雌激素受体(ER)免疫组化试剂盒
免疫组化指标意义及分子分型
E - cadherin
属于钙粘蛋白家族中经典旳钙粘蛋白亚族旳一员。分 布在全部上皮组织中，是建立与保持上皮细胞极性和 细胞-细胞间紧密连接旳关键分子。
E - cadherin是一分子量约120 kD旳跨膜糖蛋白，分为 细胞外区、跨膜区、胞浆区。
Decision Resources Epidemiology Data & Primary MR.
中国情况
早期: 81%
100% 乳腺癌患者
晚期: 19%
绝经前 60%
绝经后 40%
ER– 50%
ER+ 50%
ER– 40%
ER+ 60%
流行病学调查发觉，中国妇女发病旳高峰年龄较美国提前23年，为40－49岁， 30－39岁年龄组乳腺癌所占百分比超出20％
如细胞抗凋亡、增强细胞运动性及血管生成中发挥主
要作用。 COX - 2高体现与乳腺癌脉管侵犯、淋巴结侵
犯、分期、PR 体现、CerbB2 体现及p53体现具有有关
性。
全球情况
早期: 81%
100% 乳腺癌患者
晚期: 19%
绝经前 26%
绝经后 74%
ER– 46%
ER+ 54%
ER– 27%
ER+ 73%
性激素受体
孕激素受体（prosgesterone receptor，PR） PR是E2和ER结合诱导旳产物，其合成必
须有雌激素作为开启，缺乏ER时极少能合成 PR，PR 旳出现显示ER 功能机制旳完整性， 大多数乳腺癌呈激素依赖性
正常乳腺上皮细胞内存在ER、PR。
常用免疫组化试剂介绍
常用免疫组化试剂介绍一、用于鉴别诊断(一)上皮源性：1. 细胞角蛋白/cytokeratin.CK：目前，商品化的细胞角蛋白有20多种，不同的分子量代表不同类型的上皮标志。
通常将C K分为两大类型：Ⅰ型〔低分子量〕；Ⅱ型〔高分子量〕。
理论上讲，大多数单层上皮表达低分子量的CK；复层上皮多表达高分子量的CK；移形上皮〔膀胱〕和假复层上皮〔呼吸道的被覆上皮〕既表达低分子量的CK，也表达高分子量的CK。
在癌组织中，低分子量的CK多在腺癌中表达，高分子量的CK多在鳞癌中表达。
目前为止，未发觉任何一种上皮只含有一种CK，某些上皮可含2-10种不同分子量的CK。
因此，目前试图应用单一的CK免疫表型来确定某种特定的上皮性肿瘤是不可能的。
同样，应用CK来区别腺癌、类癌和间皮瘤也是困难的。
因此，CK的免疫组化结果推断是一个较为复杂的问题，在应用这类标记物作为腺癌和鳞癌的鉴别应特别注意。
有必要时，应联合用多种CK加以综合推断。
CK的阳性表达还包含有间变癌、双向分化的滑膜肉瘤、脊索瘤、胚胎癌、间皮瘤、上皮样肉瘤、胸腺瘤等。
CK的阴性表达有：副节瘤单向分化的滑膜肉瘤、软骨〔肉〕瘤、精原细胞瘤、淋巴瘤、脑膜瘤、恶黑、恶纤组、软组织肉瘤〔除特别类型外〕。
在推断CK免疫组化结果时应注意几点：〔1〕 CK的单克隆抗体优于多克隆抗体；〔2〕 CK常出现斑点状的假阳性反响，应注意识别；〔3〕虽然大多数CK多在胞浆表达，但CK17多在胞核表达；〔4〕绝大多数CK抗体需用胰酶消化，可增加阳性表达率和染色强度；〔5〕局部非上皮性肿瘤〔平滑肌肉瘤〕可见有CK表达，在诊断时应注意；〔6〕淋巴结、扁桃体和脾组织中的滤泡外的网织细胞含有CK8和18以及desmin,在推断淋巴结转移癌和肌源性肉瘤转移时应依据组织学综合推断。
2.上皮膜抗原〔epithelial membrane antigen/EMA〕：EMA是上皮细胞分泌的一种乳脂小球膜糖蛋白，广泛存在于人体各种上皮细胞中〔也存在于间皮细胞、浆细胞、组织细胞和T细胞淋巴瘤中〕，其分布与角蛋白相似，但对内脏腺上皮优于细胞角蛋白，尤其是分化差的癌EMA有时可呈强阳性表达。
HER2检测试剂盒(免疫组化法)说明书-Agilent
DAB 显色液。 5% 3, 3’-二氨联苯胺四盐酸显色剂溶液。
3×500mL
2×5
抗原修复液（包含清洗剂）（10×）。 0.1 mol/L柠檬酸盐缓冲液，1% 吐温-20，pH 5.7。
质控切片
P04605CN_01_SK00121-2CN/2017.02 2/26
P04605CN_01
10 × 试剂瓶
【检测原理】
HercepTest™检测试剂盒包含对常规处理的、石蜡包埋的样本进行两步法免疫组化染色 所需要的全部试剂。兔抗人 HER2 蛋白一抗孵育后，该试剂盒采用基于葡聚糖技术的即用型 显色试剂。该试剂包含羊抗兔二抗和偶联至葡聚糖多聚体骨架上的辣根过氧化酶分子。因此， 不需要再依次使用连接抗体，人免疫球蛋白显色试剂和胎牛血清之间的交叉反应也因为使用 固相吸附材料而消除。依次填加的色素原的酶转换，也使得显色反应发生于抗原所在部位。 标本需要复染和封片。反应结果在光学显微镜下观察。质控玻片包含 3 个福尔马林固定、石 蜡包埋的人类乳腺癌细胞系，染色强度分别在 0、1+、以及 3+，提供用于对染色结果进行 评估。这些细胞的染色强度与其所表达的受体密度一致。
该抗体着色为棕色 DAB 染色，定位于细胞膜。是一种半定量免疫组化分析方法，适用 于考虑接受曲妥单抗治疗患者的辅助评价方法。
人 HER2 基因（也称之为 ERBB2 或 NEU）编码蛋白通常称之为 HER2 或 p185HER2。 HER2 蛋白是一种膜受体酪氨酸激酶，与表皮生长因子受体（EGFR 或 HER1）具有同源性 (1-8)。HER2 蛋白通常由各种表皮细胞表达，是一种正常组织成分（8）。
外。该试剂盒所提供的材料足够用于最多 10 次免疫组化染色。
数量
HER2检测试剂盒(免疫组化法)说明书-Agilent
DAB 显色液。 5% 3, 3’-二氨联苯胺四盐酸显色剂溶液。
3×500mL
2×5
抗原修复液（包含清洗剂）（10×）。 0.1 mol/L柠檬酸盐缓冲液，1% 吐温-20，pH 5.7。
质控切片
P04605CN_01_SK00121-2CN/2017.02 2/26
P04605CN_01
10 × 试剂瓶
外。该试剂盒所提供的材料足够用于最多 10 次免疫组化染色。
数量
说明
1×22 mL
过氧化物酶阻断剂。 3%的过氧化氢，含有15 mmol/L的叠氮钠（NaN3）。
1×12 mL
1×22 mL
兔抗人HER2多克隆抗体。 即用型亲和分离的抗体,保存在0.05 mol/L Tris/HCl, 0.1 mol/L NaCl, 1%BSA, 酒 石黄(Tartrazin), 专利蓝V(Patentblue V), 15 mmol/L NaN3, pH 7.2溶液中。 免疫原：合成的HER2蛋白的C-末端（细胞质部分）片段部分，并偶联至血蓝蛋 白上。
2×22 mL
阴性质控试剂。
与HER2抗体等价蛋白浓度下的正常兔血清免疫球蛋白成分，保存在0.05 mol/L Tris/HCl, 0.1 mol/L NaCl, 15 mmol/L NaN3, pH 7.2，并含有1%BSA稳定剂的溶液 内。
1×1mL
DAB底物缓冲液。 50 mM咪唑, 1mM N, N'-乙基双 (2-[2-羟基苯基]甘氨酸) (EDHPA), 0.1%乙基苯基 聚乙二醇（Nonidet P-40）, 0.02% 过氧化氢, 0.01% 氯化苯二甲烃铵, pH 7.5。
【检测原理】
HercepTest™检测试剂盒包含对常规处理的、石蜡包埋的样本进行两步法免疫组化染色 所需要的全部试剂。兔抗人 HER2 蛋白一抗孵育后，该试剂盒采用基于葡聚糖技术的即用型 显色试剂。该试剂包含羊抗兔二抗和偶联至葡聚糖多聚体骨架上的辣根过氧化酶分子。因此， 不需要再依次使用连接抗体，人免疫球蛋白显色试剂和胎牛血清之间的交叉反应也因为使用 固相吸附材料而消除。依次填加的色素原的酶转换，也使得显色反应发生于抗原所在部位。 标本需要复染和封片。反应结果在光学显微镜下观察。质控玻片包含 3 个福尔马林固定、石 蜡包埋的人类乳腺癌细胞系，染色强度分别在 0、1+、以及 3+，提供用于对染色结果进行 评估。这些细胞的染色强度与其所表达的受体密度一致。
雌二醇定量检测试剂盒说明书
检验方法的局限性
干扰物质
不能使用溶血的，黄疸的或高血脂的样本，但血色素 (4 mg/ml), 胆红素 (0.5 mg/ml) 和甘油三酸酯
(30 mg/ml) 不影响实验结果。
药物干扰
目前没有物质(药物)影响雌二醇测量。
产品性能指标
1. 批内精密度 ≤10 %
2. 批间误差 ≤15 %
3. 回收率 85～120 %
3. 含叠氮纳化物不能用于酶反应。
检验方法
1. 实验前所有的试剂、样本和微孔板条达到室温（18～25°C）
2. 双蒸水 1:40 稀释浓缩的洗液(稀释的洗液储存在 2～8°C 可保存 2 周)
3. 每孔加 25 μl 标准品、质控品、样品（96 孔板要求在 3 分钟内加样完毕）。
4. 每孔加 200 μl 的酶结合物，充分混合 10 秒钟，室温孵育 120 分钟。
主要组成成分
1. 单克隆抗体包被的可拆卸的 96（12×8）孔微孔板 1 块 塑封袋
2. E2 标准品（0, 25; 100; 250; 500; 1000; 2000 pg/ml） 1ml×7 瓶 无色玻璃瓶
3. 多克隆抗体－酶结合物
25 ml×1 瓶 白色塑料瓶
4. 底物
14 ml×1 瓶 棕色塑料瓶
等等, pp. 331-85. Raven Press, New York (1988).
3. Hall, P.F., 睾类固醇合成: 结构和调节: 再生生理学, Ed.: Knobil, E., 和 Neill, J. 等等., pp 975-98. Raven Press, New York (1988). 4. Siiteri, P.K. Murai, J.T., Hammond, G.L., Nisker, J.A., Raymoure, W.J. 和 Kuhn, R.W., 类固醇激素清 液运输, Rec. Prog. Horm. Res. 38:457 - 510 (1982). 5. Martin, B., Rotten, D., Jolivet, A. 和 Gautray, J-P-.卵巢卵泡液蛋白限制类固醇，《临床内分泌学与新 陈代谢》. 35: 443-47 (1981). 6. Baird, D.T., 女性卵巢类固醇分泌物和新陈代谢：卵巢的内分泌功能：James, V.H:T., Serio, M. 和 Giusti, G. pp. 125-33, 纽约学术出版社 (1976). 7. McNastty, K.P., Baird, D.T., Bolton, a., Chambers, P., Corker, C.S. 和 McLean, H., 人卵巢静脉血浓度 和月经周期卵泡液，内分泌学 71:7785 (1976). 8. Abraham, G.E., Odell, W.D., Swerdloff, R.S., 和 Hopper, K., 月经周期血浆中的 FSH, LH,孕，17-羟 脯氨酸和雌二醇-17 同时进行放射性免疫测定，《临床内分泌学与新陈代谢》34:312-18 (1972). 9. March, C.M., Goebelsmann, U., Nakumara, R.M., 和 Mishell, D.R., 在激素黄体化中期，雌二醇和孕 酮的作用和卵泡刺激素增高，《临床内分泌学与新陈代谢》 49:507-12 (1979). 10. Simpson, E.R., 和 McDonald, P.C., 怀孕 内 分 泌 : 内分 泌 学 教 材 , Ed.: Williams, R.H. pp412-22, Saunders Company, Philadelphia (1981). 11. Jenner, M.R., Kelch, R.P.,等等, 青春期前儿童激素的变化, 青春期女性和早熟，性腺发育不全和儿 童女性化肿块，临床内分泌学 34: 521 (1982). 12. Goldstein, D. 等等, 黄体不足，雌二醇和孕酮的关联性. 37: 348-54 (1982). 13. Odell, W.D. 和 Swerdloff, R.D.,男性性腺功能异常,《临床内分泌学》8:149-80 (1978). 14. McDonald, P.c., Madden, J.C., Brenner, P.F., Wilson, J.D. 和 Siiteri, P.K. 正常男性和女性雌二醇的基 源，《临床内分泌学与新陈代谢》 49:905 (1979). 15. Taubert, H.d. 和 Dericks-Tan, J.s.E., 克罗米酚对排卵的诱导作用结合服用高剂量雌激素和 LH-RH 搐鼻法：排卵 Crosignandi, P.G. 和 Mishell, D.R., pp.265-73, 纽约学术出版社 (1976). 16. Fishel, S.B., Edwards, R.G., Purdy, J.M., Steptoe, P.C., Webster, J. Walters, E., cohen, J. Fehilly, C. Hewitt, J., 和 Rowland, G., 月经自然周期或克罗米酚卵泡刺激和尿促性素，胚胎移植, 堕胎，体外受 精生育， 体外受精胚胎移植 1:24-28 (1985). 17. Wramsby, H., Sundstorm, P- 和 Leidholm, P., 妊娠率跟体外受精代替卵分裂的关系，雌二醇和孕 酮水平成为唯一指数，人类生殖 2: 325-28 (1987). 18. Ratcliff, W.A.., Carter, G.D., 等等 , 雌二 醇实验：临床生化技术的应用和指导，临床生化， 25:466-483 (1988). 19. Tietz, N.W. 临床化学教材, 1986. 生产企业 企业名称：德国 DRG 诊断设备有限公司 地址：德国 玛堡市斐恩贝塔思路 18 号 邮政编码：35069 电话：49（6421）17000 传真：49（6421）170050 网址：www.drg-diagnostics.de 售后服务单位名称：北京协和洛克生物技术研究开发中心 地址：北京市海淀区恩济庄 18 号院 4－2－302 邮政编码：100036 电话：010-51295656 传真：010-88140690 网址： 医疗器械生产许可证编号 京药管械生产许 20040085 号 医疗器械注册证书编号
乳腺癌免疫组化内容
乳腺癌免疫组化内容
一、标记物选择
在乳腺癌免疫组化实验中，通常会选择以下标记物：
1.ER（雌激素受体）：用于评估乳腺癌对激素治疗的反应性。
2.PR（孕激素受体）：与ER一起评估激素治疗的反应性。
3.HER2（人类表皮生长因子受体2）：用于评估乳腺癌的恶性程度和预测化疗效果。
4.Ki-67：反映肿瘤细胞的增殖活性。
5.p53：与肿瘤恶性程度和预后相关。
二、实验步骤
1.样本处理：将乳腺癌组织样本进行固定、脱水、透明、浸蜡等处理，以便进行免疫组化实验。
2.切片制备：将处理好的组织样本切成薄片，附着在载玻片上。
3.抗原修复：使用抗原修复液对组织切片进行加热，以暴露抗原并使其易于与抗体结合。
4.抗体孵育：将标记物抗体与组织切片混合，并在适宜温度下孵育一定时间，使抗体与抗原结合。
5.信号转化：使用酶或其他介质将抗原-抗体复合物转化为可见信号，以便在显微镜下观察。
6.染色观察：对组织切片进行染色，并在显微镜下观察标记物的表达情况。
7.结果分析：根据染色强度、阳性细胞比例等因素对结果进行分析，评估乳腺癌的生物学特性。
注意事项：
1.免疫组化实验需要使用特定的抗体，不同的抗体可能对不同的抗原具有特异性，因此选择合适的抗体非常重要。
2.实验过程中需要注意温度、时间和pH值等条件，以确保抗体与抗原的结合和信号转化的顺利进行。
3.免疫组化实验结果需要进行客观、准确的评估，避免出现假阳性或假阴性结果。
子宫内膜癌中ER、PR的表达及意义研究
子宫内膜癌中ER、PR的表达及意义研究刘杰【摘要】目的：探讨子宫内膜癌中雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）的表达及其临床意义。
方法应用免疫组织化学SP法检测80例正常子宫内膜（C组）、80例子宫内膜非典型增生（B组）及80例子宫内膜癌（A组）的ER、PR的表达，分析其表达及与临床分期、组织学分级、肿瘤肌层浸润和淋巴结转的相关性。
结果ER、PR在C组、B组、A组中的表达阳性率逐渐下降且统计学处理差异有统计学意义（P＜0.05）；ER、PR在子宫内膜癌不同临床分期中的阳性表达率随着期别的增加而呈降低趋势，差异有统计学意义（P＜0.05）；从组织学分级来看，低分化的癌组织中ER、PR的阳性表达率显著低于中分化和高分化癌组织（P＜0.05）；肌层浸润深度＞1/2的癌组织中ER、PR的阳性表达率显著低于肌层浸润深度≤1/2组（P＜0.05）；有淋巴结转移的癌组织中ER、PR阳性表达率显著低于无淋巴结转移的癌组织（P＜0.05）。
ER、PR与临床分期、病理分级、肌层浸润深度、淋巴结转移有关（P＜0.05）。
结论ER、PR与子宫内膜癌的发生、发展、转移及预后相关。
【期刊名称】《当代医学》【年(卷),期】2016(022)027【总页数】2页(P24-25)【关键词】雌激素受体;孕激素受体;子宫内膜癌【作者】刘杰【作者单位】山东 253400 山东省宁津县中医院【正文语种】中文子宫内膜癌是女性生殖器最常见的肿瘤之一，是女性第4位常见的癌症，仅次于乳腺癌、肺癌和肠癌[1]。
随着分子遗传学研究与不断发展的分子生物学、免疫学技术相结合，对子宫内膜癌在分子水平致癌机制的研究越来越深入。
有研究表明，子宫内膜癌的发生与雌激素有关，增加无对抗性雌激素暴露的任何因素，均能增加内膜癌的发生风险[2]。
现就ER、PR在子宫内膜癌中的表达，对于子宫内膜癌基因表达及激素失调等方面的关系进行综述，并从其发生、发展、浸润、转移、预后等多个阶段、不同层次及多个方面揭示子宫内膜癌发生、发展、浸润、转移的演变过程及预后的相关因子。
雌激素受体亚型ERα在子宫肌瘤中的表达及其临床意义
雌激素受体亚型ERα在子宫肌瘤中的表达及其临床意义作者：李青来源：《中国保健营养·中旬刊》2013年第10期【摘要】目的：检测雌激素受体亚型ERα在子宫肌瘤中的表达，探讨ERα与子宫肌瘤的发生、发展之间的关系。
方法：收集子宫肌瘤组织标本30例，相应肌瘤包膜外正常子宫肌层组织30例，选取正常子宫肌层组织10例。
应用免疫组化 S-P法，检测ERα在子宫肌瘤组织、肌瘤包膜外正常子宫肌层组织及正常子宫肌层组织中的表达。
结果：30例子宫肌瘤组织中，29例ERα蛋白阳性表达（ 29/30），30例肌瘤包膜外正常子宫肌层组织中21例阳性表达（21/30）， 10例正常子宫肌层组织中7例阳性表达（ 7/10），三组不同组织ERα蛋白阳性率比较有非常显著性差异（x 2=8.06， P =0.004）。
结论：雌激素受体亚型ERα与子宫肌瘤的发生、发展有关。
【关键词】ERα；免疫组化；肌瘤组织；肌层组织【中图分类号】R737.33 【文献标识码】A 【文章编号】1004—7484（2013）10—0034—01子宫肌瘤是妇科最常见的良性肿瘤，生育期妇女其发病率约为20%～25%，占女性生殖器良性肿瘤的52%。
长期以来关于子宫肌瘤病因的研究颇多，确切发病机制不清。
目前为止，一般认为雌激素有诱发并促进子宫肌瘤生长的作用，近来研究表明孕激素对子宫肌瘤更有促生长作用[1， 2]。
雌、孕激素的生理作用分别由雌、孕激素受体介导。
雌激素受体分为α和β两种亚型[3] ，由两个独立的基因编码。
ERα和ERβ具有不同的调节基因转录的活性，最终发挥不同的临床作用。
1 实验材料与方法1.1 材料1.1.1实验对象为2012年5月-2012年12月在沈阳市红十字会医院因子宫肌瘤行子宫切除术的30例患者和因宫颈CINⅢ级或子宫脱垂行子宫切除术的10例患者的石蜡组织标本。
肌瘤组：取子宫肌瘤结节中心部位组织30例，患者年龄35 ～ 40岁，平均37.27+1.5岁。
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雌激素受体（ER）免疫组化试剂盒
该试剂盒以 HRP 标记的链霉亲和素复合物（HRP Streptavidin Conjugate，HRP-SA）为基础，可用于检测细胞、组织内的特异性雌激素受体（ER）抗原。
该试剂盒具有灵敏度高、特异性强、定性定位准确、背景清晰。
在所用的雌激素受体（ER）一抗与相应靶抗原结合后，用生物化二抗与一抗特异性结合，最后加入HRP-SA，形成抗原—特异一抗—生物素化二抗—HRP-SA 复合物，显微镜下观察成像。
试剂盒所含试剂：
试剂A 通透液：0.1% Triton-X 100 10 mL（选用）
试剂B 2 瓶封闭缓冲液（封闭用） 10 mL/瓶
试剂C （原装进口分装）已稀释的即用型雌激素受体（ER）一抗（2.5ml）
试剂D （原装进口分装）生物素化羊抗兔IgG 1 支
（浓度1.5 mg/mL，稀释比为1:300~1:500）50 μL+抗体稀释液20ml
试剂E HRP-SA 复合物1 支（浓度1 μM，稀释比1:50~1:200）100 μL
试剂F DAB 显色液 5ml
用户自备试剂：雌激素受体（ER）
1． 10mM TBS（pH7.2~7.4）
三羟基氨基甲烷1.21g 氯化
钠7.6g
加蒸馏水800mL，浓盐酸调pH 值至7.2~7.4，最后定容至1000mL
TBS-T：TBS+Tween 20（0.05%体积比）
2．抗原修复液（依检测抗原不同而选择不同的修复液）
10mM pH6.0 柠檬酸缓冲液
柠檬酸0.38g
柠檬酸三钠2.45g
加蒸馏水900mL，浓盐酸调pH 值至6.0，最后定容至1000mL
或：0.5M EDTA 修复液（pH8.0）
EDTA·2H2O 186.1g 雌激素受体（ER）
柠檬酸三钠2.45g
加蒸馏水700mL，用10mM NaOH 调pH 值至8.0，最后定容至1000Ml
3. 缓冲甘油封固剂10 mL
4. Tween 20 5 mL
石蜡包埋组织切片免疫染色
实验步骤（建议方案）：
石蜡包埋组织切片3~4μm 厚度
1.烤片：将待做切片置于切片架上，于60℃恒温烤箱中至少烤1 hr；
2.脱蜡：切片放入盛有二甲苯的容器中脱蜡3 次（即二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ），每次10 min；
3.水化：切片经下行酒精水化，无水乙醇5min，95%乙醇2 次（每次2min），85% 乙醇2 min；75%乙醇2min，自来水冲洗，ddH2O 洗2×2min；
4.抗原修复：根据抗体说明书推荐方法进行抗原修复，常采用高压、微波（温度达到98~100℃）或酶消化修复法，室温自然冷却，自来水冲洗，ddH2O 洗2×2min，TBS 洗涤（2×2min）（具体修复方法见附1）* 注：有些抗原勿需修复，直接进入第5 步封闭。
5.封闭：滴加试剂B，37℃湿盒孵育30 min；
6.加一抗：滴加用试剂C（即用型一抗），37℃湿盒孵育2 hr 或4℃过夜；
7.洗涤： TBS-T 洗涤（3×5 min）；雌激素受体（ER）
8.封闭：滴加试剂B，37℃湿盒孵育10 min；
9.加二抗：滴加用抗体稀释液稀释的生物素化二抗（试剂D），37℃湿盒中孵育30 min；
10.洗涤： TBS-T 洗涤（3×5 min）；
11.封闭：滴加试剂Tween 20，37℃湿盒孵育封闭20 min；
12.加HRP-SA：滴加用试剂C 稀释的试剂E（1：50~200，终浓度5~20 nM），37℃湿盒中孵育30 min；
13.洗涤： TBS-T 洗涤（3×5 min），TBS 洗涤（2×5 min）；
14.显色：应用DAB 溶液（试剂F）显色；
15.复染：自来水充分冲洗，复染，脱水，透明；
16.封片：待组织标本干后，用试剂缓冲甘油封固剂封片；
17.观察成像：显微镜下观察成像。
注意事项：
1. 修复后缓冲液须自然冷却，自来水冲洗后方能把切片取出，骤冷有可能导致结晶或抗原封闭。
2. 缓冲液的量必须保证所有切片都能浸泡到，用过的柠檬酸缓冲液不能反复使用。
3. 若试剂为微量浓缩液，用前应低速离心，将内盖和管壁附着的溶液离到底部。
4. 封片前一定要换用TBS 充分洗涤，以便洗去组织上残留的Tween 20，否则会影响结果观察。
5. 如须复染细胞核，则在封片前复染或直接采用含有染核试剂的封片剂进行封片。
附1：抗原修
复方法
常用抗原修复液：柠檬酸缓冲液（0.01M pH6.0）、EDTA 抗原修复液（pH8.0 或
9.0）等等。
一、酶消化修复法
切片脱蜡水化处理，TBS 冲洗，在组织上滴加胃蛋白酶或胰蛋白酶，37℃孵育20~30min 后TBS 冲洗即可。
二、微波抗原修复法
微波盒中加入抗原修复液微波加热至沸腾，将脱蜡水化后的切片置于耐高温塑料切片架上，放入已沸腾的缓冲液中，中档或高档继续微波 10~15min，取出微波盒冷却至室温后，自来水冲洗，取出切片。
因不同微波炉微波处理时间存在差异，须自行调整。
三、直接高压抗原修复法
取修复液于不锈钢高压锅中加热至沸腾，将组织切片置于耐高温切片架上，修复液沸腾后放入切片架，盖上锅盖，待喷气后计时 1.5~2.5min 即可脱离热源，自然冷却至室温后自来水冲洗，取出切片。
此方法适用于较难检测或核抗原的修复。
四、隔水式高压抗原修复法雌激素受体（ER）
不锈钢高压锅中加自来水加热至沸腾，微波盒中加入修复液于微波炉中加热至沸腾，将切片放入微波盒中，再将微波盒放入高压锅中盖上锅盖，待喷气后计时4~8 min 即可关闭热源，自然冷却至室温后自来水冲洗，取出切片。
此方法适用于较难检测或核抗原的修复。