶测定可能不够准确。
二、DNS 法（3,5-二硝基水杨酸法）DNS 法是另一种常用的测定淀粉酶活力的方法。
其原理是淀粉在淀粉酶的作用下水解为还原糖，还原糖能与 3,5-二硝基水杨酸在碱性条件下共热，被还原成棕红色的氨基化合物。
在一定范围内，还原糖的生成量与淀粉酶的活力成正比，通过比色测定棕红色物质的吸光度，即可计算出淀粉酶的活力。
操作过程如下：将淀粉溶液与淀粉酶溶液在适宜条件下反应一定时间后，取出适量反应液，加入DNS 试剂，在沸水浴中加热一段时间，使反应充分进行。
冷却后，使用分光光度计测定溶液在特定波长下的吸光度。
与碘淀粉比色法相比，DNS 法的灵敏度较高，能够更准确地测定低活力的淀粉酶，但操作过程相对复杂一些。
三、斐林试剂法斐林试剂法也是基于淀粉水解产生还原糖的原理。
斐林试剂由硫酸铜和酒石酸钾钠的氢氧化钠溶液组成，还原糖能将斐林试剂中的二价铜离子还原为一价铜离子，生成砖红色的氧化亚铜沉淀。
淀粉酶含量测定
淀粉酶(AMS)测定试剂盒说明书(碘-淀粉比色法)一、 原理：淀粉酶能水解淀粉生成葡萄糖、麦芽糖及糊精，在底物浓度已知并且过量的情况下，家人碘液与未水解的淀粉结合生成蓝色复合物，根据蓝色的深浅可推算出水解的淀粉量，从而计算出AMS 的活力。
二、 试剂组成与配制：（100T ）1、0.4mg/ml 底物缓冲液：60ml ×1瓶，4℃冰箱保存6个月。
2、0.1mol/L 碘贮备液：7ml ×1瓶，4℃避光保存6个月。
0.01mol/L 碘应用液的配制：将碘贮备液：蒸馏水=1:9稀释，现用现配4℃避光保存。
三、 操作表： 测定管（u 管） 空白管（0管）底物缓冲液（ml ）37℃预温5分钟0.5 0.5 待测样本（ml ） 0.1混匀，37℃水浴，准确反应7.5分钟 碘应用液（ml ） 0.5 0.5蒸馏水（ml ）3.0 3.1 混匀，660nm 波长，1cm 光径，蒸馏水调零，测各管吸光度。
*注：不同样本批量测试前需要做预实验，确定最佳取样浓度，将 （空白OD-测定OD 控制在0.05～0.150之间） 四、 计算：1、 单位定义：100ml 血清（浆）中的AMS ，在37℃与底物作用30分钟，水解10mg 淀粉为1个单位。
2、公式：样本测试前稀释倍数空白管吸光度测定管吸光度空白管吸光度样本测试前稀释倍数分钟分钟空白管吸光度测定管吸光度空白管吸光度⨯⨯-=⨯⨯⨯⨯⨯-=801.01005.730105.04.0dl AMSu（此公式适用于测定血清中淀粉酶）血清淀粉酶的含量测定一、实验准备：1、实验器材：移液枪（100~1000ul、10~100ul、1000~5000ul、2~20ul）、5mlEP管、0.5mlEP管、比色皿、100ml烧杯、漩涡仪、水浴箱，分光光度计、计时器。
2、实验药品：NaCl、蒸馏水、0.4mg/ml底物缓冲液、0.1mol/L碘贮备液。
二、实验步骤：1、0.01mol/L碘应用液的配制：将碘贮备液：蒸馏水=1:9稀释，现用现配4℃避光保存。
生物化学实验淀粉酶活力测定 PPT
七、考虑题
• 1、为什么要将试管中的淀粉酶原液置70℃水浴中 保温15min？
• 2、为什么要将各试管中的淀粉酶原液和1%淀粉 溶液分别置于40℃水浴中保温？
三、仪器和试剂
• 主要仪器: • (1)离心机 • (2)分光光度计 • 试剂 • (1)标准麦芽糖溶液(2mg/mL) • (2)1%3,5-二硝基水杨酸试剂 • (3)1%淀粉
四、操作步骤
1、标准曲线的制作(每2组4人做1标准曲线)
编号
1#(空白)
2#
3#
4#
5#
6#
2mg/mL麦芽糖标准液(mL)
表1－1不同谷物淀粉的比旋光度
品种
品种
小麦
182、7ຫໍສະໝຸດ 马铃薯黑麦184、0
小米
大麦
181、5
荞麦
水稻
185、9
燕麦
195、4 171、4 179、5 181、3
玉米
184、6
[α]D20
实验二 氨基酸的纸上层析
一、实验目的
通过对氨基酸的分离,学习纸层析法的基本原理及操作方法。
二、实验原理
纸层析是以滤纸作为惰性支持物的分配层析,滤纸纤维上的－ OH具有亲水性,因此能吸附一层水作为固定相,而通常把有机 溶剂作为流动相。有机溶剂自上而下流动,称为下行层析;自 下而上流动,称为上行层析。流动相流经支持物时与固定相之 间连续抽提,使物质在两相之间不断分配而得到分离。
1、主要仪器: (1)旋光仪 (2)电子天平(感量0、0001g) 2、试剂:
⑴1％盐酸溶液 ⑵30％硫酸锌溶液。 ⑶15％亚铁氰化钾溶液。
四、实验步骤
1、样品的处理 在电子天平上称取小麦粉2、5000g置于三角瓶中→加
碘量法测定淀粉含量实验报告
碘量法测定淀粉含量实验报告实验六：碘-淀粉比色法测淀粉含量一、实验原理对于淀粉含量较少的植株样品，也可采用碘–淀粉比色法。
淀粉在加热情况下能溶于硝酸钙溶液中，当碘化钾和硝酸钙共存时，碘能以碘–淀粉蓝色化合物沉淀全部淀粉。
将此沉淀溶于碱液，并在酸性条件下与碘作用形成蓝色溶液进行比色。
二、试剂1．0％硝酸钙溶液。
2．0.5％碘液：称5.00g结晶碘和10.00g 碘化钾，放入研钵混合干研，然后加10mL蒸馏水研至全部碘溶解，将溶液全部转入1000mL容量瓶定容后，贮于磨口试剂瓶。
3．5％含碘硝酸钙溶液：取10mL 0％的硝酸钙溶液，加入160mL水再加入3mL 0.5％的碘液混匀，现用现配。
4．标准淀粉溶液：称取纯淀粉50mg于研钵中，加3mL 0％硝酸钙溶液，研细并转移到100mL的三角瓶中，用15mL 0％的硝酸钙溶液冲洗研钵，无损地收集于三角瓶中。
将三角瓶置于沸水浴中煮沸5min，冷却后全部转入50mL容量瓶中并定容。
此液为1mg/mL的淀粉标准液。
5．0.1mol/L NaOH。
6．0.1mol/L HCl。
三、材料与方法绘制标准曲线取标准淀粉溶液：取7支管，编号，按下表顺序加入各试剂，混匀静置15min后离心，其他操作同样品测定步骤，显色后在590nm波长下测定光密度。
以光密度为横坐标，淀粉含量为纵坐标绘制标准曲线。
管号 1 2 3 4 5 6 7 标准淀粉溶液（ml） 0 0.5 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 0%硝酸钙溶液（ml） 5.0 4..0 2.0 1.0 0 0.5%碘液（ml） 2 每管淀粉含量（mg） 0 0.5 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 称取1～3g叶片，剪碎放入研钵，加5mL 0％的硝酸钙溶液，研磨成糊状移入100mL的三角瓶中，用10mL 0％的硝酸钙冲洗研钵，无损地收集于三角瓶中，瓶口盖上小漏斗，在沸水浴上煮沸3～5min（叶片含淀粉少的3min，含淀粉多的5min），使样品中淀粉转变为胶体溶液。
实验九碘-淀粉比色法测定血清淀粉酶 - 副本(共12张PPT)
注意事项
酶活性在400U以下时，与底物的水解量成 线性。如测定管吸光度(guāngdù)小于空白管吸 光度(guāngdù)一半时，应加大血清稀释倍数或 减少稀释血清加入量，测定结果再乘以稀释 倍数。
草酸盐、拘橼酸盐、EDTA-Na2及氟化钠对 AMY活性有抑制作用，肝素无抑制作用。
唾液含高浓度淀粉酶应防止带-淀粉比色法测定(cèdìng)血清淀粉酶
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原理(yuánlǐ)
血清(xuèqīng)（或血浆）中α-淀粉酶催化淀粉 分子中α-1，4糖苷键水解，产生葡萄糖、 麦芽糖及含有α-1，6糖苷键支链的糊精。 在底物过量的条件下，反应后加入碘液与未 被水解的淀粉结合成蓝色复合物，其蓝色的 深浅与未经酶促反应的空白管比较，从而推 算出淀粉酶的活力单位。
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内容(nèiróng)总结
碘-淀粉比色法测定血清淀粉酶。0.01mol/L碘应用液的配制: 将碘贮备液:蒸馏水=1︰9 稀释，现用现配4℃避光保存。*注：不同样本批量测试前需要做预实验，确定最佳取样浓 度，将 (空白OD-测定OD)控制在0.05~0.150之间。1、单位定义： 100ml血清（浆）中的 AMS，在37℃与底物作用15分钟，水解5mg淀粉为1个单位。如超过500U有意义，达 350U时应怀疑(huáiyí)有此病。评价
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试剂
(shìjì)
操作步骤
计算
参考值
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试剂
1、0.4mg/ml底物缓冲液：4℃冰箱保存6 个月。
2、0.1mol/L碘贮备液：4℃避光保存6个 月。
0.01mol/L碘应用液的配制(pèizhì): 将碘贮备 液:蒸馏水=1︰9稀释，现用现配4℃避光保 存。
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淀粉酶(AMS)检测试剂盒(碘-淀粉比色法)
淀粉酶(AMS)检测试剂盒(碘-淀粉比色法)简介：淀粉酶(Amylase ，AMS)又称1，4-α-D-葡聚糖水解酶，是水解淀粉和糖原的酶类总称。
淀粉酶测定方法主要分为天然淀粉底物方法和确定底物方法，前者的方法有碘-淀粉法，后者有以麦戊糖底物的方法，以4-NP-G 为底物的方法。
Leagene 淀粉酶(AMS)检测试剂盒(碘-淀粉比色法)其检测原理是血清或血浆等样本中α-淀粉酶催化淀粉分子中的α-1,4糖苷键水解，产生葡萄糖、麦芽糖以及糊精等，碘液与未被水解的淀粉结合，生成蓝色复合物，其蓝色深浅与未经酶促反应的空白管比较，可计算出淀粉酶的活力单位。
该试剂盒通过分光光度计检测吸光度值，可用于检测细胞或组织的裂解液或匀浆液、血浆、血清、尿液等样品中内源性的淀粉酶活性。
如果采用酶标仪检测，则检测的样本数较多，100T 的比色法检测试剂盒可以检测。
该试剂盒仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。
组成：自备材料：1、 比色杯或96孔板2、 生理盐水3、 蒸馏水4、 分光光度计或酶标仪操作步骤(仅供参考)：1、 KI 工作液：取出KI Solution 恢复至室温，KI Solution ：蒸馏水混匀，即为KI 工作液。
4℃避光可保存一个月。
2、 准备样品：① 细胞或组织样品：取恰当细胞或组织裂解液，如果有必要需进行适当匀浆，低速离心取上清，冻存，用于AMS 的检测。
② 血浆、血清和尿液样品：血浆、血清按照常规方法制备，用生理盐水稀释后，可以直接用于本试剂盒的测定，尿液通常也可以直接用于测定，-80℃冻存，但为了消编号 名称TE0203 100T TE0203 200T Storage试剂(A): AMS Assay buffer 50ml 100ml 4℃ 试剂(B): KI Solution 5ml10ml 4℃ 避光使用说明书1份除样品本身颜色的干扰，需设置加了血浆或血清但不加底物的对照。
③高活性样品：如果样品中含有较高活性的AMS，可以使用生理盐水或PBS等进行稀释，也可以采用ALP Assay buffer稀释。
碘-淀粉比色法测定血清淀粉酶 医学课件
空白管
缓冲淀粉溶液 1.0 （37℃预温5min）
测定管1（重复两次） 测定管2
1.0
血清或稀释唾液 -
0.02
立即混匀，置37℃水浴保温7.5min（准确）
碘应用液
1.0
1.0
去离子水
6.0
6.0
充分混匀，以波长660nm，去离子水调吸光度零点，读取各管吸光度值。 测定管2：在试管里留取一份唾液（口水），首先稀释100-500倍。
7
试剂与器材
1、0.4g/L缓冲淀粉溶液 成分及作用：可溶性淀粉 （底物）；磷酸氢二钠和磷酸二氢钾（缓冲液），氯 化钠（淀粉酶的激活剂）；甲醛（防腐剂）。 2、0.1mol/L碘储存液 碘酸钾和碘化钾（提供显色反 应的碘）；浓盐酸（稳定剂） 3、0.01mol/L碘应用液
8
操作步骤
加入物(ml)
这类底物的结构和分子量确定，溶解度好可以配制 较高浓度，使酶反应初速度达到最大速度，满足零级反应 的要求。这类方法均适合自动化分析，分析速度快，精密 度高，酶的活性可以国际单位表达，目前几乎已完全取代 了天然淀粉为底物的方法。
IFCC推荐方法是对硝基麦芽庚糖苷法（4NP-G7法）
了解
对-硝基苯麦芽庚糖苷法 对-硝基苯麦芽庚糖苷(4-nitrophenyl-α-maltoheptaoside，4NP-G7)为底物，经α-淀粉酶催化，水 解为游离的寡糖(G5，G4，G3)及葡萄糖残基减少的 对-硝基苯寡糖苷(4NP-G2，4NP-G3，4NP-G4)。 4NP-G2、4NP-G3及部分4NP-G4，在α-葡萄糖苷酶
流行性腮腺炎AMY也会大量升高。
12
注意事项
1、AMY活性在400U以下时，与底物的水解成良好的线性。如 果结果超过400U，或测定管吸光度小于空白管吸光度一半 时，应加大标本稀释倍数或减少稀释血清加入量，结果乘
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计算
1、单位定义： 100ml血清（浆）中的 AMS，在37℃与底物作用15分钟，水解 5mg淀粉为1个单位。
2、公式：
样本最佳取样浓度摸索
根据不同动物血清及组织之间的差异，最好 是在批量实验之前做个预试以确定最佳取样 浓度。 例1：取大鼠血清用生64倍、 128倍、256倍），取样0.1ml进行检测
试剂 操作步骤 计算 参考值
试剂
1、0.4mg/ml底物缓冲液：4℃冰箱保存6 个月。
2、0.1mol/L碘贮备液：4℃避光保存6个 月。
0.01mol/L碘应用液的配制: 将碘贮备液: 蒸馏水=1︰9稀释，现用现配4℃避光保存。
操作步骤
混匀，660nm波长，1cm光径，蒸馏水调零，测各管吸光度。 *注：不同样本批量测试前需要做预实验，确定最佳取样浓度， 将 (空白OD-测定OD)控制在0.05~0.150之间
实验九碘淀粉比色法测 定血清淀粉酶副本
原理
血清（或血浆）中α-淀粉酶催化淀粉分子 中α-1，4糖苷键水解，产生葡萄糖、麦芽 糖及含有α-1，6糖苷键支链的糊精。在底 物过量的条件下，反应后加入碘液与未被 水解的淀粉结合成蓝色复合物，其蓝色的 深浅与未经酶促反应的空白管比较，从而 推算出淀粉酶的活力单位。
异，一般空白吸光度应在0.40以上。
注意事项
缓冲淀粉溶液若出现混浊或絮状物，表示 缓冲淀粉溶液受污染或变质，不能再用， 应重新配制。
本法适用于其他体液淀粉酶的测定。尿液 先作20倍稀释后测定。
注意事项
酶活性在400U以下时，与底物的水解量成 线性。如测定管吸光度小于空白管吸光度 一半时，应加大血清稀释倍数或减少稀释 血清加入量，测定结果再乘以稀释倍数。
草 AM酸Y盐活、性拘有橼抑酸制盐作、用E，D肝TA素-N无a抑2及制氟作化用钠。对 唾液含高浓度淀粉酶应防止带入。 淀粉产品不同，其空白吸光度可有明显差
临床意义
淀粉酶可通过肾小球滤过。流行性胰腺炎， 特别是急性胰腺炎时，血和尿中的AMY显 著增高。急性胰腺炎发病后8~12h血清 AMY开始升高，12~24h达高峰，2~5d下 降至正常。如超过500U有意义，达350U 时应怀疑有此病。
尿中AMY约于发病后12~24小时开始升高， 下降也比血清AMY慢，因此在急性胰腺炎 后期测定尿AMY更有价值。