新合成蛋白标记-蛋白质组
标记亲和素生物素法
标记亲和素生物素法标记亲和素生物素法是一种常用的生物化学实验技术，用于研究蛋白质的相互作用。
本文将介绍亲和素生物素法的原理、应用和实验步骤。
一、原理亲和素生物素法基于生物素（biotin）与亲和素（avidin或streptavidin）之间的高度特异性结合。
生物素是一种水溶性维生素，与亲和素结合后形成稳定的复合物。
利用这种结合关系，可以将含有生物素的分子与亲和素结合，从而实现对目标分子的标记和纯化。
二、应用亲和素生物素法在生物科学研究中有广泛的应用。
其中一些主要应用包括：1. 蛋白质纯化：通过将含有生物素的标签蛋白与亲和素结合，可以实现对目标蛋白的高效纯化。
2. 免疫组化：生物素标记的抗体可以与细胞或组织中的特定抗原结合，从而实现对抗原的检测和定位。
3. 蛋白质相互作用研究：通过将目标蛋白与生物素标记的配体蛋白结合，可以研究蛋白质的相互作用和信号传导机制。
三、实验步骤亲和素生物素法的实验步骤主要包括以下几个方面：1. 标记生物素：将生物素与所需标记的分子（如蛋白质或核酸）进行化学反应，将生物素引入目标分子中。
2. 制备亲和素柱：将亲和素（如avidin或streptavidin）固定在柱子上，形成亲和素柱。
亲和素柱可以商购买或自行制备。
3. 样品处理：将标记了生物素的分子与亲和素柱接触，使其与亲和素结合。
4. 洗脱：通过改变溶液条件，如改变pH值或添加竞争性配体，使亲和素与目标分子解离，从而洗脱目标分子。
5. 分析和应用：将洗脱得到的目标分子用于后续实验或分析，如Western blot、质谱分析等。
四、实验注意事项在进行亲和素生物素法实验时，需要注意以下几点：1. 使用高纯度的生物素和亲和素，以确保实验结果的准确性。
2. 选择适当的洗脱条件，以实现目标分子的高效洗脱。
3. 控制实验中的非特异性结合，以减少背景信号。
4. 根据实验需要选择合适的生物素标记方法，如目标分子的标记位置和标记方式（N-末端、C-末端或内部标记）。
蛋氨酸合成 新和成 -回复
蛋氨酸合成新和成-回复蛋氨酸是一种必需氨基酸，被广泛用于食品、医药和化妆品行业。
而蛋氨酸合成，指的就是通过化学或生物技术方法合成蛋氨酸的过程。
在这篇文章中，我们将详细介绍蛋氨酸合成的步骤和常见的方法，并探讨一些相关的应用和前景。
蛋氨酸合成的第一步是选择和准备原料。
蛋氨酸的合成一般使用对半胱氨酸作为起始材料，因此需要从合适的原料中提取或合成对半胱氨酸。
对半胱氨酸的提取可以通过酵母或细菌发酵得到，而对半胱氨酸的合成则需要进行一系列的化学反应。
此外，还需要选择其他必要的试剂和催化剂，以保证反应的进行和产物的纯度。
在得到对半胱氨酸后，接下来的步骤就是将对半胱氨酸转化为蛋氨酸。
这一步通常使用还原剂，如亚硫酸氢钠或亚硫酸铵，将对半胱氨酸中的硫-硫键断裂，从而形成两个蛋氨酸分子。
这个过程中一般需要控制反应的温度和PH值，以确保高产率和高选择性。
蛋氨酸的合成还可以通过其他方法实现，比如利用细菌进行生物合成。
在这种方法中，通过改造细菌基因，使其具备合成蛋氨酸的能力。
这样一来，可以在大规模培养细菌的过程中，通过提供适当的培养基和环境条件，使细菌高效地合成蛋氨酸。
这种方法的优势是相对环保和快速，但需要对菌株进行基因改造和优化。
蛋氨酸合成的最后一步是对产物进行纯化和提纯。
由于蛋氨酸和对半胱氨酸的化学性质相似，所以在合成过程中可能会有一些杂质存在。
因此，需要使用适当的分离和纯化技术，如色谱和过滤等，将蛋氨酸与杂质分离开来，得到纯度较高的蛋氨酸产物。
蛋氨酸的合成不仅有广泛的工业应用，还在医药和化妆品领域有一定的前景。
蛋氨酸作为一种重要的氨基酸，对人体健康和美容具有重要的作用。
它可以用作蛋白质的合成和修复，在抗衰老和抗氧化方面也有独特的功能。
此外，蛋氨酸还可以用于治疗一些代谢性疾病，如不育症和某些代谢紊乱。
总之，蛋氨酸合成是一个复杂且多步骤的过程，需要选择合适的原料和试剂，并使用适当的催化剂和分离技术。
随着生物技术的不断发展，蛋氨酸的合成方法也将进一步改进和优化。
蛋白质的合成、转运、修饰
蛋⽩质的合成、转运、修饰蛋⽩质的合成蛋⽩质的种类是由基因决定的,也就是说⼈类基因组有多少个基因,⼈体就有多少种蛋⽩质,只是蛋⽩质表达的时期和部位不同.根据⼈类基因组计划分析得知：全部⼈类基因组约有2.91Gbp,约有39000多个基因；也就是说⼈体蛋⽩质的种类有39000多种蛋⽩质⽣物合成可分为五个阶段，氨基酸的活化、多肽链合成的起始、肽链的延长、肽链的终⽌和释放、蛋⽩质合成后的加⼯修饰⼀．氨基酸的活化分散在胞液中的各种氨基酸需经特异的氨基酰-tRNA合成酶催化，ATP供能，并需Mg2＋或Mn2＋参与在氨基酸的羧基上进⾏活化，⽣成中间复合物（）后者再与相应的tRNA作⽤，将氨基酰转移到tRNA分⼦的氨基酸臂上，即3′末端腺苷酸中核糖的3′（或2′）羟基以酯键相结合形成氨基酰-tRNA【氨基酰tRNA的⽣成】tRNA各种tRNA的⼀级结构互不相同，但它们的⼆级结构都呈三叶草形三叶草形结构的主要特征是:含有四个螺旋区、三个环和⼀个附加叉四个螺旋区构成四个臂，其中含有3′末端的螺旋区称为氨基酸臂，因为此臂的3′-末端都是C-C-A-OH序列，可与氨基酸连接三个环分别⽤Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ表⽰环Ⅰ含有5，6⼆氢尿嘧啶，称为⼆氢尿嘧啶环（DHU环）环Ⅱ顶端含有由三个碱基组成的反密码⼦，称为反密码⼦环；反密码⼦可识别mRNA分⼦上的密码⼦，在蛋⽩质⽣物合成中起重要的翻译作⽤环Ⅲ含有胸苷（T）、假尿苷（ψ）、胞苷（C），称为假尿嘧啶环（TψC环）；此环可能与结合核糖体有关tRNA在⼆级结构的基础上进⼀步折叠成为倒“L”字母形的三级结构起始因⼦原核起始因⼦只有三种（IF1、IF2、IF3）真核起始因⼦(简称为eIF)种类多且复杂，已鉴定的真核起始因⼦共有12种延长因⼦原核⽣物（简称EF）由三部分组成：EF-Tu，EF-Ts，和EF-GEF-Tu它介导氨酰-tRNA进⼊核糖体的空位EF-Ts充当EF-Tu亚基的鸟嘌呤核苷酸交换因⼦,催化EF-Tu释放GDPEF-G催化tRNA的移位和多肽延伸的每个循环后期mRNA从核糖体上掉下来真核⽣物（简称eEF）真核⽣物中分为：eEF-1和eEF-2eEF-1有两个亚基，α和βγα相当于原核⽣物中的EF-Tu亚基，它介导氨酰-tRNA进⼊核糖体的空位Βγ相当于原核⽣物中EF-Ts，核苷酸交换因⼦α,催化GDP从α上释放eEF-2相当于原核⽣物的EF-G，催化tRNA的移位和多肽延伸的每个循环后期mRNA从核糖体上掉下来终⽌因⼦(释放因⼦)原核⽣物细胞的释放因⼦（简称RF）：识别终⽌密码⼦引起完整的肽链和核糖体从mRNA 上释放的蛋⽩质释放因⼦1（RF1）：能识别终⽌密码⼦UAA和UAG⽽终⽌蛋⽩质合成的细菌释放因⼦释放因⼦2（RF2）：能识别终⽌密码⼦UAA和UGA⽽终⽌蛋⽩质合成的细菌释放因⼦释放因⼦3（RF3)：与延长因⼦EF-G有关的细菌蛋⽩质合成终⽌因⼦当它终⽌蛋⽩质合成时，它使得因⼦RF1和RF2从核糖体上释放真核⽣物细胞只有⼀种终⽌因⼦（称为eRF）能识别所有的终⽌密码⼦因为它没有与GTP结合的位点，所以它不能帮助完成合成的多肽从P位点的tRNA的释放在真核⽣物内可能还存在能与eRF合作、帮组多肽从核糖体释放的蛋⽩质核糖体的活性部位单个核糖体上存在四个活性部位，在蛋⽩质合成中各有专⼀的识别作⽤1．A部位：氨基酸部位或受位：主要在⼤亚基上，是接受氨酰基-tRNA的部位2．P部位：肽基部位或供位：主要在⼩亚基上，是释放tRNA的部位3．肽基转移酶部位（肽合成酶），简称T因⼦：位于⼤亚基上，催化氨基酸间形成肽键，使肽链延长4．GTP酶部位：即转位酶（EF-G），简称G因⼦，对GTP具有活性，催化肽键从供体部位→受体部位核糖体上还有许多与起始因⼦、延长因⼦、释放因⼦以及各种酶相结合的位点核糖体的⼤⼩是以沉降系数S来表⽰，S数值越⼤、颗粒越⼤、分⼦量越⼤原核细胞与真核细胞核糖体的⼤⼩亚基是不同的⼆．核糖体循环（肽链合成）1.肽链启动阶段在蛋⽩质⽣物合成的启动阶段,核蛋⽩体的⼤、⼩亚基,mRNA与⼀种具有启动作⽤的氨基酸tRNA共同构成启动复合体。
TMT蛋白组学
TMT蛋白组学
TMT是一种化学标记技术，主要结合质谱应用于定量蛋白质组学的研究。
百泰派克生物科技提供基于质谱的TMT定量蛋白组学分析服务。
TMT蛋白组学
TMT蛋白组学，主要是指利用TMT技术对蛋白质组进行定量分析。
TMT(Tandem Mass Tags)技术是美国Thermo Fisher公司研发的一种化学标记技术，用于基于质谱（MS）的生物大分子（例如蛋白质、多肽和核酸）的定量和鉴定。
TMT属于被称为等压质量标签的试剂家族，它们提供了基于凝胶或抗体的定量方法的替代方法。
除了有助于蛋白质组定量分析外，TMT标签还可在RPLC-MS分析中提高某些高亲水性分析物（如磷酸肽）的检测灵敏度。
TMT蛋白组定量分析原理
TMT采用多个稳定同位素标签，特异性标记多肽的氨基基团后进行串联质谱分析，能够同时比较多达10种不同样本中蛋白质的相对含量。
TMT所有标签的化学结构均相同，由报告基团、平衡基团以及肽反应基团组成，但每个标签都包含在不同位置取代的同位素，因此报告基团和平衡集团在每个标签中具有不同的分子质量。
基团合并则具有相同的总分子量和结构，因此在色谱或电泳分离过程中，以及在单一MS模式下，用不同标签标记的分子是无法区分的。
在MS / MS模式下对标记分子进行片段化后，可从片段化离子获得序列信息，同时从标签的片段化可获取定量数据，从而实现蛋白组定量分析。
TMT蛋白组学。
细胞生物学第十三至十七章作业答案
第十三章细胞增殖及其调控1 什么是细胞周期？简述细胞周期各时相及其主要事件。
答：细胞周期: 是指连续分裂的细胞从一次有丝分裂结束后开始生长到下次有丝分裂终止所经历的全过程。
细胞周期各时相的生化事件：①G1期：DNA合成启动相关，开始合成细胞生长所需要的多种蛋白质、RNA、碳水化合物、脂等，但不合成DNA；②S期: 开始合成DNA和组蛋白；在真核细胞中新和成的DNA立即与组蛋白结合，组成核小体串珠结构；③G2期:主要大量合成ATP、RNA和蛋白质，包括微管蛋白和成熟促进因子等；④M期: 为细胞分裂期，一般包括前期，中期，后期，末期4个时期。
2 细胞通过什么机制将染色体排列到赤道板上？有何生物学意义？答：细胞将染色体排列到赤道板上的机制可以归纳为牵拉假说和外推假说。
①牵拉假说：染色体向赤道面方向运动，是由于动粒微管牵拉的结果。
动力微管越长，拉力越大，当来自两级的动粒微管拉力相等时，即着丝粒微管形成的张力处于动态平衡时，染色体即被稳定在赤道面上；②外推假说：染色体向赤道方向移动，是由于星体的排斥力将染色体外推的结果。
染色体距离中心体越近，星体对染色体的外推力越强，当来自两极的推力达到平衡时，推力驱动染色体移到并稳定在赤道板上。
染色体排列到赤道板上具有重要的生物学意义，染色体排列到赤道板后，Mad2和Bub1消失，才能启动细胞分裂后期，并为染色体成功分开并且平均分配向两极移动做准备。
3 细胞周期有哪些主要检验点？各起何作用？答：细胞周期有以下主要检验点：①G1/S期检验点：检验DNA是否损伤、能否启动DNA的复制，作用是仿制DNA损伤或是突变的细胞进入S期；②S期检验点：检验DNA复制是否完毕，DNA复制完毕才能进入G2期；③G2/M期检验点：DNA是否损伤、能否开始分裂、细胞是否长到合适大小、环境是否利于细胞分裂，作用是使得细胞有充足的时间将损伤的DNA得以修复；④中-后期检验点：纺锤体组装的检验，作用是抑制着丝点没有正确连接到纺锤体上的染色体，确保纺锤体正确组装。
蛋白质生物合成—翻译及翻译后过程
A
C
C
氨基酸臂
反密码环
氨基酸的活化
氨基酰-tRNA合成酶(aminoacyl-tRNA synthetase)
氨基酰-tRNA合成酶
氨基酸 + tRNA
氨基酰- tRNA
ATP
AMP＋PPi
氨基酸 ＋ATP-E → 氨基酰-AMP-E ＋ PPi 氨基酰-AMP-E ＋ tRNA→ 氨基酰-tRNA＋ AMP ＋ E
翻译中运输过程 （信号肽假说）
信号肽(Signal sequence) —能启动蛋白质运转的任何一 段多肽
使核蛋白体与内质网上的受体结合，合成的肽链进入 内质网内腔运至靶器官，信号肽酶切除信号肽，使成熟 的蛋白质释放至胞外
原核延长因子
生物功能
对应真核延长 因子
EF-Tu EF-Ts EFG
促进氨基酰-tRNA进入A位，结合 分解GTP
调节亚基
有转位酶活性，促进mRNA-肽酰tRNA由A位前移到P位，促进卸载 tRNA释放
EF-1-α EF-1-βγ
EF-2
（一）进位
又称注册(registration)
指根据mRNA下一 组遗传密码指导，使相 应氨基酰-tRNA进入核 蛋白体A位。
过氧化体蛋白 溶酶体蛋白
信号序列或成分 信号肽 信号肽，C端-Lys-Asp-Glu-Leu-COO-(KDEL序列) N端靶向序列（20～35氨基酸残基） 核定位序列（-Pro-Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val-， SV40 T抗原） -Ser-Lys-Leu-（PST序列） Man-6-P（甘露糖-6-磷酸）
原核生物mRNA的特点
S-D序列：原核生物mRNA起始密码AUG上游8~13核苷酸 处，存在一段5′-UAAGGAGG-3′的保守序列，称为S-D 序列。是mRNA与核蛋白体识别、结合的位点
细胞生物名词解释
细胞生物名词解释细胞生物名词解释A癌基因：是控制细胞生长增殖分化并具有诱导细胞恶性转化潜能的一类基因氨酰-tRNA:B被动运输：指不需要消耗细胞代谢的能量，将物质从浓度高的一侧经细胞膜转运至浓度低的一侧运输方式。
简单扩散，易化扩散，通道扩散半保留复制：在DNA复制时，两条链分开，然后按照碱基配对的方式合成新的子链，每个子链分子的双链DNA中一条链来自亲代DNA，另一条链是新和成的，这样组成新的DNA分子，这种复制方式称为半保留复制初级溶酶体：指高尔基复合体以出芽方式形成的小体，球形，内不含作用底物，但含多种水解酶，但酶无活性。
次级溶酶体：初级溶酶体与含底物的小泡融合而成的溶酶体，含水解酶和消化物，水解酶有活性。
分为自噬性和异噬性两种超微结构：在电镜下观察到直径小于0.2微米的细微结DNA的包装和构建、DNA复制、基因表达以及核内的一系列生物活动。
在细胞核内，纤维性蛋白组成的骨架结构核型：一个体细胞中全部的染色体，包括染色体数目大小形态特征核小体：染色体的基本结构单位，是由组蛋白和200个碱基对的DNA双螺旋组成的球形小体，其核心由四种组蛋白（H2A、H2B、H3、H4）各两分子共8分子组成的八聚体，核心的外面缠绕了1.75圈的DNA双螺旋，其进出端结合有H1组蛋白分子。
核仁组织区：由于核仁内染色质这一部分的常染色质含有合成rRNA的基因(Rdna)，是形成核仁的关键部位，所以又称核仁组织中心或核仁组织区核纤层：是位于内层核膜靠核质一侧的一层由纤维蛋白组成的纤维状网络结构。
它普遍存在于高等真核细胞间期细胞核中。
呼吸链（respiratory chain）是一组酶复合体，由许多递氢体和传电子体按照一定排列顺序组成的传递体系，分布并嵌在线粒体内膜上。
细胞生命活动作用重要的有机化合物。
包括蛋白质、核酸和酶等。
随体：指位于染色体末端的球形染色体节段，通过副缢痕区与染色体主体部分相连。
它是识别染色体的重要形态特征之一，带有随体的染色体称为sat-染色体四分体：同源染色体联会的结果是形成二价体，每个二价体都由两条同源染色体组成，这样一个二价体有4条染色单体，称为四分体。
分子生物学名词解释哦
1、SD序列shine-Dalgarnoa sequence：存在于原核生物mRNA起始密码上游7-12个核苷酸的富含嘌呤的保守片段，能与16SrRNA3’端富含嘧啶的区域进行反向互补，所以将mRNA 的AUG起始密码子置于核糖体的适合位置以便起始翻译作用。
2、分子伴侣：他是细胞中一类能够识别并结合到不完全折叠或装备的蛋白质上帮助这些多肽链正确折叠、转运或防止它们聚集的蛋白质。
3、简并性：由一种以上的密码子编码同一个氨基酸的现象，对应于同一个氨基酸的密码子称为同义密码子。
4、遗传密码：指mRNA上每三个核苷酸翻译成多肽链上的一个氨基酸，这三个核苷酸就称为一个密码子。
5、终止密码子：不代表任何氨基酸，任何tRNA分子都不能识别的，但可以被终止因子或释放因子并引起新和成多肽链从核糖体上释放的密码子。
UGA UAA UAG6、密码子偏爱性：指不同种属的生物对简并密码具有不同的使用频率。
7、非编码区：不编码目标蛋白质的mRNA序列。
8、蛋白质糖基化：一种翻译后修饰，是氨基酸侧链共价键修饰中的一种，包括O-糖基化：侧链通过GalNAc连接在蛋白质的Ser或The的羟基处；N-糖基化：糖链连接在蛋白质的天冬酰胺的氨基侧链处。
9、反密码子：tRNA分子的反密码子环上的三联体核苷酸残基序列。
10、密码子变偶性：处于密码子3’端的碱基和与之互补反密码子5’端的碱基之间的配对有一定的自由度。
如I可以和密码子上3’端的U C A配对。
这种现象称为密码子的变偶性。
11、开放阅读框：指一组连续的含有三联密码子的能被阅读翻译成多肽链序列的DNA序列。
由起始密码子开始，到终止密码子结束。
12、多聚核糖体：核糖体在细胞内并不是单独执行功能的，而是由多个甚至几十个核糖体串联在一条mRNA分子上高效的进行多肽链的合成，这种具有特殊功能与形态结构的核糖体与mRNA的聚合体称为多聚核糖体。
13、移码突变frame shift mutation：由于单个碱基或者非三的整倍数的碱基的插入或缺失一起的从突变位点整个可读框的改变，从而产生完全不一样的氨基酸序列。
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BONCAT (bioorthogonal noncanonical amino acid tagging)
azidohomoalanine (AHA, 1)
Substrates are newly synthesized proteins BONCAT is based on introduction of AHA AHA is acepted by tRNA synthetase AHA incorporation is unbiased incorporation of AHA enables chemoselective tagging with an alkyne affinity tag
Relative abundance of newly synthesized proteins.
66 proteins >2 92 proteins ~1.5-2 186 proteins <1.5
COFRADIC has several advantages
it utilizes standard chromatographic techniques and chemicals
David Tirrell’s group
Growth rate and viability of cell cultured in AHA
methionine auxotrophic E. coli strain
M9+19aa+Met OD=1.0, wash
M9+19aa+Met M9+19aa+AHA
Quantitation of newly synthesized proteins induced by heat shock
M9+19aa+Met 37oC M9+19aa+Met
A labeling time of 15 mins
ห้องสมุดไป่ตู้AHA A 37oC B
Protein extraction, digestion
iTRAQ reporter
114
115
AHA A 44oC B
116
117
1:1:1:1 ICAT cation exchange cartridge
First run on RP-HPLC TCEP treatment O/N Second run on RP-HPLC On diagonal fraction were discarded, off diagonal fraction were pooled
diaminobutyrate (DAB) residue
Homoserine (HS) residue
Tandem-MS spectra of a peptide observed in two forms.
Proposed TCEP-induced reaction scheme
Venn diagram’s of proteins identified in this and other studies.
it provides a simple and robust approach to enrichment of
labeled peptides.
Thank you
Growth rate, protein synthesis and viability in the present
of AHA and methinonine is the same during the first 30 min.
After prolonged labeling growth arrest does occur
cell viability, Growth curve
Growth rate and viability of cell cultured in AHA
Number of colony forming units per OD600 per ml of culture over time
Growth of E. coli strain MTD123 on a range of concentrations of AHA
The principle of the COFRADIC approach
Chromatographic separation of enriched labeled peptides isolated by COFRADIC.
Extracted ion chromatogram of a peptide identified in two forms
to achieve separation of labeled from unlabeled peptides.
it provides chromatographic fractionation as well as
enrichment of labeled peptides, thereby facilitating mass spectrometric identification.