酪蛋白磷酸肽CPPs的制备
酪蛋白磷酸肽的结构特性及营养功能研究进展
酪蛋白磷酸肽的结构特性及营养功能研究进展>以植物性饲料为主的动物饲粮中含有大量的植酸、草酸等成分，在小肠下端pH7～8环境下易与钙结合生成难溶性沉淀，削减钙的汲取，导致各类动物缺钙的发生。
假如饲粮中钙的浓度过高，产蛋母鸡对其消化汲取（肯定与相对两者）降低。
协作饲料中添加过量钙不仅降低动物食欲，削减采食量，且过量钙可抑制微量元素（锌、锰、铁以及可能有铜）的汲取，并干扰磷的消化汲取［1］。
故导致动物钙缺乏的主要养分原因是汲取率低下，解决的主要途径是增加钙的汲取率，而不应盲目提高日粮中钙的含量。
增加钙的汲取率的关键在于增加肠道中离子态钙的数量，而来源于牛乳蛋白的酪蛋白磷酸肽(CaseinPhosphopeptides，CPPs)由于具有阻挡钙离子在肠道形成沉淀和促进钙及其它二价矿物离子汲取的功能而备受关注。
本文拟对酪蛋白磷酸肽(CPPs)的来源、分子结构、养分生理作用、作用机理及在动物养殖中的应用前景作一综述。
1酪蛋白磷酸肽(CPPs)的来源与结构酪蛋白占牛乳总蛋白的80％，含有αs1、αs2、β和к-酪蛋白四种主要成分，其比例为34：8：33：9，一级结构均已精确测定。
α和β酪蛋白含有高含量的磷酸丝氨酰残基，其中αs酪蛋白氨基酸残基数为199，含8个磷酸丝氨酰基，β-酪蛋白由209个氨基酸残基构成，含5个磷酸丝氨酰基。
Hiroshi等(1974)［2］用动物试验表明，酪蛋白可在动物肠道内形成CPPs并确定其结构为SerP-SerP-SerP-Glu-Ile-Pro-Asn。
Nicholas等(1974)［3］用胰蛋白酶水解酪蛋白，经过精制、纯化得到CPPs，其核心结构为：-SerP-SerP-SerP-Glu-Glu-。
CPPs结构中的磷酸丝氨酰残基(-Ser(P)-)成簇存在，在肠道pH弱碱性环境下带负电荷，可阻挡消化酶的进一步作用，使CPPs不会被进一步水解而在肠中稳定存在。
这些氨基酸的负电荷侧链，尤其是磷酸基团是矿物质结合的位点。
生物实验：酪蛋白磷酸肽制备
CPPs①安全性好。制取CPPs的原料是一种天然蛋 白质，且CPPs对畜禽健康毫无损害。②稳定性好。 CPPs在常温下稳定性好，防止钙沉淀，商品CPPs在5℃ 和25℃保存两年后，其功能指标仅下降1%和3%。③成 本低。CPPs在实际添加量非常小的情况下就能起到很有 效的促进作用，且其加工工艺日趋完善，生产成本也将 逐步降低。
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酪蛋白磷酸肽的生物活性表现为，在pH呈中性至微 碱性的动物小肠下端,能与Ca+2、Fe+2和Zn+2等金属离子 结合,阻止这些金属离子与磷酸根结合产生沉淀,使小肠内 可溶性的钙、铁和锌的浓度增加,从而促进这些必需金属 离子的吸收和利用。
酪蛋白磷酸肽的生产工艺技术
酪蛋白磷酸肽的生产工艺技术第一节：酪蛋白磷酸肽生产工艺尽管早在50年代，国外就开始了对CPP的研究，但工业化制备的研究工作直到近年才真正开始，而我国在这方面的研究开发也刚起步。
工业生产CPP以酪蛋白或牛乳为原料，所采用的蛋白质酶通常是胰蛋白酶，胰蛋白酶具有较强的专一性，水解使CPP游离，喷雾干燥后成为低纯度产品。
酪蛋白水解后呈现强烈的苦味，可用离子交换树脂脱除或用酶分解苦味成分。
对酪蛋的水解物采用络合分离、凝胶过滤或膜分离等高度特异性方法进行分离精制可获得高纯度CPP-Ⅲ，再用树脂或酶除去或分解其中的苦味成分。
…此处省略,详情请见六鉴网()《酪蛋白磷酸肽市场调研报告》第二节：酪蛋白磷酸肽生产技术研究与进展作为一种具有多种生理功能的活性多肽，CPP的酶法制备是近年来国内外研究的热点。
下面将对酶解过程中的几个关键问题——酶种的选择、水解方式、分离纯化方案、检测方法作一概述。
1、酶种的选择碱性蛋白酶为微生物源酶种，其水解度高，但操作条件苛刻，不利于工业化生产。
首先温度过高，必然增加生产能耗；其次pH值过高，会使反体体系出现多余的盐类。
但碱性蛋白酶切割位点研究较彻底，因此是一种研究酪蛋白水解特性的理想酶种。
胰蛋白酶和胰酶提取自动物胰脏。
其中胰蛋白酶的专一性强，只作用于由精氨酸和亮氨酸组成的肽键，所得肽段长度适中，既富集了磷酸四氨酸基团，又利于产物分离。
其次胰蛋白酶的最适pH在中性偏碱性区域，而在此范围内，酪蛋白也可保持较大的溶解度，有利于反应的进行。
但是胰蛋白酶本身很容易自水解，由原先的β-胰蛋白酶转化成α-胰蛋白酶，再进一步降解为拟胰蛋白酶，乃至碎片，活力也逐步下降甚至丧失。
文献报道，Ca2+对胰蛋白酶有保护作用和激活作用，当pH＜3并且当Ca2+浓度达到0.01mol/L时，胰蛋白酶比较稳定。
此外，胰蛋白酶价格较高，目前主要用于对酪蛋白水解特性的研究。
胰酶是由胰蛋白酶、糜蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶等构成的混合酶体系。
活性多肽简介
酪蛋白磷酸肽
结构特点
CPPs是由a-酪蛋白和G-酪蛋白经酶水解、分离纯化而得 到的一类富含有 磷酸丝氨酸和谷氨酸的短肽 。 含有相同的结构，其基本核心结构可表示为： 一SerP — SerP — SerP — Glu — Glu-Glu 具有这种核心结构的磷酸肽分子中带有高度负电荷，能抵抗胃肠消化 酶的攻击而免遭进一步分解，从而在体内仍能发挥其生理功能。
生物活性肽的吸收的特点
生物活性肽 不需消化，直接吸收。它表面有一层保护膜，不会受到人体的促酶 、胃
蛋白酶、胰酶、淀粉酶、消化酶及酸碱物质二次水解，它以完整的形式直 进入小肠，被小肠所吸收，进入人体循环系统，发挥其功能。
吸收特别快。吸收进入循环系统的时间，如同静脉针剂注射一样，快速
发挥作用。
三个主要组分al、a2、a3，冷冻干燥后，用电泳分析其纯度，发现al、a2、a3 均不是单一组分，而是含有2个或3个组分，因此，必须对al、a2、a3进一步分 离。
采用选择性更高的乙酸铵洗脱液代替三氟乙酸洗脱液，对a1、a2、a3 收 集液再进行第二次分离 。
阴离子树脂纯化 CPP 原料：CPP初级品r(N/P)为7.52 凝胶型强酸性阳离子交换树脂 原理：CPP在一定pH下带负电,而NPP带正电. 将一定浓度的 CPP 进样, 带负电的CPP 被吸附于阴离子树脂上 , 用清水将未被吸附的 NPP 洗出 , 然后再用一定浓度的 HCl 洗脱 , 得到CPP洗脱液 大孔强碱性阴离子交换树脂
生物活性肽—酪蛋白磷酸肽
秋记与你分享
静思笃行 持中秉正
生物活性肽
所 谓生物活性肽(Bioactive Peptides，B A P)就是对生物机体的生 命 活动有益或是具有生理作用的肽类，是一类分子量小于6000D ，具有多种生物学功能的多肽。 其分 子结构复杂 程度不一，可从简单的二肽到环形大分子多肽 ，而 且 这些多肽可通过磷 酸化、糖基化或酰基化而被 修 饰 。
酪蛋白磷酸肽及其在食品工业中的应用
Sample
Concentration (mg/ml)
GSH(nmol/mg protein)
CAT (sec-1/mg protein)
SOD (U/ml cell homogenate)
GSH-Rd (% of control)
GSH-Px (% of control)
Control
CPPs
1
钙一乙醇沉淀法生产CPPs的工艺路线：酪蛋白一胰 蛋白酶水解一酪蛋白水解液一钙一乙醇沉淀一分离 一干燥--CPPs产品
膜分离法生产CPPs的工艺路线：酪蛋白一酪蛋白水 解液一过滤一分离一喷雾干燥一CPPs产品
典型的CPPs制备工艺
⑴ 酶解
目前，一般采用专一性蛋白酶如胰蛋白酶、 胃蛋白酶、碱性蛋白酶、Alcalase(DH一16%～20% )、胃蛋白酶一胰蛋白酶、胰蛋白酶一中性蛋白酶 、凝乳酶一胰蛋白酶等，水解酪蛋白制取CPPs。
–液态奶、乳饮料、婴幼儿奶粉、学生配方奶、高钙低 脂奶等
• 儿童营养食品
– 婴儿营养米粉、高钙饼干等
• 豆制品
– 高钙豆奶粉、钙豆腐等
• 防龋齿的牙膏、口香糖等 • 啤酒等含气饮料
– 可使泡沫细腻、持久，并促进其中的矿物质吸收
3.5 CPPs的其他应用
• CPPs在医学上的应用
–佝偻病、牙科病、骨质疏松症等疾病的治疗 –制备促进动物体外受精、细胞融合的生化制剂
在降低水解所用酶成本方面，国内学者采用了 固定化酶体系。吴思方等通过正交试验确定了固定 化酶酶解酪蛋白生产CPPs的最佳工艺条件。
陈庆森等确定了固定化最佳条件,以GM201为载 体的固定化酶活力回收为19%,而以壳聚糖为载体的 固定化酶活力回收达到了66%以上,其最适温度为 45℃,最适pH8.0,最适底物浓度为4.0%,利用固定化 酶水解酪蛋白40min所制备CPPs的产率达7.54%。
天然功能性食品添加剂——酪蛋白磷酸肽研究进展
天然功能性食品添加剂——酪蛋白磷酸肽的研究进展摘要：酪蛋白磷酸肽( CPPs) 是含有成簇的磷酸丝氨酸的生物活性肽，现已证明，CPPs 具有重要生理功能。
本文就CPPs 的结构、理化性质、制备工艺、检测方法、生理功能及应用进行了系统的概述。
关键词：酪蛋白磷酸肽；结构；制备；生理功能；应用引言酪蛋白磷酸肽（Casein Phosphope Ptides，CPPs）是以牛奶酪蛋白为原料，经过单一或复合蛋白酶的水解，再对水解产物分离纯化后得到的含有磷酸丝氨酸簇的天然生理活性肽[1]。
CPPs能促进机体肠粘膜对钙、铁、锌和硒，尤其是钙的吸收和利用，被誉为“矿物质载体”。
CPPs是目前唯一促进钙吸收的活性肽，同时在提高机体免疫力、改善繁殖性能等方面也有重要作用。
日本、德国等国家已把CPPs定为功能性食品，与CPPs相关的研究越来越受到我国科学家和食品工作者的广泛关注。
1 CPPs的结构牛乳酪蛋白的主要成分为αs1、αs2、β和κ-酪蛋白，除κ一酪蛋白外，α和β一酪蛋白都具有成簇存在的磷酸丝氨酸残基(Ser一P)。
酪蛋白经体外酶水解后，产生CPPs，CPPs的核心部位是由3个磷酸丝氨酸残基组成的一个一Ser(P)一残基簇，后面紧接着2个一Glu一残基，即一serP一SerP一SerP一Glu一Glu一，现已证明这个结构是发挥其生物活性必不可少的。
Hiroshil等1974年用动物实验表明，酪蛋白可在动物体内形成CPPs，并确定其结构为serP一serP-SerP一Glu一Ile一Pro一Asn。
1996年Nieholasf 习等用胰蛋白酶水解酪蛋白，得到包含有一SerP一SerP一SerP-Glu一Glu一序列的CPPs，从而得知了CPPs实际上是一类含有磷酸丝氨酸和谷氨酸的短肽，其产品分子量不均一[2]。
2 CPPs的理化性质2.1 溶解性 CPPs 产品具有良好的溶解性，其pH值为2.0～10.0，其溶解性除在pH值4.0 约为90%外，其他均高于90%，且溶解性随 pH 值的增高而增大。
酪蛋白磷酸肽在婴幼儿配方食品中的应用
其原因是CPPs促进精子对钙离子的吸收，增强精子
顶体反应能力 ，提高精子对卵细胞的穿透能力。 CPPs还具有增强动物机体免疫力的功能，有研究发 现 酪蛋白C端的磷酸基团对抗体的识别具有极高的临 界点。
13
酪蛋白磷酸肽
CPPs的制备
含有酪蛋白磷酸肽的肽段粉末
14
酪蛋白磷酸肽
CPPs的制备
提纯
方法：钙--乙醇沉淀法、膜分离法和离子交换法3种。其生产过程可大致 分为酪蛋白的水解和CPPs的分离两步。 钙--乙醇沉淀法生产CPPs的工艺路线：酪蛋白→酪蛋 白水解液→钙--乙 醇沉淀→分离→干燥→CPPs产品。
访谈结果与析
属离子的螯合物被肠 黏膜吸收后再释放出CPPs。
10
CPP 理论研究
持钙能力
实验设计 在与人体温度37℃、小肠末端 pH8.0条件相同的反应体系中引 入磷酸根离子和CPP，然后加入钙离子，观察CPP阻 止磷酸钙沉淀的效果。
实验结果
11
科技通报 2008 Vol.24 No.1
11
酪蛋白磷酸肽
高效液相色谱法
16
酪蛋白磷酸肽
其他应用 CPPs的应用
CPPs除作为营养强化剂应用于婴幼儿配方食品中，主要还应用于如下几方面 ： (1)研制功能性食品。 CPPs可作为营养强化剂添加到食品中制成壮骨剂或保 健食品。 (2)用于制药
例如用于对佝偻病、牙科病和骨质疏松症等疾病的治疗 。
(3)制成抗蛀牙牙膏、漱口液或含片等。 (4)制成可促进动物体外受精和细胞融合的生化制剂。
分子质量为1～５K
含有相同的结构，其基本核心结构可表示为： 一SerP — SerP — SerP — Glu — Glu-Glu 具有这种核心结构的磷酸肽分子中带有高度负电荷，能抵抗胃肠 消化酶的攻击而免遭进一步分解，从而在体内仍能发挥其生理功能。
酪蛋白磷酸肽原料
酪蛋白磷酸肽原料
酪蛋白磷酸肽（Casein Phosphopeptide，简称CPP）是一种由牛奶中提取的蛋白质，其原料主要是牛乳酪蛋白。
酪蛋白磷酸肽是一种含有多种氨基酸的蛋白质，主要由牛奶中的蛋白质分解而来，是一种乳清蛋白的水解产物。
酪蛋白磷酸肽的制备过程通常包括酶水解和分离纯化等步骤。
首先，通过酶水解的方法将牛乳酪蛋白分解成较小的肽段，然后通过分离纯化技术从中提取出酪蛋白磷酸肽。
这个过程需要高精度的生物技术和设备，以确保最终产品的质量和纯度。
酪蛋白磷酸肽因其特殊的簇磷酸丝氨酸结构而具有螯合钙的能力。
在人体小肠内pH呈中性到弱碱性的环境中，酪蛋白磷酸肽能与钙螯合成可溶性的钙盐，阻止磷酸钙沉淀的产生，使肠内可溶性钙的含量保持在较高水平，从而促进人体对钙的吸收和利用。
此外，酪蛋白磷酸肽还具有促进人体新陈代谢、促进骨骼生长、提高免疫力、改善睡眠质量等多种功能。
对于生长发育期的人群，适当食用可以补充机体所需要的营养物质，有助于促进生长发育。
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用200—300nm的波长对CPPA进行扫描，最大吸收波长为215nm，故选215nm 作为检测波长 。 取不同体积的样品进行试验，考察进样量对于分离的影响。当进样体积为 200- 300μL 时，样品能达到较好的分离
由于CPPs具有很强的促钙吸收活性，正成为功能性食品添 加剂的开发和研究热点。
酪蛋白磷酸肽
结构特点
CPPs是由a-酪蛋白和G-酪蛋白经酶水解、分离纯化而得 到的一类富含有 磷酸丝氨酸和谷氨酸的短肽 。
含有相同的结构，其基本核心结构可表示为： 一SerP — SerP — SerP — Glu — Glu-Glu
生物活性肽的吸收的特点
生物活性肽
不需消化，直接吸收。它表面有一层保护膜，不会受到人体的促酶 、胃
蛋白酶、胰酶、淀粉酶、消化酶及酸碱物质二次水解，它以完整的形式直 进入小肠，被小肠所吸收，进入人体循环系统，发挥其功能。
吸收特别快。吸收进入循环系统的时间，如同静脉针剂注射一样，快速
发挥作用。
它具有l00％吸收的特点。吸收时，没有任 何废物及排泄物，能被人体
促进动物体外受精和增强机体免疫力
其原因是CPPs促进精子对钙离子的吸收，增强精子 顶体的反应能力 ，提高精子对卵细胞的穿透能力。 CPPs还具有增强动物机体免疫力的功能，有研究发现 酪蛋白C端的磷酸基团对抗体的识别具有极高的 临界 点。
酪蛋白磷酸肽
CPPs的理化性质
溶解性 起泡性
CPPs产品具有良好的溶解性在 pH2.0~10.0内，均高 于90%，且溶解性随pH的增高而增大 。
经过阴离子交换树脂处理，除去非磷酸肽，得到含有一定CPP的粗制品。再经过凝 胶过滤柱 (Sephadex G 一25 )，得到不同分子量分布的两大组分CPPA、CPPB 。根据其分子量分布的不同状况，取 CPPA 用于高效液相制备色谱分离 。
反相高效液相色谱是由非极性固定相和极性流动相所组成的液相色谱体系 ，它正好与由极性固定相和弱极性流动相所组成的液相色谱体系（正相色谱 ）相反。
三个主要组分al、a2、a3，冷冻干燥后，用电泳分析其纯度，发现al、a2、a3 均不是单一组分，而是含有2个或3个组分，因此，必须对al、a2、a3进一步分 离。
采用选择性更高的乙酸铵洗脱液代替三氟乙酸洗脱液，对a1、a2、a3 收 集液再进行第二次分离 。
阴离子树脂纯化 CPP
原料：CPP初级品r(N/P)为7.52 凝胶型强酸性阳离子交换树脂
具有这种核心结构的磷酸肽分子中带有高度负电荷，能抵抗胃肠消化 酶的攻击而免遭进一步分解，从而在体内仍能发挥其生理功能。
酪蛋白磷酸肽
CPPs的功能
促进矿物质吸收 以钙为例，许多研究证实，CPPs促进钙质吸收的方式有两 种：
一种是在十二指肠的上端，在VD 的存在下，可促使钙以 主动方式吸收。
另外一种是在回肠及其末端，以被动方式吸收，它与前 者不同，不直接受到机体功能、营养状况、年龄等影响。 CPPs促进钙的吸收以后一种方式为主。
全部利用。 主动吸收。 吸收时，不需耗费人体能量,不会增加胃肠功能负担。
起载体作用。它可将人所食的各种营养物质运载输送到人体各细胞、组
织、器官。
酪蛋白磷酸肽
酪蛋白磷酸肽(casein phosphopeptides，即CPPs)是以牛乳 酪蛋白为原料，经水解、分离纯化而得到的一类富含磷酸丝 氨酸的生物活性肽，它可作为无机离子载体促进肠膜对钙、 铁、锌、硒、尤其是钙的吸收和利用。
生物活性肽
所 谓生物活性肽(Bioactive Peptides，B A P)就是对生物机体的生 命 活动有益或是具有生理作用的肽类，是一类分子量小于6000D ，具有多种生物学功能的多肽。
其分 子结构复杂 程度不一，可从简单的二肽到环形大分子多肽 ，而 且 这些多肽可通过磷 酸化、糖基化或酰基化而被 修 饰 。
CPPs产品较酪蛋白具有更好的起泡性和泡沫稳定性。
乳化力 热蛋白相比下降了约20% 在100℃,30 min条件下杀菌不会对产品外观造成改变
酪蛋白磷酸肽
CPPs的制备
目前工业制备CPPs的方法主要有钙--乙醇沉淀法、膜分离法和离子交换 法3种。其生产过程可大致分为酪蛋白的水解和CPPs的分离两步。 钙--乙醇沉淀法生产CPPs的工艺路线：酪蛋白→胰蛋白酶水解→ 酪蛋 白 水解液→钙--乙醇沉淀→分离→干燥→CPPs产品。 膜分离法生产CPPs的工艺路线 ：酪蛋白→酪蛋白水解液→过滤→分离→ 喷雾干燥→CPPs产品。
乙醇钙沉淀法
将酪蛋白配成一定浓度的溶液后，用2mol／L的NaOH调至pH8.3左右，加人一定量 的胰蛋白酶进行水解，水解过程始终保持溶液pH在7.7～8.5之间，终止水解时加人 1mol／LHcl使溶液pH达4.6．然后离心除去沉淀，在上清液中加人10mL CaC12溶液至终浓度为100mmol／L，再加入等体积的乙醇，离心收集沉淀，最后 将沉淀用丙酮、乙醚洗涤后挥发干燥，即得CPPs的复杂混合物
酪蛋白磷酸肽
CPPs的功能
促进牙齿、骨骼中钙的沉积和钙化
具体原理为：CPPs磷酸丝氨酸簇结合钙后，以非结晶 形式定位在牙蚀部位 。
磷酸丝氨酸钙盐提供自由的Ca2+和PO4-缓冲液，减少 了釉质的脱矿，增强其再矿化，从而有效防止牙蚀细菌 的侵蚀和造成脱矿物质的过程 。
酪蛋白磷酸肽
CPPs的功能
CPPs促进 矿物质吸收的机理是： CPPs带有较多负电荷，既可以抵抗消化道中各种酶的
水解 ，又可以通过磷酸丝氨酰与钙、铁等离子螫合形 成可溶物，从而有效地防止溶解的金 属离子在小肠中 性或偏碱环境中与磷酸根结合而形成磷酸盐沉淀，同 时可有效地增加矿物质在体内的滞留时间，CPPs与金 访谈属结离果子与的析螯合物被肠 黏膜吸收后再释放出CPPs。