鸡传染性法氏囊病病毒抗体快速检测方法的研究

Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｉｎ ｔｈｉｓｓｔｕｄｙ ＩｎｆｅｃｔｉｏｎｓＢｕｒｓａｌＤｉｓｅａｓｅ Ｖｉｒｕｓ（ＩＢＤＶ）ｗｅｒｅ ｅｘｐａｎｄｅｄ ｉｎ Ｖｅｒｏ ｃｅｌｌｃｕｌｔｕｒｅｓ，ｔｈｅｎ ｔｈｅ ＩＢＤＶ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｓｔｈｅ ａｎｔｉｇｅｎｗａｓ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｕｓｉｎｇＰＥＧ ｍｅｔｈｏｄ．Ｂｙｍｅａｎｓｏｆｔｈｅ ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｏｘｉｄａｓｅ （ＨＲＰ）－ｌａｂｅｌｌｅｄ ｍｏｎｏ２ ｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙ ａｇａｉｎｓｔ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ｏｆ ｃｈｉｃｋｅｎ Ｓｅｒｕｍ ＩｇＧ ａｓ ｔｈｅ ｓｅｃｏｎｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ，ｔｈｅ Ｓａｎｄｗｉｃｈ ｅｎｚｙｍｌ ｌｉｎｋｅｄ ｉｍ２ ｍｕｎｏｓｅｒｂｅｎｔａｓｓａｙ（Ｓａｎｄｗｉｃｈ ＥＬＩＳＡ）ｗａｓ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔｔｈｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｏｆＩＢＤＶ ｉｎ ｃｈｉｃｋｅｎ Ｓｅｒｕｍ ｗｉｔｈｏｕｔｎｏｎｓｐｅｃｉｆ２ ｉｃ ｒｅａｃｔｉｏｎｓ．Ｏｕｒｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｒｅｓｕｌｔｓ ｄｅｍｏｎｓｔｎａｔｅｄ ｔｈａｔｔｈｅ Ｓａｎｄｗｉｃｈ ＥＬＩＳＡ ｔｈａｔｗｅ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｉｓ ｓｉｍｐｌｅ，ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ，ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｆｏｒｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇｔｈｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｏｆＩＢＤＶ ｉｎ ｃｈｉｃｋｅｎ ｓｅｒａ，ａｎｄ ｉｔｓｕｇｇｅｓｔｅｄ ｔｈａｔｔｈｅ ｆａｓｔｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｈａｖｅ ｇｏｏｄ ｐｏｔｅｎｔｉａｌｆｏｒｅｘｔｅｎｄｅｄ ｕｓｅ．
中国家禽
２００１年 第 ２３卷 第 １９期
实验研究
ＣｈｉｎａＰｏｕｌｔｒｙ Ｖｏｌ．２３Ｎｏ．１９．２００１
鸡传染性法氏囊病病毒抗体快速检测方法的研究
翟 新 国 １，辛 颜 彬 ２ （１．河 北 省 邯 郸 农 业 高 等 专 科 学 校 ，邯 郸 ０５７１５０；２．军 事 医 学 科 学 院 微 检 中 心 ，北 京 １００８５０）
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ＩｎｆｅｃｔｉｏｎｓＢｕｒｓａｌＤｉｓｅａｓｅ Ｖｉｒｕｓ（ＩＢＤＶ）；ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ；Ｓａｎｄｗｉｃｈ ＥＬＩＳＡ
鸡 传 染 性 法 氏 囊 病 是 一 种 ３～１２周 龄 青 年 鸡 的 高 度 接 触 性 、病 毒 性 传 染 病 ，造 成 鸡 的 法 氏 囊 损 伤和机体的免疫抑制；发病率和死亡率都比较 高 。为 有 效 防 制 本 病 ，常 需 作 血 清 抗 体 的 检 测 。目 前 国 内 外 采 用 的 试 剂 和 方 法 很 多 ，但 很 多 试 剂 和 方 法 不 能 很 好 应 用 于 基 层 工 作 ，仍 然 以 经 典 的 琼 脂 扩 散 （ＡＧＰ）方 法 检 测 抗 体 。 其 中 主 要 的 技 术 环 节是抗原的纯化和标记抗体的特异性问题没有 很 好 解 决 。 为 此 ，采 用 Ｖｅｒｏ细 胞 繁 殖 病 毒 ，并 通 过 ＰＥＧ纯 化 的 方 法 制 备 抗 原 ；应 用 以 抗 鸡 血 清 ＩｇＧ单
关键词：鸡 传 染 性 法 氏 囊 病 病 毒 ；抗 体 检 测 方 法 ；双 抗 体 夹 心 ＥＬＩＳＡ
Ｓｔｕｄｙ ｏｎ ｔｈｅＦａｓｔ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆｔｈｅＡｎｔｉｂｏｄｙ ｆｏｒ ＩｎｆｅｃｔｉｏｎｓＢｕｒｓａｌＤｉｓｅａｓｅ Ｖｉｒｕｓ
Ｚｈａｉ Ｘｉｎｇｕｏ１，Ｘｉｎ Ｙａｎｂｉｎ２ （１．Ｈａｎｄａｎ ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌｃｏｌｌｅｇｅ，Ｈ ａｎｄａｎ ０５７１５０ ２．Ｍ ｉｃｒｏｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ ｃｅｎｔｒｅ ｏｆＭ ｉｌｉｔａｒｙ Ｍ ｅｄｉｃａｌＣｏｌｌｅｇｅＢｅｉｊｉｎｇ １００８５０）
收 稿 日 期 ：２００１— ０４— ０３ 河 北 省 教 育 厅 基 金 项 目研 究 内 容 ， 编 号 ：９７２０３
克 隆 抗 体 的 夹 心 ＥＬＩＳＡ方 法 提 高 检 测 速 度 和 特 异 性。
１ 材料和方法
１．１ Ｖｅｒｏ细 胞 为 军 事 医 学 科 学 院 细 胞 库 提 供 。 １．２ 单 克 隆 抗 体 病 毒 Ａ 株 购 于 中 国 兽 药 监 察
保 护 剂 ，使 试 剂 ４℃ 保 存 半 年 以 上 。
参考文献：
１ Ｊａｃｋｗｏｏｄ Ｄ Ｊ，Ｋｉｂｅｎｇｅ Ｆ Ｓ Ｂ，Ｍ ｅｒｃａｄｅ Ｃ Ｃ ｅｔ ａｌ． Ｊ ｏｆ

ＣｌｉｎｉｃａｌＭ ｉｃｒｏｂｉｏ，１９８９，２７（１）：２４３７～２４４３
２ 辛 颜 彬 、刘 军 兰 、孟 玲 巧 等 ；中 国 兽 医 杂 志 ，１９９６，２２（３）：６～７
３ 汪 培 林 、蔡 宝 祥 、李 劲 松 等 ；中 国 兽 医 科 技 ，１９９７，２７（１）：２３～２４
４ 赵 增 连 、陈 博 言 、林 祥 梅 等 ；中 国 兽 医 学 报 ，１９９２，１８（５）：４５４～
４５６
■
－ １３－
３．２ 建 立 了 试 验 操 作 程 序 ，以 经 典 的 ＡＧＰ方 法 做
为 对 照 ，证 明 ＥＬＩＳＡ方 法 有 较 高 的 附 合 率 ，达 到 了
简 便 、快 速 和 特 异 的 要 求 ，适 合 于 基 层 单 位 应 用 。 ３．３ 本 实 验 室 制 备 的 抗 原 保 护 剂 和 酶 标 结 合 物
２
４
值 ，或 肉 眼 观 察 结 果 。
２．５ 检 测 临 诊 标 本 的 结 果
２．５．１ ９８份 成 年 鸡 血 清 ，ＥＬＩＳＡ法 检 出 阳 性 标 本 ４３
份 （其 中 ２８份 与 ＡＧＰ法 一 致 ），阳 性 检 出 率 为 ４４％。
２．５．２ 对 三 批 共 ２１４份 雏 鸡 血 清 进 行 了 检 测 ，其 结
置 ４℃ 过 夜 ，取 出 后 甩 干 ，加 封 闭 液 １００μｌ，置 ３７℃
３０ｍｉｎ，洗 涤 ，甩 干 。
２．４．２ 加 入 提 纯 的 ＩＢＤＶ抗 原 ，３７℃ 孵 育 ３０ｍｉｎ，洗
涤 ，甩 干 ，再 加 封 闭 保 护 液 ，３０ｍｉｎ，洗 涤 ，甩 干 。 以
塑 料 装 置 密 封 保 存 于 ４℃ 备 用 。
－ １２－
中 国 家 禽 ２００１年 第 ２３卷 第 １９期
实验研究
Ｃｈｉｎａ Ｐｏｕｌｔｒｙ Ｖｏｌ．２３Ｎｏ．１９．２００１
１．６ 抗 原 的 制 备 和 ＰＥＧ纯 化 将 ＳＰＦ鸡 胚 细 胞 繁 殖 的 ＩＢＤＶ毒 种 ，接 种 到 Ｖｅｒｏ细 胞 中 传 代 并 大 量 培 养 ，在 病 毒 繁 殖 的 高 峰 期 （ＣＰＥ为 ＋＋）时 收 集 细 胞 病 毒 悬 液 ， 反 复 冻 融 三 次 ， 低 速 离 心 （３ ０００ ｒ／ ｍｉｎ，１５ ｍｉｎ）除 去 细 胞 碎 片 ，取 上 清 液 为 病 毒 悬 液 。再 用 ＰＥＧ 法 提 纯 抗 原 ：先 用 ４０％ＰＥＧ （分 子 量 为 ６０００）加 入 ０．９％的 ＮａＣｌ，待 完 全 溶 解 后 ，煮 沸 消 毒 ２０ ｍｉｎ，冷 却 后 备 用 ；取 一 定 量 病 毒 悬 液 于 离 心 管 内 ，９０００ｒ／ｍｉｎ离 心 ３０ｍｉｎ，取 上 清 液 ，加 入 上 述 ＰＥＧ （最 终 浓 度 为 ７．５％），ＰＨ 值 调 至 ７．６～ ７．８，置 ４℃ 过 夜 ，再 用 ９０００ｒ／ｍｉｎ 离 心 ３０ｍｉｎ，取 沉 淀 ，加 入 适 量 ＰＨ９．０ＢＢＳ液 ，即 为 纯 化 抗 原 。 １．７ 琼 脂 扩 散 试 验 （ＡＧＰ） 按 常 规 方 法 进 行 ，试 剂购于中国农业科学院哈尔滨兽医研究所。 １．８ 实 验 操 作 程 序 的 选 择 １．８．１ 酶 联 试 验 反 应 条 件 采 用 方 阵 滴 定 法 确 定 各 种 试 剂 浓 度 。 兔 抗 ＩＢＤＶ 血 清 １∶１００～１∶１６００； ＩＢＤＶ 抗 原 １∶２５～１∶１０００；鸡 血 清 １∶５０～１∶２００；酶 标 抗 体 １∶５００～１∶８０００。 １．８．２ 包 被 时 间 和 温 度 兔 抗 ＩＢＤＶ ＩｇＧ 包 被 微 量 ，置 ３７℃ １ ｈ，置 ４℃ 过 夜 。加 待 测 血 清 和 二 抗 的 反 应 温 度 为 ４℃ 、室 温 、３７℃ ，其 反 应 时 间 为 ５ｍｉｎ、 １５ｍ ｉｎ、３０ｍ ｉｎ。 １．８．３ 观 察 结 果 用 酶 标 仪 测 定 其 Ｏ Ｄ 值 ；也 可 用肉眼观察结果。
摘 要：采 用 Ｖｅｒｏ细 胞 繁 殖 鸡 法 氏 囊 病 毒 （ＩｎｆｅｃｔｉｏｎｓＢｕｒｓａｌＤｉｓｅａｓｅ Ｖｉｒｕｓ，ＩＢＤＶ），并 用
ＰＥＧ方 法 提 纯 病 毒 制 备 抗 原 。 应 用 抗 鸡 血 清 ＩｇＧ重 链 单 克 隆 抗 体 酶 标 结 合 物 作 为 第 二 抗 体 ，用 双 抗 体 夹 心 酶 联 免 疫 吸 附 试 验 （ＥＬＩＳＡ）检 测 鸡 血 清 中 的 法 氏 囊 病 毒 抗 体 ，较 好 地 克 服 了 非 特 异 反 应 问 题 ，该 方 法 简 便 、快 速 和 特 异 性 好 ，有 较 大 的 推 广 应 用 价 值 。
果 见 表 １。
３讨
论
３．１ 本 文 介 绍 的 方 法 比 较 好 地 利 用 不 同 种 属 的
动 物 细 胞 繁 殖 病 毒 和 ＰＥＧ纯 化 的 方 法 ， 减 少 组 织
交叉反应 另外采用单克隆抗体酶标结合物做为
二 抗 ，减 少 了 非 特 异 反 应 ，在 待 测 血 清 不 经 过 灭 活 和 强 处 理 的 情 况 下 ，也 能 取 得 比 较 满 意 的 结 果 。
２结
果
２．１ 制 备 了 比 较 满 意 的 抗 原 经 试 验 减 少 了 与 鸡 组 织 细 胞 的 交 叉 反 应 ， 而 且 制 备 方 法 简 便 ，降 低了用梯度离心纯化抗原的昂贵费用。 ２．２ 减 少 了 交 叉 反 应 应 用 抗 鸡 血 清 ＩｇＧ单 克 隆 抗体酶标结合物做为第二抗体的双抗体夹心 ＥＬＩＳＡ方 法 ，减 少 了 对 鸡 血 清 的 交 叉 反 应 ，增 强 了 该方法的特异性和敏感性。 ２．３ 确 定 了 试 验 中 的 最 适 条 件 ２．３．１ 兔 抗 ＩＢＤＶ ＩｇＧ包 被 浓 度 为 １∶４００，置 ４℃ 过 夜 ；ＩＢＤＶ抗 体 浓 度 为 １∶１００，置 ３７℃ ３０ｍｉｎ；待 测 鸡 血 清 为 １∶４０，置 ３７℃ ３０ｍｉｎ；酶 结 合 物 为 １∶２０００，置 ３７℃ ３０ｍｉｎ。 ２．３．２ 其 他 试 验 步 骤 均 按 常 规 方 法 进 行 。 ２．４ 试 验 操 作 程 序 的 建 立 ２．４．１ 加 兔 抗 ＩＢＤＶ ＩｇＧ１００μｌ至 平 底 ９６孔 板 中 ，