液相色谱柱柱效的提高和测算
色谱柱效率
色谱柱效率
色谱柱效率，也被称为柱效能，是指在色谱分离过程中由动力学因素（如操作参数）所决定的分离效能。
它反映了样品通过色谱柱后其区域宽度增加了多少，与样品在两相中的扩散和传质情况有关。
柱效率通常以理论塔板数、有效塔板数、理论塔板高度或有效塔板高度来表示。
理论塔板数（n）越大，理论塔板高度（H）越小，柱效率越高。
影响柱效率的因素有很多，其中载气流速的选择是一个重要的因素。
载气流速慢有利于传质和组分的分离，但会使分析时间延长；而载气流速快则有利于加快分析速度，减少分子扩散，但可能会降低分离度。
因此，选择合适的载气流速对于提高柱效率至关重要。
此外，进样技术、色谱柱的性能和操作条件等因素也会对柱效率产生影响。
例如，采用注射器或六通阀门进样时，需要考虑进样量、进样速度和进样方式等因素，以确保样品能够均匀、快速地进入色谱柱。
同时，色谱柱的材质、长度、内径、固定相的种类和粒度等因素也会对柱效率产生影响。
为了提高柱效率，可以从以下几个方面入手：降低移动相的流速、减少固定相的量、减小固定相的颗粒度、选用低粘度的移动相、适当
提高柱温以及尽量减小停滞移动相的体积等。
然而，需要注意的是，在色谱分析过程中，各种因素是相互联系和制约的，因此需要通过实验和研究来找到最佳的工作条件。
总之，柱效率是色谱分离过程中一个重要的性能指标，它受到多种因素的影响。
为了提高柱效率，需要综合考虑各种因素，并通过实验和研究来找到最佳的操作条件。
液相增加柱效、提高灵敏度的小诀窍
流动相对色谱的影响(TE40) 色谱柱技术 –流动相对色谱的影响 流动相对色谱的影响
液相色谱柱: 液相色谱柱 ZORBAX Eclipse XDB-C8 色谱柱尺寸: 色谱柱尺寸 4.6 x 50 mm 3.5µm
0.025 M H3PO4
流动相: 流动相 A: 含相应的酸的水相 B: 含相应的酸的乙腈 0%-30% B（30 min.内） （ 内 进样量: 进样量 6µL肽标样 肽标样 UV: 254 nm 流速: 流速 1 mL/min 40°C ° 改变有机添加剂 可增加柱效 （提高灵敏度） 提高灵敏度）
温度: 温度 检测器: 检测器 样品: 样品
减小柱径，可增 减小柱径， 加柱效（ 加柱效（提高灵 敏度） 敏度）
色谱柱技术 – 5988-6454EN 使用小体积色谱柱对于检测器 响应时间的重要性 (TE32)
液相色谱柱: 液相色谱柱 ZORBAX StableBond-C18 色谱柱尺寸: 色谱柱尺寸 4.6 x 15 mm 3.5µm
色谱柱技术 – 5988-6468EN 有机改性剂和pH对于选择性的影响 有机改性剂和 对于选择性的影响 (TE5)
液相色谱柱: 液相色谱柱 ZORBAX StableBond-CN 色谱柱尺寸: 色谱柱尺寸 4.6 x 150 mm 5µm
甲氧基苯胺 间位苯甲胺 4-氯-苯胺 3-氨基苯甲腈 3-氯-苯胺 2-氯胺 改变有机相%， 改变有机相 ， 可增加柱效 提高灵敏度） （提高灵敏度）
提高柱温， 提高柱温， 可增加柱效 提高灵敏度） （提高灵敏度）
生物制药 减小毛细管内径来提高 低浓度样品的检测灵敏度 Reducing Capillary ID to Improve Sensitivity for Concentration-Limited Samples
高效液相色谱习题及答案 (2)
高效液相色谱法习题一、思考题1．从分离原理、仪器构造及应用范围上简要比较气相色谱及液相色谱的异同点。
2．液相色谱中影响色谱峰展宽的因素有哪些与气相色谱相比较, 有哪些主要不同之处 3．在液相色谱中, 提高柱效的途径有哪些其中最有效的途径是什么4．液相色谱有几种类型 5．液-液分配色谱的保留机理是什么？这种类型的色谱在分析应用中，最适宜分离的物质是什么？6．液-固分配色谱的保留机理是什么？这种类型的色谱在分析应用中，最适宜分离的物质是什么？7．化学键合色谱的保留机理是什么？这种类型的色谱在分析应用中，最适宜分离的物质是什么？8．离子交换色谱的保留机理是什么？这种类型的色谱在分析应用中，最适宜分离的物质是什么？9．离子对色谱的保留机理是什么这种类型的色谱在分析应用中,最适宜分离的物质是什么10．空间排阻色谱的保留机理是什么？这种类型的色谱在分析应用中，最适宜分离的物质是什么？11．在液-液分配色谱中，为什么可分为正相色谱及反相色谱？12．何谓化学键合固定相？它有什么突出的优点？13．何谓化学抑制型离子色谱及非抑制型离子色谱？试述它们的基本原理14．何谓梯度洗提？它与气相色谱中的程序升温有何异同之处？15．高效液相色谱进样技术与气相色谱进样技术有和不同之处？16．以液相色谱进行制备有什么优点？二、选择题1．液相色谱适宜的分析对象是（）。
A 低沸点小分子有机化合物B 高沸点大分子有机化合物C 所有有机化合物D 所有化合物2．HPLC与GC的比较，可忽略纵向扩散项，这主要是因为（）。
A 柱前压力高B 流速比GC的快C 流动相粘度较大D 柱温低3．组分在固定相中的质量为MA(g)，在流动相中的质量为MB（g），而该组分在固定相中的浓度为CA（g·mL－1），在流动相中浓度为CB（g·mL－1），则此组分的分配系数是( )。
A mA/mB B mB/mAC CB/CAD CA/CB。
4．液相色谱定量分析时，不要求混合物中每一个组分都出峰的是＿。
液相色谱实验柱效测定
高效液相色谱测定色谱柱的柱效
实验目的：了解高效液相色谱仪的构造及操作
掌握液相色谱柱校和分离度的测定方法
实验原理：柱效常以理论塔板数n或理论塔板高度H表示用来说明柱子性能好坏，理论塔板数越高，柱效越好，分离出的组份峰又尖又高。
色谱柱的理论塔板数按计算公式：n= 16/(t R/ Y )2=5.54 [t R/( Y h/2)]2
实验原理：1.溶液的配制
配制20ppm萘和50ppm苯的混合液
2.实验条件的选择
(1) 反相色谱柱
(2) 流动相甲醇：水（90：10），流量1.0mL·min-1
(3) 监测器紫外光度监测器，254nm
(4) 进样量20uL
(5) 柱温30℃
3．测定
(1) 将配制好的流动相甲醇水溶液脱气15min。
(2) 根据实验条件，将高效液相色谱仪按照操作步骤调节至进样状态，待仪器液路和电
路系统达到平衡时，记录仪基线呈平直，即可进样。
数据处理：根据色谱图计算分离度和理论塔板数。
问题讨论。
液相色谱柱柱效的提高和测算
液相⾊谱柱柱效的提⾼和测算液相⾊谱柱柱效的提⾼和测算叶农摘要本⽂通过对如何提⾼液相⾊谱柱柱效的阐述,介绍了⼏种国际上流⾏的测量和计算柱效值的⽅法。
关键词液相⾊谱柱谱峰扩宽柱效值理论塔板数⼀、提⾼液相⾊谱柱柱效的⽅法我们知道⾊谱峰的扩宽与移动相在热⼒学的分配过程、移动相和固定相中传质阻⼒所引起的不平衡有关,谱峰扩宽(⾮平衡)的程度是流速对传质速率的直接函数。
要提⾼液相⾊谱的效率可从以下⼏⽅⾯⼊⼿。
(1)降低移动相的流速,但会使分析时间延长。
(2)减少固定相的量,但⾊谱柱中样品的负载量也随之减⼩。
(3)减⼩固定相的颗粒度,但不能过分,过分后⾊谱柱的渗透率也会减⼩。
(4)选⽤低粘度的移动相,以利于快速传质,但却不利于多组份分析。
(5)适当提⾼柱温,可降低移动相的粘度,但柱效和分离度也随之降低。
(6)尽量减⼩停滞移动相的体积,但却加快了移动相的流速。
从以上介绍可看出,在⾊谱分析过程中,各种因素是互相联系和制约的。
只有通过对柱效值的跟踪测算,对⾃⼰分析⽅法不断的研究和实践,才能找到最佳的⼯作条件。
⼆、对柱效值进⾏跟踪测算应注意的问题我们也应记住柱效值即塔板数只表⽰该⾊谱柱装填的好坏,只⽤柱效值并不⾜以预测在所有条件下的柱性能,因为在这些条件下,柱性能主要表⽰动⼒学过程对⾊谱柱谱带加宽的量。
其他⼀些影响峰宽的因素,如柱外效应和热⼒学因素(通常表现为峰拖尾),在理想情况下对于确定柱效值并不起重要作⽤。
因为任何⼀个柱性能的定义都必然与⽤此⾊谱柱所做的分离相联系,所以依据⼀个单独的数字来评定柱性能是不切实际的。
对⼤多数⾊谱⼯作者来说,柱性能指的是⾊谱柱⽤于特定分离的能⼒,⽽仅仅有⾼柱效并不能保证这种分离能⼒。
不管⽤什么特定的测试⽅法,都会有⼏个参数影响柱效的测定。
这些参数包括:洗脱液的成分和粘度及其线流速,测定塔板数所⽤的溶质,温度,柱长,填料装填⽅式,颗粒度,还有所选⽤的测量和计算⽅法。
尽管⼤多数柱效测算没有设法消除液相⾊谱仪器系统各部件对表观峰宽的影响,但只要仪器是正常使⽤的,这些影响是次要的。
液相色谱法及质谱分析练习题带答案
液相色谱法及质谱分析练习题带答案一、单选题1、高压、高效、高速是现代液相色谱的特点，下列哪一个不是采用高压的原因（）。
A、可加快流速，缩短分析时间B、高压可使分离效率显著提高C、采用了细粒度固定相所致D、采用了填充毛细管柱正确答案： D2、吸附作用在下面哪种色谱方法中起主要作用。
（）A、液一液色谱法B、液一固色谱法C、键合相色谱法D、离子交换色谱法正确答案： B3、在液相色谱中，常用作固定相又可用作键合相基体的物质是（）。
A、分子筛B、硅胶C、氧化铝D、活性炭正确答案： B4、水在下述色谱中，洗脱能力最弱（作为底剂）的是（）。
A、正相色谱法B、反相色谱法C、吸附色谱法D、空间排阻色谱法正确答案： B5、在液相色谱中，提高色谱柱柱效的最有效途径是（）。
A、减小填料粒度B、适当升高柱温C、降低流动相的流速D、增大流动相的流速正确答案： A6、液相色谱中不影响色谱峰扩展的因素是（）。
A、涡流扩散项B、分子扩散项C、传质扩散项D、柱压效应正确答案： B7、高效液相色谱仪与气相色谱仪比较增加了（）A、恒温箱B、进样装置C、程序升温D、梯度淋洗装置正确答案： D二、判断题1、高效液相色谱适用于大分子，热不稳定及生物试样的分析。
正确答案：正确2、反相分配色谱适于非极性化合物的分离。
正确答案：正确3、液相色谱的流动相又称为淋洗液，改变淋洗液的组成、极性可显著改变组分分离效果。
正确答案：正确4、高效液相色谱法采用梯度洗脱，是为了改变被测组分的保留值，提高分离度。
正确答案：正确5、高压输液泵是高效液相色谱仪的关键部件之一，按其工作原理分为恒流泵和恒压泵。
正确答案：正确6、高效液相色谱柱柱效高，凡是能用液相色谱分析的样品不用气相色谱法分析。
正确答案：错误。
高效液相色谱法的计算方法
高效液相色谱法的计算方法高效液相色谱法是用高压输液泵将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，经进样阀注入供试品，由流动相带入柱内，在柱内各成分被分离后，依次进入检测器，色谱信号由记录仪或积分仪记录。
1、对仪器的一般要求所用的仪器为高效液相色谱仪。
色谱柱的填料和流动相的组分应按各品种项下的规定。
常用的色谱柱填料有硅胶和化学键合硅胶。
后者以十八烷基硅烷键合硅胶最为常用，辛基键合硅胶次之，氰基或氨基键合硅胶也有使用；离子交换填料，用于离子交换色谱；凝胶或玻璃微球等，用于分子排阻色谱等。
注样量一般为数微升。
除另有规定外，柱温为室温，检测器为紫外吸收检测器。
在用紫外吸收检测器时，所用流动相应符合紫外分光光度法（附录ⅣA）项下对溶剂的要求。
正文中各品种项下规定的条件除固定相种类、流动相组分、检测器类型不得任意改变外，其余如色谱柱内径、长度、固定相牌号、载体粒度、流动相流速、混合流动相各组分的比例、柱温、进样量、检测器的灵敏度等，均可适当改变，以适应具体品种并达到系统适用性试验的要求。
一般色谱图约于20分钟内记录完毕。
2、系统适用性试验按各品种项下要求对仪器进行适用性试验，即用规定的对照品对仪器进行试验和调整，应达到规定的要求；或规定分析状态下色谱柱的最小理论板数、分离度和拖尾因子。
(1) 色谱柱的理论板数(N，用于定量表示色谱柱的分离效率，简称柱效)。
在选定的条件下，注入供试品溶液或各品种项下规定的内标物质溶液，记录色谱图，量出供试品主成分或内标物质峰的保留时间t R（以分钟或长度计，下同，但应取相同单位）和半高峰宽(W h/2)，按n＝5.54(t R/W h/2)2计算色谱柱的理论板数，如果测得理论板数低于各品种项下规定的最小理论板数，应改变色谱柱的某些条件（如柱长、载体性能、色谱柱充填的优劣等），使理论板数达到要求。
(2) 分离度(R)定量分析时，为便于准确测量，要求定量峰与其他峰或内标峰之间有较好的分离度。
高效液相色谱柱效能的测定
1.检测器：紫外光度检测器，测试波长254nm 2.流动相：甲醇：水(83：17)，流量0.8 ml/min 3.色谱柱：长250mm，内径4.6mm，装填C-18烷基键合
相(粒度5μm) 4.进样量：20 μL
五、实验步骤：
1. 根据实验条件，将仪器调至可进样状态，待基线平 稳后，即可进样。 2. 吸取标准使用液（含甲苯、萘、联苯各10ug/ml的 正己烷溶液）20μL，注入高效液相色谱仪。 3. 记录下色谱图。 4. 从色谱图中测得甲苯、萘、联苯的保留时间tR，半 峰宽Y1/2，计算对应的理论塔板数n及分离度R。
敏度10-11g。
二、 高效液相色谱法主要类型及分离原理
根据分离原理，高效液相色谱法分为： 液-液色谱及化学键合相法 液-固色谱法 离子对色谱法 离子交换色谱法 空间排阻色谱法
反相键合相色谱法
固定相：极性较小的键合固定相，如硅胶一C18H37、 硅胶一苯基等；
流动相：极性较强的溶剂，如甲醇、乙睛、水和无机 盐的缓冲溶液等。
高效液相色谱图：
数据处理：
甲苯
萘
tR /min
Y1/2 /min
n/
块·m-1
R
n 5.54( tR )2
Y1/ 2
R
tR2 tR1
2 2.35
(Y1/ 2(1)
Y1/
2(2)
)
联苯
天美LC2130 HPLC操作规程
一、开机准备 1.实验室温度应保持在25～30℃之间，湿度小于65%。 2. 根据实验要求，选择合适的色谱柱并安装，准备相
标，混合物能否在色谱柱中得到分离，除取决于选择 合适的固定相外，还与色谱操作条件及色谱柱的装填 状况等因素有关。
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液相色谱柱柱效的提高和测算
叶农
摘要本文通过对如何提高液相色谱柱柱效的阐述,介绍了几种国际上流行的测量和计算柱效值的方法。
关键词液相色谱柱谱峰扩宽柱效值理论塔板数
一、提高液相色谱柱柱效的方法
我们知道色谱峰的扩宽与移动相在热力学的分配过程、移动相和固定相中传质阻力所引起的不平衡有关,谱峰扩宽(非平衡)的程度是流速对传质速率的直接函数。
要提高液相色谱的效率可从以下几方面入手。
(1)降低移动相的流速,但会使分析时间延长。
(2)减少固定相的量,但色谱柱中样品的负载量也随之减小。
(3)减小固定相的颗粒度,但不能过分,过分后色谱柱的渗透率也会减小。
(4)选用低粘度的移动相,以利于快速传质,但却不利于多组份分析。
(5)适当提高柱温,可降低移动相的粘度,但柱效和分离度也随之降低。
(6)尽量减小停滞移动相的体积,但却加快了移动相的流速。
从以上介绍可看出,在色谱分析过程中,各种因素是互相联系和制约的。
只有通过对柱效值的跟踪测算,对自己分析方法不断的研究和实践,才能找到最佳的工作条件。
二、对柱效值进行跟踪测算应注意的问题
我们也应记住柱效值即塔板数只表示该色谱柱装填的好坏,只用柱效值并不足以预测在所有条件下的柱性能,因为在这些条件下,柱性能主要表示动力学过程对色谱柱谱带加宽的量。
其他一些影响峰宽的因素,如柱外效应和热力学因素(通常表现为峰拖尾),在理想情况下对于确定柱效值并不起重要作用。
因为任何一个柱性能的定义都必然与用此色谱柱所做的分离相联系,所以依据一个单独的数字来评定柱性能是不切实际的。
对大多数色谱工作者来说,柱性能指的是色谱柱用于特定分离的能力,而仅仅有高柱效并不能保证这种分离能力。
不管用什么特定的测试方法,都会有几个参数影响柱效的测定。
这些参数包括:洗脱液的成分
和粘度及其线流速,测定塔板数所用的溶质,温度,柱长,填料装填方式,颗粒度,还有所选用的测量和计算方法。
尽管大多数柱效测算没有设法消除液相色谱仪器系统各部件对表观峰宽的影响,但只要仪器是正常使用的,这些影响是次要的。
而测量和计算方法对柱效值的确定起着极大的作用。
三、几种测量和计算柱效值的方法
因为色谱峰是假定样品浓度在移动相和固定相中呈正态分布而得到的样品谱带分布,故常常把色谱峰型看作正态曲线来计算理论塔板数。
因此计算柱效(以理论塔板数n为单位)的公式
习惯上定义为:
式中tR为色谱峰的保留时间; σ2是以时间为单位测量色谱峰的偏差;a是和峰高(从测峰宽的基线量起)有关的常数, ωb是峰宽,表示由色谱峰顶点与色谱峰两侧拐点处做切线与峰底基线相交两点间的距离。
图1所示为正态峰轮廓所测量峰宽处的峰高与7种可能的测定n 的方法所对应的常数a值之间的关系。
拐点法(Inflectionmethod):在拐点处峰宽等于标准偏差的2倍,该法对不对称色谱峰最不敏感。
半峰宽法(Widthathalfpeak):该法最常用,计算者的主观误差降到最小,有很好的重复性。
切线法(Tangentmethod):由于切线是人为确定的,色谱峰的对称性对该法的偏差起决定作用。
3σ,4σ和5σ法:这些方法对色谱峰非对称性的灵敏度随上述顺序增加,测量位置越接近于峰底,其结果受拖尾或前延的影响越大。
5σ法对于确定基线的准确性也很灵敏。
峰高/峰面积法(Height/areamethod):该法可通过积分仪或计算机直接计算出n值。
n=2π(ht R)2/A2,h为峰高,A为峰面积。
量矩法(Momentmethod):此法避免了假设特定的峰型,如果有合适的,正确的程序计算设备,它能够最精确地表示理论塔板数。
非对称法(Asymmetry-basedmethod):从峰顶向基线画一垂线,在峰高10%处测得垂线两边峰宽A,B的长度,并计算其比率。
由于便于测量,该法最能反映色谱峰的非对称性。
在新的国家液相色谱仪检定规程(征求意见稿)中,也增加了对色谱柱柱性能的测试,采用的方法是半峰宽法和非对称法。
四、结论
假如一个色谱峰真是正态峰型,那么每种计算方法都会得到同样的结果。
然而即使一些比较理想的仪器和倾向于得到对称峰型的溶质,由于柱内的槽或空隙,也会出现非正态峰型。
所以不同的计算方法将会得到相差较大的n值。
通常偏离正态模型的峰型表示为“前延”或“拖尾”。
对于这些峰型,越在峰的高处测量,计算的理论塔板数值就越大(准确性越低)。
在许多情况下,色谱工作者需要能反映整个峰型(包括拖尾)的柱效值,同时为了保证定量的重复性,也需要色谱峰很好的对称性。
这时对色谱峰非对称性最敏感的计算方法最适合。
如果目的
仅仅是要监测色谱柱从第一次使用到使用寿命结束这一过程中的柱效,那么以上任何一种方法都可以,应选择最简便的方法。