18 电 泳1
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电泳
电泳又名——电着（著），泳漆，电沉积。创始于二十世纪六十年代，由福特汽车公司最先应用于汽车底漆。 由于其出色的防腐、防锈功能，很快在军工行业得到广泛应用。近几年才应用到日用五金的表面处理。由于其优 良的素质和高度环保，正在逐步替代传统油漆喷涂。
电泳漆膜具有涂层丰满、均匀、平整、光滑的优点，电泳漆膜的硬度、附着力、 耐腐、冲击性能、渗透性能明显优于其它涂装工艺。 详细特点： （1）采用水溶性涂料，以水为溶解介质，节省了大量有机溶剂，大大降低了大气污染和环境危害，安全卫生， 同时避免了火灾的隐患； （2）涂装效率高，涂料损失小，涂料的利用率可达90%～95%； （3）涂膜厚度均匀，附着力强，涂装质量好，工件各个部位如内层、凹陷、焊缝等处都能获得均匀、平滑的 漆膜，解决了其他涂装方法对复杂形状工件的涂装难题； （4）生产效率高，施工可实现自动化连续生产，大大提高劳动效率； （5）设备复杂，投资费用高，耗电量大，其烘干固化要求的温度较高，涂料、涂装的管理复杂，施工条件严 格，并需进行废水处理； （6）只能采用水溶性涂料，在涂装过程中不能改变颜色，涂料贮存过久稳定性不易控制。
影响因素
1．电泳介质的pH值
溶液的pH值决定带电物质的解离程度，也决定物质所带净电荷的多少。对蛋白质，氨基酸等类似两性电解质， pH值离等电点越远，粒子所带电荷越多，泳动速度越快，反之越慢。因此，当分离某一种混合物时，应选择一种 能扩大各种蛋白质所带电荷量差别的pH值，以利于各种蛋白质的有效分离。为了保证电泳过程中溶液的pH值恒定， 必须采用缓冲溶液。
I=1/2∑CiZi2 (I：离子强度；Ci：离子的摩尔浓度；Zi：离子价数.)
0.154M NaCl溶液的离子强度为：
I= 1/2(0.154×12+0.154×泳槽和电源。
电泳漆膜具有涂层丰满、均匀、平整、光滑的优点，电泳漆膜的硬度、附着力、 耐腐、冲击性能、渗透性能明显优于其它涂装工艺。 详细特点： （1）采用水溶性涂料，以水为溶解介质，节省了大量有机溶剂，大大降低了大气污染和环境危害，安全卫生， 同时避免了火灾的隐患； （2）涂装效率高，涂料损失小，涂料的利用率可达90%～95%； （3）涂膜厚度均匀，附着力强，涂装质量好，工件各个部位如内层、凹陷、焊缝等处都能获得均匀、平滑的 漆膜，解决了其他涂装方法对复杂形状工件的涂装难题； （4）生产效率高，施工可实现自动化连续生产，大大提高劳动效率； （5）设备复杂，投资费用高，耗电量大，其烘干固化要求的温度较高，涂料、涂装的管理复杂，施工条件严 格，并需进行废水处理； （6）只能采用水溶性涂料，在涂装过程中不能改变颜色，涂料贮存过久稳定性不易控制。
影响因素
1．电泳介质的pH值
溶液的pH值决定带电物质的解离程度，也决定物质所带净电荷的多少。对蛋白质，氨基酸等类似两性电解质， pH值离等电点越远，粒子所带电荷越多，泳动速度越快，反之越慢。因此，当分离某一种混合物时，应选择一种 能扩大各种蛋白质所带电荷量差别的pH值，以利于各种蛋白质的有效分离。为了保证电泳过程中溶液的pH值恒定， 必须采用缓冲溶液。
I=1/2∑CiZi2 (I：离子强度；Ci：离子的摩尔浓度；Zi：离子价数.)
0.154M NaCl溶液的离子强度为：
I= 1/2(0.154×12+0.154×泳槽和电源。
电泳的工艺流程
电泳的工艺流程
《电泳的工艺流程》
电泳是一种利用电场力将带电颗粒或颗粒悬浮的液体置于电场中，使其沿电场方向运动并在电极表面析出的方法。
在工业上，电泳常被用于涂装工艺，特别是自动化涂装生产线中。
以下是电泳的工艺流程：
1. 准备工件：首先需要准备待涂装的工件。
这些工件需要进行清洗、去油和除锈等处理，确保表面干净平整，以便电泳涂装的附着力和耐腐蚀性。
2. 预处理：在进入电泳涂装生产线之前，工件需要经过预处理。
这包括浸泡、喷淋或刷洗等步骤，以去除表面的污垢和杂质，同时提高工件表面与电泳涂料的附着力。
3. 电泳涂装：准备好的工件被悬挂在涂装线上，沉浸在电泳槽中。
在槽中，电泳涂料被施加一个直流电场，使得带电颗粒在电极表面析出形成均匀、致密的涂层。
4. 固化：经过电泳涂层形成后，工件需要进行烘烤或固化处理。
这个步骤旨在使得电泳涂料快速固化变硬，以确保涂层的耐用性和耐腐蚀性。
5. 检验和包装：最后，经过固化处理的工件需要进行检验，确保涂层的质量和外观符合要求。
接着，将工件进行包装，以便运输和存储。
通过以上工艺流程，电泳涂装可以为工件提供均匀、耐用、防腐蚀的涂层，从而提高产品的质量和使用寿命。
同时，电泳涂装也能够实现自动化生产，提高涂装效率，节约成本。
因此，电泳涂装在各种金属和非金属工件的表面处理中得到了广泛的应用。
第十八章电泳
（3） 扩散进样 试样通过扩散作用进入分离柱端口处
第十八章电泳
三、高效毛细管电泳理论（ theory of HPCE ）
（一）高效毛细管电泳(HPCE)基本原理 电泳是指带电离子在电场中的定向移动，不同离子具
有不同的迁移速度，当带电离子以速度ν 在电场中移动时，
受到大小相等、方向相反的电场推动力和平动摩擦阻力的 作用。
第十八章电泳
图3 常用几种型号的高效毛细管电泳仪
第十八章电泳
二、高效毛细管电泳仪器流程和主要部件
图 4 高效毛细管电泳流程图 • 电压：0～30kV； • 分离柱不涂敷任何固定液； • 紫外或激光诱导荧光检测器； （可检测到：10-19～10-21 mol/L）
第十八章电泳
图 5 高效毛细管电泳基本装置
第十八章电泳
表1 高效毛细管电泳与高效液相色谱性能比较
第十八章电泳
4、毛细管电泳简单历史
（1）1967年Hjerten首先报道了开管毛细管电泳，后 来Virtanen和Mikkers先后分别在约200 m内径的玻璃 或Teflon毛细管中进行电泳，这些是毛细管电泳的最初 期工作。
（2）1981年，Jorgenson和Lukacs使用75 m内径 100cm的玻璃毛细管在30kV的高电压下进行电泳，获得 了数十万理论塔板数的高分离效率，使毛细管电泳技术 有了突破性进展。
管内壁带负电荷，形成双电层。 在高电场的作用下，带正电荷的溶液表面及扩散层向阴
极移动，由于这些阳离子实际上是溶剂化的，故将引起柱
中的溶液整体向负极移动，速度ν电渗流。
图 7 毛细管电泳中电渗现象和电渗流
当液体两端施加电压时，就会发生
液体相对于固体表面的移动，这种液体
相对于固体表面的移动的现象叫电渗现
第十八章电泳
三、高效毛细管电泳理论（ theory of HPCE ）
（一）高效毛细管电泳(HPCE)基本原理 电泳是指带电离子在电场中的定向移动，不同离子具
有不同的迁移速度，当带电离子以速度ν 在电场中移动时，
受到大小相等、方向相反的电场推动力和平动摩擦阻力的 作用。
第十八章电泳
图3 常用几种型号的高效毛细管电泳仪
第十八章电泳
二、高效毛细管电泳仪器流程和主要部件
图 4 高效毛细管电泳流程图 • 电压：0～30kV； • 分离柱不涂敷任何固定液； • 紫外或激光诱导荧光检测器； （可检测到：10-19～10-21 mol/L）
第十八章电泳
图 5 高效毛细管电泳基本装置
第十八章电泳
表1 高效毛细管电泳与高效液相色谱性能比较
第十八章电泳
4、毛细管电泳简单历史
（1）1967年Hjerten首先报道了开管毛细管电泳，后 来Virtanen和Mikkers先后分别在约200 m内径的玻璃 或Teflon毛细管中进行电泳，这些是毛细管电泳的最初 期工作。
（2）1981年，Jorgenson和Lukacs使用75 m内径 100cm的玻璃毛细管在30kV的高电压下进行电泳，获得 了数十万理论塔板数的高分离效率，使毛细管电泳技术 有了突破性进展。
管内壁带负电荷，形成双电层。 在高电场的作用下，带正电荷的溶液表面及扩散层向阴
极移动，由于这些阳离子实际上是溶剂化的，故将引起柱
中的溶液整体向负极移动，速度ν电渗流。
图 7 毛细管电泳中电渗现象和电渗流
当液体两端施加电压时，就会发生
液体相对于固体表面的移动，这种液体
相对于固体表面的移动的现象叫电渗现
电泳技术
1）能产生密度梯度，且密度高时，粘度不高；
2）PH中性或易调为中性；
3）浓度大时渗透压不大； 4）对细胞无毒。
1. 速率区带离心度沉降
用途：分离密度相近而大小不等的细胞或颗粒。 特点：介质密度较低，介质的最大密度应小于被分离 生物颗粒的最小密度。
原理：介质密度梯度平缓，分离物按各自的沉降系数 以不同的速度沉降而达到分离。
二、离心机的结构与分类 (一）分类 1.低速离心机：转速<6kr/min 2.高速离心机：转速10~25kr/min的离心机 称为。 3. 超 速 离 心 机 ： 转 速 >25kr/min ， 离 心 力 >89Kg；最高转速可达100kr/min，离心力 超过500kg。
一、离心技术原理 在离心力场中，颗粒在离心运动中受离心力、 重力、摩擦力及浮力的共同作用。 在离心力场中，如果颗粒的密度大于周围介 质的密度，则颗粒发生沉淀；反之发生漂浮。 无论发生沉降与漂浮，离心力的方向总与浮 力的方向相反，离心力加大时，反向的两个 力也增大，当离心力与反向力达到平衡时， 可人力的沉降（浮力）加速度为零，直到各 组分达到分离目的。
第三节
电泳技术
电泳技术：利用带电粒子在电场作用下 定向移动的特性，对混合物组进行分离、 纯化和测定的一项技术。 电泳：溶液中带电粒子在电场中定向移 动的现象称为电泳
1 电泳：带电粒子在电场中向着与其本身电荷 相反的电极移动的过程。 2 电泳技术优点：快速、准确、重现性好 3 电泳方法分类 按电场分：常压（<500V，适用大分子）、高 压（>500V，适用小分子） 支持体分：自由电泳、区带电泳 仪器装置分：水平式、垂直式、悬架式 4 电泳条件：水溶液（缓冲液）、支持物（区 带电泳）、电场（电泳仪、电泳槽）
电泳介绍
电泳技术电泳技术电泳法，是指带电荷的供试品（蛋白质、核苷酸等）在惰性支持介质（如纸、醋酸纤维素、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等）中，于电场的作用下，向其对应的电极方向按各自的速度进行泳动，使组分分离成狭窄的区带，用适宜的检测方法记录其电泳区带图谱或计算其百分含量的方法。
电泳技术的基本原理和分类 在电场中，推动带电质点运动的力（F）等于质点所带净电荷量（Q）与电场强度（E）的乘积。
F＝QE质点的前移同样要受到阻力（F）的影响，对于一个球形质点，服从Stoke定律，即：F′＝6πrην式中r为质点半径，η为介质粘度，ν为质点移动速度，当质点在电场中作稳定运动时：F＝F′即QE＝6πrην可见，球形质点的迁移率，首先取决于自身状态，即与所带电量成正比，与其半径及介质粘度成反比。
除了自身状态的因素外，电泳体系中其它因素也影响质点的电泳迁移率。
电泳法可分为自由电泳（无支持体）及区带电泳（有支持体）两大类。
前者包括Tise-leas式微量电泳、显微电泳、等电聚焦电泳、等速电泳及密度梯度电泳。
区带电泳则包括滤纸电泳（常压及高压）、薄层电泳（薄膜及薄板）、凝胶电泳（琼脂、琼脂糖、淀粉胶、聚丙烯酰胺凝胶）等。
自由电泳法的发展并不迅速，因为其电泳仪构造复杂、体积庞大，操作要求严格，价格昂贵等。
而区带电泳可用各种类型的物质作支持体，其应用比较广泛。
本节仅对常用的几种区带电泳分别加以叙述。
影响电泳迁移率的因素 ⒈电场强度电场强度是指单位长度（cm）的电位降，也称电势梯度。
如以滤纸作支持物，其两端浸入到电极液中，电极液与滤纸交界面的纸长为20cm，测得的电位降为200V，那么电场强度为200V/20cm＝10V/cm。
当电压在500V以下，电场强度在2-10v/cm时为常压电泳。
电压在500V以上，电场强度在20-200V/cm时为高压电泳。
电场强度大，带电质点的迁移率加速，因此省时，但因产生大量热量，应配备冷却装置以维持恒温。
电泳基础知识
电泳的基本原理
在一定pH条件下，每一种分子都具有特定的电荷 在一定pH条件下， pH条件下 种类和数量）、大小和形状， ）、大小和形状 （种类和数量）、大小和形状，在一定时间内它 们在相同电场中泳动速度不同， 们在相同电场中泳动速度不同，各自集中到特定 的位置上而形成紧密的泳动带。 的位置上而形成紧密的泳动带。这就是带电粒子 可以用电泳技术进行分离、 可以用电泳技术进行分离、分析和鉴定的基本原 理。 -
聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺和 交联试剂N,N’-甲叉双丙烯酰胺 在有引发剂（如过硫酸铵） 在有引发剂（如过硫酸铵）和增 速剂（ 速剂（如N,N,N’,N’-四甲基乙二 TEMED） 胺，TEMED）的情况下聚合而成 的。丙稀酰胺的聚合通常是由化 学催化或光化学过程完成的, 学催化或光化学过程完成的,常 用过硫酸铵、 用过硫酸铵、过硫酸钾或核黄素 来引发这个过程， TEMED、 来引发这个过程，用TEMED、3二甲胺丙腈等作为聚合过程中的 增速剂。 增速剂。
若将带净电荷Q的粒子放入电场，则该粒子所受到的电荷引力为： 若将带净电荷Q的粒子放入电场，则该粒子所受到的电荷引力为： （1） F引=E Q 在溶液中,运动粒子与溶液之间存在阻力F 在溶液中,运动粒子与溶液之间存在阻力F阻 =6π V F阻=6πrηV （2） 2 当F引=F阻时 （3） 6π EQ= 6πrηV V
EQ V= 6πrη
（4）
由上式可以看出,粒子的移动速度(泳动速度V)与电场强度(E) 由上式可以看出,粒子的移动速度(泳动速度V)与电场强度(E) V)与电场强度 和粒子所带电荷量(Q)成正比,而与粒子的半径(r) (Q)成正比 (r)及溶液的粘度 和粒子所带电荷量(Q)成正比,而与粒子的半径(r)及溶液的粘度 DNA） (η)成反比。非球形分子（如线状DNA）在电泳过程中受到更大 )成反比。非球形分子（如线状DNA 的阻力，即粒子的泳动速度与粒子形状有关。 的阻力，即粒子的泳动速度与粒子形状有关。
电 泳
（9）操作面板没有显示 1）确认端子PC-SD间是否短路； 2）确认端子P/+ - P1间是否确实安装了短路片。
第一节 电泳的基本原理
蛋白质或其他多电解质则由其本身所具有的功能团的解 离而带电。蛋白质具有正负两类解离基，称为两性电解质。 蛋白质在酸性介质中带正电，在碱性介质中则带负电。在某 一pH值时，其正负电荷相等，此时的pH即称为该蛋白质的 等电点。
2）检查输入信号 ①起动信号是否输入； ②正转和反转起动信号是否同时输入； ③频率设定信号是否为零； ④频率设定为4- 20mA时，AU信号是否接通； ⑤输出停止信号（MRS）或复位信号（RES）是否在ON状态， 信 号MRS、RES分配在Pr.60、 Pr.63； ⑥漏型、源型的接口是否安装牢固。
②轴是否被锁定。
5）其它
①操作面板的显示是否为错误内容 OC1等； ②点动运行时，Pr.15 点动频率的设定值是否比Pr.13起动频 率的设定值低。
（2）电机旋转方向相反 1）输出端子U、V、W相序是否正确 2）起动信号正转/反转连接是否正确； 3）确认Pr.17 RUN键旋转方向选择的设定值。
（3）速度与设定值相差很大
（5）电机电流过大 1）负荷是否过重； 2）转矩提升设定值是否设定太大。
（6）速度不能增加 1）上限频率设定是否正确； 2）负荷是否过重（搅拌机冬季时负荷可能变重）； 3）转矩提升设定值是否太大、失速防止功能是否动作。
（7）运行时速度波动 1）检查负载； 2）负载是否有变化； 3）检查输入信号； 4）频率设定信号是否有变化； 5）频率设定信号是否受到感应噪声的影响； 6）连接晶体管输出单元时，回流电流是否引起误动作； 7）接线是否太长； 8）是否负荷GD2过小，确认没有噪声或漏电流等的影响。
第一节 电泳的基本原理
蛋白质或其他多电解质则由其本身所具有的功能团的解 离而带电。蛋白质具有正负两类解离基，称为两性电解质。 蛋白质在酸性介质中带正电，在碱性介质中则带负电。在某 一pH值时，其正负电荷相等，此时的pH即称为该蛋白质的 等电点。
2）检查输入信号 ①起动信号是否输入； ②正转和反转起动信号是否同时输入； ③频率设定信号是否为零； ④频率设定为4- 20mA时，AU信号是否接通； ⑤输出停止信号（MRS）或复位信号（RES）是否在ON状态， 信 号MRS、RES分配在Pr.60、 Pr.63； ⑥漏型、源型的接口是否安装牢固。
②轴是否被锁定。
5）其它
①操作面板的显示是否为错误内容 OC1等； ②点动运行时，Pr.15 点动频率的设定值是否比Pr.13起动频 率的设定值低。
（2）电机旋转方向相反 1）输出端子U、V、W相序是否正确 2）起动信号正转/反转连接是否正确； 3）确认Pr.17 RUN键旋转方向选择的设定值。
（3）速度与设定值相差很大
（5）电机电流过大 1）负荷是否过重； 2）转矩提升设定值是否设定太大。
（6）速度不能增加 1）上限频率设定是否正确； 2）负荷是否过重（搅拌机冬季时负荷可能变重）； 3）转矩提升设定值是否太大、失速防止功能是否动作。
（7）运行时速度波动 1）检查负载； 2）负载是否有变化； 3）检查输入信号； 4）频率设定信号是否有变化； 5）频率设定信号是否受到感应噪声的影响； 6）连接晶体管输出单元时，回流电流是否引起误动作； 7）接线是否太长； 8）是否负荷GD2过小，确认没有噪声或漏电流等的影响。
电泳技术
显色
氨基黑10B（amino black 10B） 考马斯亮蓝（Coomassie brilliant blue，CBB ）
检测限100ng R250：偏红，慢染，脱色脱的完全，比氨基黑高5倍 G250：偏绿，快染，脱色脱的不彻底，比氨基黑高3倍， 适合定量
固绿(Fast green，FG)
染色灵敏度不如CBB，近似于氨基黑，但却可克服CBB 在脱色时易溶解出来的缺点。
特别适合蛋白质理化分析
7
聚丙烯酰胺凝胶的分类 聚丙烯酰胺凝胶的分类
聚丙烯酰胺凝胶电泳分为连续系统与不连 续系统两大类。
SDS-PAGE电泳 IEF-PAGE电泳 PG-PAGE电泳
目前常用的多为圆盘电泳和板状电泳。
8
电泳槽
迷你双垂直电泳槽
卧式电泳槽
等电聚焦多用电泳槽
9
聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳示意图
23
电洗脱仪
GeBAflex管电洗脱
24
聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳（ 聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳（IEF-PAGE） ）
利用pI不同，以PAGE为电泳支持物，并在其中加 入两性电解质载体，在电场作用下，两性电解质载 体在凝胶中移动，形成pH梯度。 pH 蛋白质在凝胶中迁移至其pI的pH处，即不再泳动而 聚焦成带，这种方法称聚丙烯酰胺等电聚焦电泳 （isoelectric focusing-PAGE，IEF-PAGE）。
SiO2+2OH-
SiO32-
阴离子运动方向与电渗流（EOF） ν-=ν电渗流-ν-ef 阴离子运动方向与电渗流（EOF）相反 34
（A为正面，B为剖面） 1：样品胶pH6.7 2：浓缩胶pH6.7 3：分离胶pH8.9 4：电极缓冲液pH8.3 10
电泳基本原理
电泳基本原理
电泳是通过外加电场来分离混合物中的各种化学物质的方法。
它的基本原理是利用物质在电场中引起的运动，根据其带电性、大小、形状、密度、分子量等特点，在电场中发生迁移分离。
具体来说，电泳的基本原理如下：
1. 带电物质在电场中发生迁移：外加电场会让带电物质产生电荷的排列，不同的带电物质由于其带电量和性质的不同，在电场中会有不同的迁移速度，从而发生迁移分离。
2. 迁移速度与带电量和性质有关：带电物质的电荷量越大，分子量越小，电场力对其的作用就越大，迁移速度越快。
另外，带电物质的电性质、电介质、电荷形状等也会影响迁移速度。
3. 单向电场保证分离效果：电泳必须在单向电场中进行，具体方法包括水平电泳和垂直电泳，以保证物质能够迁移到指定的方向，避免混乱。
综上所述，电泳的原理基于外加电场引起带电物质迁移的过程，通过不同速度的迁移分离物质。
电泳简单介绍
制胶工具
预制胶
SDS-PAGE
根据样品分离目的不同，主要有 两 种处理方法:还原SDS处理、非还 原SDS处理。
1 2
还原SDS处理: 在上样buffer中加入β-巯基乙醇 （ β-巯基乙 醇能使半胱氨酸残基间的二硫键断裂 ） ，蛋白质构象被解离 ，电荷被中和，形成SDS与蛋白相结合的分子。
非还原SDS处理:
聚丙烯酰胺凝胶有下列特性： (1)在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好； (2)化学性能稳定，与被分离物不起化学反应，在很多溶剂中不溶； (3)对pH和温度变化较稳定； (4)几乎无吸附和电渗作用，只要Acr纯度高，操作条件一致，则样品分 离重复性好；
(5)样品不易扩散，且用量少，其灵敏度可达10-6g；
3
CE
毛细管电泳
染色
在蛋白质染色方法中，目前以考马斯亮蓝 染色最为常用，考马斯亮蓝灵敏度每条带 0.1-1ug；还有灵敏度较高的银染。
处理方式
WB
蛋白质印迹法（免疫印迹试验） 通过特异 性抗体对凝胶电泳处理过的蛋白质分子样 品进行着色。
SDS-PAGE
SDS-PAGE电泳凝胶中各主要成分的作用 聚丙烯酰胺的作用:丙烯酰胺为蛋白质电泳提供载体，其凝固的好坏直接 关系到电泳成功与否，与促凝剂及环境密切相关; 制胶缓冲液: 选择Tris-HCl系统，浓缩胶选择pH6.8，分离胶选择pH8.8 ，TEMED与AP: AP 催化剂，催化单丙和双丙聚合成聚丙烯酰胺。TEMED四 甲基乙二胺，催凝剂，加速AP催化作用; 十二烷基磺酸钠(SDS): 阴离子去污 剂，作用有四: 去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋白分子内的疏 水作用、去除多肽折叠。
我们毕业啦
其实是答辩的标题地方
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分子质量的对数与其相应的迁移率之间的关系，绘制分子质
量的标准曲线，然后根据PAR质粒DNA片段的迁移率，参照标 准曲线，最终测出PAR质粒DNA的分子质量
二、半干式聚丙烯酰胺凝胶电泳(分离DNA)
半干式PAGE是由水平式PAGE演变出来的。电泳时，使用的
缓冲液量很小(数毫升~数十毫升)，因而得名
离子强度过高，则会降低颗粒的泳动速度。若离子强度过低，
则缓冲能力差，往往会因溶液pH值变化而影响泳动度的速率 (3)溶液黏度
泳动度与溶液黏度是成反比关系
4．电 渗
当支持物(琼脂、毛细管柱)不是绝对惰性物质时，常常 会因支持物上存在的离子基团如羧基、磺酸基、羟基、硅醇 基等吸附电极溶液中的正离子(如 H+ )，使靠近支持物的溶 液层相对带电。在电场作用下，此溶液层会向负极移动。反
f 6 r
E q v 6
从公式看出，带电颗粒在电场中泳动的速度与电场强
度和带电颗粒的净电荷量成正比，而与颗粒半径和介质黏
度成反比
（三）泳动度(m)或迁移率
d t d l （厘米2/伏特•秒） m v E V t l
式中d 为带电颗粒泳动的距离(cm)；l 为支持物的有效长 度(cm)；t为通电时间(秒)；V为加在支持物两端的实际电 压(V)
由于pro-的有效泳动率恰好介于快离子和慢离子之间，因而就聚集在 此移动界面附近，并浓缩成一个狭窄的中间层（其浓缩的程度与样品本 身的浓度无关，而与系统Cl- 浓度成正比）
2.电荷效应 带电颗粒在电场中的泳动速度与其本身所带的电荷量成 正比，与颗粒的分子质量成反比 3.分子筛效应
4．观察 取出经溴化乙锭(EB)染色的凝胶板，在254nm紫外灯下观 察，存在核酸的部位呈现红色荧光谱带，欲照相时，须在相 机镜头上加红色滤光片 未用EB染色的凝胶板也可用银染液或焦宁Y、甲烯蓝等试 剂染色(其配方见表18-27)，用肉眼直接观察
5．应用实例
采用琼脂糖凝电泳测定细菌质粒DNA的分子质量 电泳毕，在紫外灯下观察，PAR质粒DNA产生16条核酸片段， λ DNA产生6条片段。它们的分子质量见表18-28。以DNA片段
选择低熔点的琼脂糖较好。其原因是，前者熔点是80~90℃，
此温度会导致双链DNA解链。而后者熔点则＜65℃，30℃即可 形成凝胶，此温度不会破坏天然DNA结构
一、琼脂糖凝胶电泳
1．缓冲液的配制
在配制电泳缓冲液时，都需加适量的EDTA， 其原因是
①除去二价金属离子 ②硼酸与琼脂糖易形成复合物，使凝胶带负电荷，可能会
化学聚合与光聚合比较
化学聚合的凝胶孔径比光聚合的小，重复性和透明度 也较好；但化学聚合的引发剂为强氧化剂，残存于凝胶 中往往会使某些蛋白质分子丧失活性，或者产生畸变的 电泳图谱
（二）PAGE的分离原理
1.浓缩效应 在电泳初期，盐酸几乎全部解离出Cl-,Gly(pI=6.0)只有0.1~1%解离释 放出Gly-,而酸性蛋白质一般在浓缩胶中解离为pro-.三种离子带相同性质 的电荷，并同时想阳极移动，其有效泳动率为 mCl aCl ＞m蛋 a蛋 ＞m甘 a甘 ， 式中m代表泳动率，a代表解力度，ma代表有效泳动率。电泳进行时， Cl（快离子）移动速度快，其后形成一个低离子浓度区域，即低电导区域 或高电场强度区域（电场强度与电导成反比），致使pro-和Gly-加速移动； 当三种离子的泳动速度相同时，在快离子和慢离子之间形成一个稳定而 又不断向阳极移动的界面
常压
高压
500v以下
500v以上
2~5v/cm
50~200v/cm
3.根据电泳系统组成是否均一分：连续、不连续电泳
连
续
均相电泳
多相电泳
不连续
4．根据是否采用支持物分为 显微电泳 用显微镜直接观察细胞等大颗粒物质电泳行为的过程 自由界面电泳 是胶体溶液的溶质颗粒经过电泳后，在胶体溶液和溶剂
之间形成界面的电泳过程
第三节 琼脂糖凝胶和半干式聚丙烯酰胺凝胶电泳
通常情况下，核酸类物质的分离、鉴定是采用琼 脂糖凝胶(作支持物)电泳法进行的。但有时特别是 当分离核酸和测定其分子质量时，也可采用琼脂糖聚丙烯酰胺凝胶或聚丙烯酰胺凝胶电泳法进行
用琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离线性DNA(L-DNA) 时，其迁移率与该物分子质量的关系密切，而与结构和碱基
3．加样和电泳
将琼脂糖凝胶板平移至水平式电泳槽中，注入缓冲液(液面
高于胶面)，接通电源，在负极端每平方厘米的样品孔(深
≤3mm)中加核酸样品10~50μ g，体积可达200μ l(在此前，样 品中应先加示踪染料，其配方见表18-26中)，当样品进入凝胶 后，使其维持在6V／cm左右。当溴酚蓝(最常用的示踪染料)移 至阳极端时，关闭电源
6．筛孔 泳动速度与筛孔大小成反比
第二节 聚丙烯酰胺凝胶电泳
概 述
聚丙烯酰胺凝胶是以丙烯酰胺为单体，通过胶联剂（双体
甲撑双丙烯酰胺）聚合而成的含酰胺基侧链的的脂肪族长链，
然后通过甲撑桥将单链连接形成三维网状结构物质 聚丙烯酰胺凝胶电泳是在淀粉凝胶电泳的基础上发展起来 的，但与淀粉凝胶电泳和琼脂糖凝胶电泳相比，具有孔径大小 可调、机械强度好、弹性大、分辨率高和重复性好等优点。故 其在生物大分子物质的分离纯化和鉴定过程中使用广泛
吸附带正电荷的物质
2．琼脂糖胶板的制备
①称取一定量的琼脂糖盛入玻璃瓶中，按所需凝胶浓度加适量 的电极缓冲液，用棉塞将瓶口塞紧 ②置消毒锅(4.4×104Pa)处理15min，或在沸水浴中加热熔化 0.5h，或在微波炉熔化(时间不宜长) ③待溶液冷却到60℃左右，加入溴化乙锭溶液(取自用蒸馏水 配制的10mg／ml的贮备液，4℃存放)，令浓度为0.5μ g／ml， 摇匀 ④将“梳子”固定于玻板适当位置上，倒胶，使其厚度为3mm ⑤室温放置30~45min后，小心地移走“梳子”和模框，即制 成了琼脂糖凝胶板
5．焦耳热
Q I Rt
2
式中R为电阻；t为电泳时间；I为电流强度。公式表明，
电泳过程中释放出的热量与电流强度的平方成正比 电泳过程中释放出的热量与电流强度的平方成正比。当
电场强度或电极缓冲液以及样品中离子强度增高时，电流
强度会随着增大；这不仅降低分辨率，影响泳动速度，而 且在严重时会烧断滤纸或融化琼脂糖凝胶支持物。
的电场强度 (E)，它们之间的关系可用下式表示
F Eq
（二）泳动速度
由于F的作用，使带电颗粒在电场中向一定方向泳动；此 颗粒在泳动过程中还受到一个相反方向的摩擦力(f·υ )阻 挡；当这两种力相等时，颗粒则以均匀速度(υ )向前泳动
F E q v f f
式中f为摩擦系数。根据Stoke公式，阻力大小取决于带 电颗粒的大小、形状以及所处介质的黏度，即
之，若支持物的离子基团吸附溶液中的负离子，则溶液层会
向正极移动。这种溶液层的泳动现象称为电渗 当颗粒的泳动方向与电渗方向相同时，电渗会加快颗粒
的泳动速度；反之，若颗粒的泳动速度与电渗方向相反时，
电渗会降低泳动速度
若选用的支持物不合适，当电场力等于甚至小于电渗力 时，则颗粒泳动速度为零甚至向反方向移动
半干式PAGE使用的装置见图18-9,其结构由含铂金丝盖板 (称上架)、电泳槽(盛冷却水)、冷却板(称下架，摆放凝胶)和 电极桥(滤纸条或琼脂条)等部件组成 特点 电泳缓冲模板封底
制备凝胶
点样与电泳
第四节 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳
基本概念
变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 在聚丙烯酰胺凝胶中加入适量十二烷基磺酸钠(SDS)或尿 素，或SDS-尿素后，用其作支持物进行(分离检测大分子样 品)的凝胶电泳称为变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 应用 用于单链DNA、寡核苷酸片段以及蛋白质亚基、膜蛋白、 肽类等物质的分析，还可用于研究大分子物质的折叠结构等 方面
一、聚丙烯酰胺凝胶制备
1.组成 单体:丙烯酰胺（Acr,a） 双体:甲撑双丙烯酰胺（Bis,b） 2.聚丙烯酰胺和双丙烯酰胺用量的确定 （1）总浓度 单体和双体在凝胶中的总浓度（T）。
ab T% 100 % m
T↑： 机械强度增大，筛孔、透明度、弹性降低
T↓： 机械强度减小，筛孔、透明度、弹性增加
区带电泳 是样品物质在一惰性支持物上进行电泳的过程。因电泳
后，样品的不同组分可形成带状的区间，故称区带电泳，
亦称区域电泳
5.根据支持物不同分为 纸电泳、膜电泳和凝胶电泳等
第一节 基本原理
一、带电颗粒在电场中泳动的速度
（一）电场力 当把一个带净电荷(q)的颗粒放人电场时，便有一个电场 力(F)作用于其上。 F的大小取决于颗粒净电荷量及其所处
的应用
目 的
掌握电泳的基本原理 掌握琼脂糖凝胶和半干式聚丙烯酰胺凝胶电泳 掌握变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 掌握印记法(转移电泳)
电泳基本概念
电泳是带电颗粒在电场作用下，向着与其电荷相反的 电极移动的现象
电泳的分类
1.根据样品的多少分：分析、制备电泳 2.根据电压的高低分：常压、高压电泳
（2）交联度
双体占总浓度的百分比（C）
b C% 100 % ab
当a∶b＜10，变硬、乳白色；a∶b ＞ 100，呈糊状、易断裂 （3）经验公式 T恒定时 例如： T = 5% T↑ C↓ C↓ 孔径变大 则 C = 6.5 - 0.3×T C = 6.5 - 0.3×5 = 5%
T恒定为5～20%
组成却无关(这也是采用凝胶电泳法测定核酸分子质量的依
据所在) 若用聚丙烯酰胺凝胶分离核蛋白时，应在低浓度聚丙烯 酰胺凝胶(约2.5％)中掺人适量的琼脂糖,这样既能增大凝胶 的强度，又可提高分辨率。其凝胶配制方法见表18-24
一般在进行核酸类物质的分离、鉴定时，使用较纯的无电 渗力之琼脂糖为宜，而在实施这类物质的制备或回收时，则