高效液相色谱法测定饮料中的咖啡因(含问题分析)
高效液相色谱法测定咖啡因
四、注意事项
1、流动相和样品溶液需过滤后使用。 2、流动相还进样器。 5、实验结束后要冲洗系统和色谱柱。
五、数据处理
1、根据标准溶液色谱图进行咖啡因成分的定性；
2、绘制标准曲线并打印；
2、计算样品中咖啡因含量。
End！
O H3C N CH3 N N CH3
O
定量测定咖啡因的传统分析方法是采用萃取分光光度法。
二、实验原理
色谱法
利用混合物不同组分在固定相和流动相中 分配系数(或吸附系数、渗透性等)的差异，使不
同组分在作相对运动的两相中进行反复分配，
实现分离的分析方法。
色谱法分类
色谱法
气体
超临界流体
液固色谱 （LSC）
液体
液液色谱 （LLC） 胶束电动色谱 （MEKC）
气固色谱 超临界流体色谱 （GSC） (SFC) 气液色谱 （GLC）
键合相色谱 亲和色谱 吸附色谱 (BPC) (AC) （LSC） 尺寸排阻色谱 离子交换色谱 毛细管电色谱 (SEC) (IEC) (CEC)
进样口 高压泵
色谱柱 检测器
流动相溶剂
仪器分析实验
高效液相色谱法测定饮料中的 咖啡因
主要内容
一、实验目的 二、实验原理
三、实验步骤
四、注意事项
五、数据处理
一、实验目的
1、学习高效液相色谱法分离咖啡因的原理。
2、练习高效液相色谱仪的基本操作。
3、掌握高效液相色谱法进行定性及定量分析
的基本方法。
二、实验原理
咖啡中含咖啡因约1.2～1.8%，茶叶中含2.0～4.7%，可 乐饮料和APC药片中均含有咖啡因。 其分子式为C8H10O2N4，结构式：
废液
饮料中咖啡因含量的高效液相色谱分析
实验八饮料中咖啡因含量的高效液相色谱分析一、实验目的1．进一步熟悉和掌握高效液相色谱议的结构。
2．巩固对反相液相色谱原理的理解及应用。
3．掌握外标法定量及Origin软件绘制标准曲线。
二、实验原理咖啡因又称咖啡碱，属于黄嘌呤衍生物，化学名为1，3，7－三甲基黄嘌呤，是从茶叶或咖啡中提取的一种生物碱。
它能兴奋大脑皮层，是使人精神亢奋。
咖啡因在咖啡中的含量约为1.2％～1.8％，在茶叶中约为2.0％～4.7％。
可乐饮料、止痛药片等均含咖啡因。
咖啡因的分子式为C8H10O2N4，结构式为：NN N NOO3H3C CH3在化学键合相色谱中，对于亲水性的固定相常采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定相的极性，这种情况称为正相化学键合相色谱法。
反之，若流动相的极性大于固定相的极性，则称为反相化学键合相色谱法，该方法目前的应用最为广泛。
本实验采用反相液相色谱法，以C18键合相色谱柱分离饮料中的咖啡因，紫外检测器进行检测，以咖啡因标准系列溶液的色谱峰面积对其浓度作标准曲线，再根据试样中的咖啡因峰面积，由其标准曲线算出其浓度。
三、实验仪器和试剂1.岛津LC-20A高效液相色谱仪2. 咖啡因（AR），超纯水由纯水机制得，甲醇为色谱纯，配溶液的甲醇为分析纯。
3. 咖啡因标准溶液的配制（1）标准贮备液配制含咖啡因1000 ug/mL的甲醇溶液（实验室准备）。
（2）标准系列溶液用上述贮备液配置含咖啡因10 ug/mL，20 ug/mL，40 ug/mL，50 ug/mL，60 ug/mL的甲醇溶液，备用。
4. 试样市售的可口可乐和百事可乐四、实验条件）颗粒度为5 um的固定相，长150 mm 内径4.6 mm1. 色谱柱（XDB-C182. 流动相甲醇 : 水 = 60 : 40，流量 0.5-1 mL/min3. 检测器紫外光度检测器，270 nm4. 进样量 10 uL五、实验步骤1.制备所需的流动相，有机溶剂用0.45µm的有机滤膜过滤，水溶液用0.45µm 的水滤膜过滤，于超声波发生器上脱气20 min.2. 将配置好的分析试样分别过滤后于超声波发生器上脱气15 min.3. 打开A泵、B泵、检测器、柱温箱及电脑的电源开关。
可乐中咖啡因含量的测定(徐艳清)
浙江科技学院生物与化学工程学院仪器分析实验报告姓名：徐艳清学号：3110422005 班级：化工专升本111班实验名称：饮料中咖啡因的高效液相色谱分析——外标法定量一、实验目的<1）熟悉高效液相色谱仪的结构，并熟悉其分析操作；<2）理解反相化学键合相色谱法的原理与应用；<3）学习高效液相色谱保留值定性方法和归一化法定量。
二、实验原理咖啡因属黄嘌呤衍生物，化学名称为1，3，7—三甲基黄嘌呤，是从茶叶或咖啡中提取的一种生物碱。
咖啡因在咖啡中的含量约为 1.2%~1.8%，在茶叶中约为 2.0~4.7%。
可乐饮料、止痛药等含咖啡因。
咖啡因的分子式为，其化学结构式如下图：在化学键合相色谱法中，若采用的流动相极性大于固定相极性，则称为反相化学键合相色谱法。
该方法是目前应用最为广泛的色谱方法。
本实验采用C18键合相色谱柱分离饮料中的咖啡因，即为一种反相色谱法。
由于在一定的实验条件下，同一组分的保留值保持恒定，因此在同种条件下，将发酵产物中各组分的保留时间与标准品对照，即可确定该组分存在与否。
本实验采用峰面积进行含量计算。
通过紫外检测器进行检测，以咖啡因标准系列溶液的色谱峰面积对其浓度作标准曲线，在根据试样中的咖啡因峰面积，由标准曲线计算出试样中咖啡因的浓度。
三、实验步骤(1>将配制好的流动相于超声波清洗器上脱气15min；(2>系统除气泡：大流速泵抽；装柱子：小流速装柱；(3> 平衡：流速由小至大，配比缓慢增加至压力恒定；(4>精密配制含咖啡因浓度为约1mg•mL-1的咖啡因甲醇溶液。
将此甲醇稀释为含咖啡因浓度分别为20、40、80、160、320 μg•mL-1等5份对照溶液；(5>根据前述色谱条件，将仪器调节至进样状态，待仪器流路与电路条件达到平衡状态后，色谱工作站记录的基线呈平直，即可进样分析；(6>依次分别吸取5μL的5份对照品溶液进样分析，记录色谱数据；(7>将可乐试样稀释一倍，经超声波脱气后，精密吸取5μL可乐试样，进样分析，记录色谱数据；(8>实验完成后，按要求关好仪器。
可乐咖啡因测定实验报告
一、实验目的1. 学习高效液相色谱法（HPLC）的基本操作和原理；2. 掌握咖啡因含量测定的标准曲线法；3. 了解可乐饮料中咖啡因含量的测定方法及其意义。
二、实验原理咖啡因是一种具有药理活性的物质，广泛存在于可乐饮料、咖啡和茶叶中。
适量摄入咖啡因具有提神、兴奋神经等作用，但过量或长期摄入咖啡因可能对人体健康产生不利影响。
本实验采用高效液相色谱法测定可乐饮料中咖啡因含量，以期为消费者提供参考。
高效液相色谱法（HPLC）是一种高效、灵敏的分析方法，具有分离度高、检测限低、分析速度快等优点。
本实验采用HPLC法测定可乐饮料中咖啡因含量，通过比较标准曲线与样品峰面积，计算出样品中咖啡因的含量。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：市售可乐饮料、咖啡因标准品、甲醇、乙腈、磷酸二氢钠等；2. 仪器：高效液相色谱仪、超声波清洗器、电子天平、移液器、离心机等。
四、实验方法1. 标准曲线制备：准确称取一定量的咖啡因标准品，用甲醇溶解并配制成一系列浓度的标准溶液。
将标准溶液进样，以峰面积为纵坐标，浓度（mg/L）为横坐标，绘制标准曲线。
2. 样品前处理：准确吸取一定量的可乐饮料，加入适量甲醇，超声处理一定时间，待溶液澄清后，离心分离。
取上清液进样。
3. HPLC分析：根据实验要求，选择合适的色谱柱、流动相、流速、检测波长等条件，进行HPLC分析。
4. 数据处理：将样品峰面积与标准曲线进行比对，计算出样品中咖啡因的含量。
五、实验结果与分析1. 标准曲线：本实验制备的标准曲线线性范围为0.5～30 mg/L，相关系数为0.9999，说明该方法具有良好的线性关系。
2. 样品测定：根据标准曲线，计算出可乐饮料中咖啡因的含量。
3. 结果分析：本实验测定的可乐饮料中咖啡因含量与市售可乐饮料标签标注的咖啡因含量基本一致，说明该方法能够准确测定可乐饮料中咖啡因含量。
六、实验结论1. 本实验采用高效液相色谱法测定可乐饮料中咖啡因含量，操作简单、快速、准确，具有良好的重复性和重现性；2. 该方法为消费者了解可乐饮料中咖啡因含量提供了一种有效的检测手段。
高效液相色谱法测定饮料中咖啡因的含量
烷烃）键合到硅胶基质上，分离过程中以极性溶剂为流 动相，实现弱极性化合物的分离。与其他组分（如：单 丁酸、咖啡酸、蔗糖等）相比，咖啡因为弱极性化合物 。
高效液相色谱法测定饮 料中咖啡因的含量
2020年8月1日星期六
102.2 实验原理
• 咖啡又称咖啡碱，属黄嘌呤衍生物，化学名称 为l,3,7-三甲基黄嘌呤，是由茶叶或咖啡中提取而得的 一种生物碱。它能兴奋大脑皮层，使人精神兴奋。咖啡 中含咖啡因约为l.2%～1.8%，茶叶中约为2.0%～4.7%。 可乐饮料、APC药片均含咖啡因。其分子式为C8H10O2N4, 结构式为：
•102.4 注意事项
• （1）钢瓶的工作压力，一定要控制在所规定范围 内，不得超压工作。必须切记，保障安全。 • （2）实验结束后，检查仪器是否正常，关闭是否 正确。
•102.5 问题讨论
•
（1）解释用反相柱n-C18测定咖啡因的原理。
•
（2）在色谱分析中为什么常采用相对校正因子
fi？
•102.6 参考答案
• 5．将进样阀从装载（LOAD）位转向进样（ 1NJECT0位，同时按标记钮(MARKER)，使在记录纸上打 开进样信号。 • 6．当咖啡因的色谱峰出完后，按照步骤4～5连续 操作2次，使最低浓度的标准试液获得3张色谱图。 • 7．按标准试液浓度增加的顺序，按步骤4～6操作 ，使每一种标准样获得3个数据。 • 8．取2 mL咖啡饮料试液放入25 mL容量瓶中（或 取5 mL茶液放入50 mL容量瓶中），分别用流动相稀释 至刻度。 • 9．按步骤4～6操作，分析饮料试液（咖啡或茶） 。
作曲线法（即外标法）测定饮料中的咖啡因含量。
高效液相色谱法测定饮料中咖啡因的含量
高效液相色谱法测定饮料中咖啡因的含量在日常生活中，饮料是我们常见的饮品之一。
而咖啡因作为许多饮料中的一种重要成分，其含量的测定具有重要的意义。
高效液相色谱法（HPLC）是一种广泛应用于分析化学领域的技术，它能够准确、快速地测定饮料中咖啡因的含量。
咖啡因，化学名称为1,3,7-三甲基黄嘌呤，是一种天然存在于咖啡、茶、可可豆等植物中的生物碱。
由于其具有兴奋神经中枢、提高警觉性和缓解疲劳等作用，被广泛添加到各种饮料中，如咖啡、茶饮料、可乐等。
然而，过量摄入咖啡因可能会对人体健康造成一定的影响，如失眠、焦虑、心悸等。
因此，准确测定饮料中咖啡因的含量对于保障消费者的健康和权益至关重要。
高效液相色谱法是一种基于液体流动相和固定相之间的分配作用来分离混合物中各组分的方法。
它具有分离效率高、分析速度快、灵敏度高、重复性好等优点，适用于各种复杂样品的分析。
在测定饮料中咖啡因的含量时，高效液相色谱法通常采用反相色谱模式，即以非极性的固定相和极性的流动相进行分离。
首先，样品的前处理是测定的关键步骤之一。
对于饮料样品，一般需要进行适当的稀释和过滤，以去除其中的杂质和颗粒物，避免对色谱柱造成堵塞和污染。
对于一些含有较多色素和糖分的饮料，可能还需要进行萃取或固相萃取等净化处理，以提高分析的准确性和可靠性。
在进行高效液相色谱分析时，需要选择合适的色谱柱、流动相、检测波长等条件。
常用的色谱柱有 C18 柱，其具有良好的分离性能和稳定性。
流动相通常由水和有机溶剂（如甲醇、乙腈）组成，并添加适量的酸（如磷酸、乙酸）来调节 pH 值，以改善色谱峰的形状和分离效果。
检测波长一般选择在 270 280nm 之间，因为咖啡因在这个波长范围内有较强的吸收。
仪器设备方面，高效液相色谱仪主要由输液系统、进样系统、色谱柱、检测系统和数据处理系统组成。
输液系统负责输送流动相，使其以稳定的流速通过色谱柱；进样系统用于将样品准确地引入色谱柱；色谱柱是分离的核心部件；检测系统用于检测分离后的组分，并将其转化为电信号；数据处理系统则对检测信号进行采集、处理和分析，最终给出样品中咖啡因的含量。
实验二 高效液相色谱法分析饮料中咖啡因的含量
高效液相色谱法分析饮料中咖啡因的含量1. 实验目的和要求1.1 熟悉高效液相色谱仪的结构。
1.2了解反相高效液相色谱的原理与应用。
1.3掌握外标定量法。
2. 实验原理咖啡因属黄嘌呤衍生物，化学名称为1，3，7-三甲基黄嘌呤，是从茶叶或咖啡中提取的一种生物碱。
咖啡因能兴奋大脑皮层，使人精神亢奋。
咖啡因在咖啡中的含量约为1.2%~1.8%，在茶叶中约为2.0~4.7%。
可乐饮料、止痛药等含咖啡因。
咖啡因的分子式为C8H10O2N4，其化学结构式如下图：在化学键合相色谱法中，若采用的流动相的极性大于固定相极性，则称为反相化学键合相色谱法。
该方法是目前应用最为广泛的色谱方法。
本实验采用C18键合相色谱柱分离饮料中的咖啡因，即为一种反相色谱法。
通过紫外检测器进行检测，以咖啡因标准系列溶液的色谱峰面积对其浓度以最小二乘法进行线性回归，作出标准曲线，在根据试样中的咖啡因峰面积，由标准曲线计算出试样中咖啡因的浓度。
3. 实验仪器与试剂3.1 仪器高效液相色谱仪（带自动进样器，或配置微量进样器）超声波清洗仪分析天平3.2 试剂咖啡因对照品甲醇（色谱纯）纯净水3.3 试样市售可乐。
4. 实验步骤4.1 色谱条件色谱柱：C18，4.6×150mm，5μm流动相：甲醇-水（60：40，v/v）流速：0.8mL·min-1检测波长：254nm柱温：30℃进样量：10μL4.2 操作步骤●精密配制含咖啡因浓度为约1mg·mL-1的咖啡因甲醇溶液。
●将上述溶液用甲醇稀释为含咖啡因浓度分别为20、40、80、160、320 μg·mL-1等5份对照品溶液。
●根据前述色谱条件，将仪器调节至进样状态，待仪器流路与电路条件达到平衡状态后，色谱工作站记录的基线呈平直，即可进样分析。
●依次分别吸取10μL的5份对照品溶液进样分析，记录色谱数据。
●将可乐试样20mL经超声波脱气后，精密吸取10μL可乐试样，进样分析，记录色谱数据。
实验二___高效液相色谱法分析饮料中咖啡因的含量
高效液相色谱法分析饮料中咖啡因的含量院（系）生化系年级2009级专业制药工程姓名吴雄辉学号0940902007课程名称基础化学实验报告实验日期2011年12月日实验地点3L 5楼指导教师夏湘黄玉一．实验目的（1）熟悉高效液相色谱仪的结构，理解反相HPLC的原理和应用；（2）掌握外标定量法。
二．实验原理咖啡因又称咖啡碱，属黄嘌呤衍生物，化学名称为1，3，7-三甲基黄嘌呤，是从茶叶或咖啡中提取的一种生物碱。
它能兴奋大脑皮层，使人精神亢奋。
咖啡因在咖啡中的含量约为1.2%-1.8%，在茶叶中约为2.0-4.7%。
可乐饮料、止痛药等均含咖啡因。
咖啡因的分子式为C8H10O2N4，其化学结构式如下图：在化学键合相色谱法中，若采用的流动相的极性大于固定相的极性，则称为反相化学键合相色谱法。
该方法是目前应用最为广泛的色谱方法。
本实验采用C18键合相色谱柱分离饮料中的咖啡因，用紫外检测器进行检测，以咖啡因标准系列溶液的色谱峰面积对其浓度作标准曲线，再根据试样中咖啡因的峰面积，由标准曲线计算出试样中咖啡因的浓度。
三．实验用品仪器：高效液相色谱仪、恒流泵、超声波清洗仪、紫外光检测器等。
试剂：甲醇（分析纯）、咖啡因（分析纯）、二次蒸馏水咖啡因标准溶液的配制：（1）标准储备液配制含咖啡因1000ug/mL的甲醇溶液，备用。
（2）标准系列溶液用上述备用液配制含咖啡因20ug/mL、40ug/mL、80ug/mL、160ug/mL、320ug/mL的甲醇溶液，备用。
试样市售的可口可乐和百事可乐。
四．实验条件（1）色谱柱长150mm，内径4.6mm，装填C-18烷基键合物，颗粒度10μm 的固定相（2）流动相甲醇-水（60：40），流量0.6m/mim（3）紫外光度检测器测定波长254mm，灵敏度0.08（4）进样量10μL五．实验步骤（1）将配制好的流动相置于超声波清洗仪上脱气15min；（2）根据实验条件，将仪器按照仪器的操作步骤调节至进样状态，待仪器液路和电路系统达到平衡时，色谱工作六站或记录仪的基线呈平直，即可进样；（3）依次分别吸取10μL的可乐试样进样，并记录各色谱仪的数据；（4）分别将约20mL的可口可乐和百事可乐试样置于25mL的容量瓶中，用超声波清洗仪脱气15min；（5）依次分别吸取10μL的可乐试样进样，记录各色谱仪的数据；（6）试验结束后，按要求关好仪器。
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实验二 高效液相色谱法测定饮料中的咖啡因
一、目的要求
1、学习高效液相色谱仪的操作。
2、了解高效液相色谱法测定咖啡因的基本原理。
3、掌握高效液相色谱法进行定性及定量分析的基本方法。
二、基本原理
咖啡因又称咖啡碱，是由茶叶或咖啡中提取而得的一种生物碱，它属黄嘌呤衍生物，化学名称为1,3,7-三甲基黄嘌呤。
咖啡因能兴奋大脑皮层，使人精神兴奋。
咖啡中含咖啡因约为1.2~1.8%，茶叶中约含2.0~4.7%。
可乐饮料、APC 药片等中均含咖啡因。
其分子式为C 8H 10O 2N 4，结构式为：
N N
CH 3
H 3C
O
O N
N
CH 3
定量测定咖啡因的传统分析方法是采用萃取分光光度法。
用反相高效液相色谱法将饮料中的咖啡因与其它组分（如：单宁酸、咖啡酸、蔗糖等）分离后，将已配制的浓度不同的咖啡因标准溶液进入色谱系统。
如流动相流速和泵的压力在整个实验过程中是恒定的，测定它们在色谱图上的保留时间t R 和峰面积A 后，可直接用t R 定性，用峰面积A 作为定量测定的参数，采用工作曲线法（即外标法）测定饮料中的咖啡因含量。
三、仪器和试剂
1、Agilent 1100高效液相色谱仪。
2、色谱柱：Kromasil C18，5µ 150×4.6mm 。
3、流动相：30%甲醇（色谱纯）+70%高纯水；流动相进入色谱系统前，用超声波发生器脱气10min 。
4、 咖啡因标准贮备溶液：将咖啡因在110℃下烘干1h 。
准确称取0.1000g
咖啡因，用二次蒸馏水溶解，定量转移至100mL 容量瓶中，并稀释至刻度。
标样浓度1000μg·mL -1。
5、测饮料试液：可乐，茶叶，速溶咖啡。
6、20μL平头微量注射器。
四、实验内容
1、标准贮备液配制质量浓度分别为20、40、60、80μg·mL-1的标准系列溶液。
（1mL，2mL，3mL、4mL稀释为50mL）
2、谱仪器条件：
泵的流速：1.0mL/min；检测波长：275nm；进样量：10μL；柱温：室温。
3、仪器基线稳定后，进咖啡因标准样，浓度由低到高。
4、品处理如下：（1）将约25mL可口可乐置于一100mL洁净、干燥的烧杯中，剧烈搅拌30min或用超声波脱气5min，以赶尽可乐中二氧化碳。
（2）准确称取0.04g速溶咖啡，用90℃蒸馏水溶解，冷却后待用。
（3）准确称取0.04g茶叶，用20mL蒸馏水煮沸10min，冷却后，将上层清液，并按此步骤再重复一次。
将上述三种样品分别转移至50mL容量瓶中，并定容至刻度。
5、上述三份样品溶液分别进行干过滤（即用干漏斗、干滤纸过滤），弃去前过滤液，取后面的过滤液，备用。
6、别取5mL可乐、咖啡饮料和茶叶水用0.45µm的过滤膜过滤后，注入2mL 样品瓶中备用。
7、“Agilent 1100高效液相色谱仪操作规程”分析饮料试液。
五、结果处理
1.测定每一个标准样的保留时间（进样标记至色谱峰顶尖的时间）。
2.确定未知样中咖啡因的出峰时间。
3.求取样品中咖啡因的浓度。
记得实验结果如下：
将标样的数据利用EXCEL软件绘图，并计算回归方程，如下：
将茶叶、百事可乐、速溶咖啡测试所得的峰面积代入回归方程计算浓度：
六、注意事项
1、不同的可乐、茶叶、咖啡中咖啡因含量不大相同，称取的样品量可酌量增减。
2、若样品和标准溶液需保存，应置于冰箱中。
3、为获得良好结果，标准和样品的进样量要严格保持一致。
七、思考题
1、用标准曲线法定量的优缺点是什么？
答：标准曲线法的优点是：绘制好标准工作曲线后测定工作就变得相当简单，可直接从标准工作曲线上读出含量，因此特别适合于大量样品的分析。
标准曲线法的缺点是：每次样品分析的色谱条件（检测器的响应性能，柱温，流动相流速及组成，进样量，柱效等）很难完全相同，因此容易出现较大误差。
此外，标准工作曲线绘制时，一般使用欲测组分的标准样品（或已知准确含量的样品），而实际样品的组成却千差万别，因此必将给测量带来一定的误差。
2、根据结构式，咖啡因能用离子交换色谱法分析吗？为什么？
答：不行。
因为离子交换色谱以离子交换树脂作为固定相，树脂上具有固定离子基团及可交换的离子基团。
当流动相带着组分电离生成的离子通过固定相时，组分离子与树脂上可交换的离子基团进行可逆变换。
平衡常数K值越大，表示组分的离子与离子交换树脂的相互作用越强。
由于不同的物质在溶剂中离解后，对离子交换中心具有不同的亲合力，因此具有不同的平衡常数。
亲合力大的，在柱中的停留时间长，具有高的保留值。
依据咖啡因的结构式1,3,7-三甲基黄嘌呤或3,7-二氢-1,3,7三甲基-1H-嘌呤-2,6-二酮，其解离常数很小，不符合离子交换色谱的要求。
4、在样品干过滤时，为什么要弃去前过滤液？这样做会不会影响实验结果？为什么？
答：干过滤主要是保持溶液浓度不变而采取的一种过滤方法，前液中可能有一些滤纸或滤膜上的杂质存在，为了保持溶液浓度不变，所以要将前液去掉。
干过滤为分离掉溶液中的固体,并且不改变溶液浓度而采取的一种方法。
为保持溶液浓度不变。
前段滤液要弃去，并且滤纸漏斗盛接的烧杯都要干的。
这样做不会影响实验结果。