脉冲场凝胶电泳实验流程
pfge脉冲场凝胶电泳具体操作
pfge脉冲场凝胶电泳具体操作PFGE（Pulsed Field Gel Electrophoresis）是一种高分辨率的凝胶电泳技术，可用于分离和检测大分子量DNA片段。
该技术常用于研究基因组结构、遗传变异和DNA断裂等领域。
下面将详细介绍PFGE的具体操作步骤。
1. 准备DNA样品:a. 从细胞中提取DNA。
可以使用标准的DNA提取方法，如酚/氯仿法或商用DNA提取试剂盒。
b. 用酶切酶或限制酶对DNA进行切割。
选择使DNA在所需大小范围内切割的酶，以便获得所需的DNA片段。
2. 制备凝胶:a. 准备1% - 2% 的琼脂糖溶胶。
将所需琼脂糖加入TE缓冲液中，并在适当的温度下加热搅拌，直到完全溶解。
b. 将琼脂糖溶胶倒入制作凝胶的模具中。
在模具顶部放置梳子以制作凝胶槽，并确保梳子的位置水平。
c. 让凝胶固化。
根据琼脂糖溶胶中指定的温度和时间，将模具放入冰箱或培养箱中，使凝胶完全固化。
3. 负载和电泳样品:a. 准备DNA样品。
将所需比例的DNA标记物和DNA样品混合，并加入适量的加载缓冲液，如Bromophenol Blue。
b. 用吸管吸取混合物，并将其轻轻注入凝胶槽中的样品孔中。
确保尽量避免气泡进入凝胶槽。
c. 启动电泳。
电泳前，确保样品中有足够的时间固定在凝胶上。
启动电源，并将电流设置为所需的值。
4. 设置电泳条件:a. 选择适当的电泳缓冲液。
常用的电泳缓冲液包括TBE缓冲液（三硼酸钠缓冲液）和TAE缓冲液（乙醋酸/三乙酸片性缓冲液）。
b. 设置电泳条件，如电流密度，脉冲时间和频率等。
这些条件可以根据所研究的DNA分子量和所使用的电泳设备进行调整。
5. 进行电泳:a. 启动电泳设备，确保电泳条件设置正确，并在所需时间内运行电泳。
b. 当电泳结束时，关闭电源，并小心地取出凝胶，以免损坏样品。
6. 可选的染色和可视化:a. 将凝胶放入染色缓冲液中，如溴化乙锭溶液，使DNA可被视觉化。
b. 在染色缓冲液中搅拌凝胶，确保各个区域充分染色。
脉冲场凝胶电泳
脉冲场凝胶电泳脉冲场凝胶电泳近年来，以脉冲场凝胶电泳(Pulsed field gel electrophoresis，PFGE)为代表的分子生物学分型方法日渐受到青睐，其原理为通过一定的方法，直接或间接反映病原体变异分化的本质即DNA序列的改变，从而做到微观变化的宏观显示。
电泳结果通常是条带图谱。
该方法的发展成熟为监测控制细菌的流行提供了广阔的前景。
通过分型可以鉴定比较菌株是否一致，对于细菌性传染病监测、传染源追踪、传播途径调查和识别等暴发调查有着非常重要的意义。
一、脉冲场凝胶电泳的原理PFGE与常规电泳的不同之处在于，常规的电泳采用的是单一的均匀电场，DNA分子经凝胶的分子筛作用负极移向正极。
而PFGE采用了两个交变电场，即两个电场交替地开启和关闭，使DNA分子的电泳方向随着电场的变化而改变。
正是因为电场方向的交替改变，才使大分子DNA得以分离。
图l是根据Carle和Olson最初设计的正交场电泳装置(orth-ogona1 field gel electrophoresis，OFA-GE)绘制的PFGE 示意图。
A、B代表两个交替开启和关闭的电场。
当A电场开启时，B电场关闭，DNA分子从A电场的负极(A-)向正设(A+ )移动；当B电场开启时，DNA分子改变原来的运行方向，随B电场负极向正极移动。
这样，随着电场方向的交替变化DNA分子图1 PGE的原理(OFAGE系统) A、B代表两电场即呈“Z” 字形向前移动。
目前的理论和实验研究表明，当某一电场开启时，DNA分子即顺着此电场的方向纵向拉长和伸展，以“蛇行”(reputation)的方式穿过凝胶孔。
如果电场方向改变DNA分子将必须先调转头来，才能沿着新的电场方向泳动。
这样，随着电场方向反复变化，伸展的DNA分子必须相应地变化移动方向。
可以想象，较小的分子能相当快速地适应这种变化，但大分子则需更多的时间来改变方向，而真正用于前移的时间相对减少，从而将不同大小的分子分开。
BIO-RAD脉冲场电泳介绍
﹡这一独具的高分辨力使PFGE的应用范围已涉及到几乎所有生 物基因组结构的研究。
脉冲场电泳（PFGE）的原理
PFGE的原理
PFGE的基本原理是对琼脂糖凝胶外加交变的脉冲电场,其方向 、时间和电流大小交替改变,每当电场方向发生改变时,大分子DNA 便滞留在凝胶孔内,直至沿新的电场轴重新定向后,才能继续向前泳 动,DNA分子越大,这种重新定向需要的时间就越长,当DNA分子改 变方向的时间小于脉冲时间时,DNA就可以按照其分子量大小分开, 经EB染色后在凝胶上出现按DNA大小排列的电泳带型。
一、PFGE在分子分型方面的应用 通过微生物分型可以鉴定菌株是否一致、比较它们的亲缘
关系,对于细菌性传染病的监测、传染源追踪、传播途径的调查 和识别有着非常重要的意义。
传统的微生物分型技术主要是基于表型特性分类,如生化分 型(biotyping)、血清学分型(serotyping)、耐药谱测定(antmi icrobial susceptibility testing)、噬菌体分型(bacterialphage typing) 等。由于微生物易受环境的影响,很容易改变其表达性状,使得表 型分类很不准确。
CHEF-DR III
脉冲场电泳系统的配件
脉冲场电泳（PFGE）的实验流程
Cultured Cells
Unicellular Organisms
Harvest Cells
Tissues
Dissociate
Wash Cell Suspension
Determine Cell Concentration Resuspend to needed Concentration
PFGE实验的标准流程
大肠杆菌0157、沙门菌和痢疾杆菌脉冲场凝胶电泳实验步骤提前准备从检测培养基上挑取单菌落，接种于含5%去纤维蛋白羊血的胰化大豆琼脂（TSA-SB）平板（或相当的培养基）上培养，37℃孵育箱培养14-18小时；用同一个接种针/环,穿刺或接种于小螺帽管中的TSA、HIA或相似培养基，以保证必要时重复检测同一个克隆。
同时接种标准株H9812。
第一天步骤1 细菌的包埋1、打开水浴摇床（54℃）、水浴箱（56℃）。
2、用TE缓冲液（具体试剂配方见附件）制备1%Seakem Gold:1%SDS琼脂糖.以配置25ml体积为例说明,方法如下:1)准确称取0.25g Seakem Gold agarose,放入250ml的蓝盖瓶中.2)加入22.5mlTE缓冲液,轻柔摇荡瓶子使琼脂均匀散开.3)微松盖瓶,将玻璃瓶放入微波炉内搞活加热30秒,取出轻柔摇荡,再次加热30秒,重复操作直至琼脂彻底溶解(无颗粒物、悬浮物、透光均一，无明显异常折光，无气泡)4)将溶解的Seakem Gold agarose放入56℃（55-60℃均可）水浴箱内至少15分钟，再加入预热到56℃的10%SDS溶液2.5ml,置于56℃水浴箱备用.3、在Falcon2054管(或其他相当的管)上标记样品名称和空白对照;在1.5ml微量离心管上标记好对应样品的名称.4、在Falcon2054管中分别加入约2ml细胞悬浊液CSB(配方见附件).注:使用测定细菌浓度的容器不同加入CSB的量也不同.5、用CSB湿润棉签，从培养皿上刮去适量细菌，均与悬浊于CSB中。
通过加入CSB稀释或增加菌量提高浓度，调整细胞悬液浓度至指定范围。
1）用比浊仪（bioMerieux Vitek colorimeter）测其浓度,并调整浓度至4.0-4.5麦氏单位.2）用分光光度计时,在610nm波长吸光度应在1.3-1.4.3）Dade Microscan Turbidity Meter:0.48-0.52(以Falcon2054管测量) 0.68-0.72(以Falcon2057管测量)注:在 4.0-4.5该范围内细菌的浓度都可得到较满意的实验结果,但过大的浓度差距会造成同一块胶上的条带亮度差异,影响条带的识别.6、取400ul细菌悬浊液于相应的1.5ml微量离心管中,置于37℃水浴中孵育5分钟.将剩余的细菌悬浊液置于冰上知道胶块制备完毕.7、从水浴箱中取出微量离心管,没管加入20ul蛋白酶K(储存液浓度20mg/ml)混匀,使其终浓度为0.5 mg/ml,蛋白酶K置于冰上备用.8、加入400ul的1%Seakem Gold:1%SDS到上述装有400ul细菌悬液的微量离心管内,用枪头轻轻混匀,避免有气泡产生.(此时1%Seakem Gold:1%SDS需置于56℃水浴中)9、迅速将混合物加入模具,避免气泡产生,在室温下凝固10-15分钟.为节省时间也可以在4℃下凝固5分钟.10、记录好模具内对应样品的名称。
凝胶电泳迁移率实验
凝胶电泳迁移率实验
凝胶电泳迁移率实验是一种常见的生物分子分离和分析技术。
该技术利用电场作用下生物大分子（如DNA、RNA、蛋白质等）在凝胶电泳板中的迁移速率不同，从而实现对不同分子的分离和检测。
实验步骤如下：
1. 制备凝胶电泳板：将琼脂糖、缓冲液和样品混合后倒入凝胶板中，待凝固后将电极插入凝胶板两端。
2. 加载样品：将待测生物分子样品加至凝胶板的孔洞中。
3. 进行电泳：开启电源，施加恒定电场，使生物分子在凝胶板中迁移。
4. 染色：将凝胶板浸泡于染色液中，使生物分子能够被可视化。
5. 检测：使用紫外线或螢光扫描仪等设备检测样品在凝胶板中的迁移距离和分子大小。
通过凝胶电泳迁移率实验，可以快速、准确地分离和检测生物分子，为生物医学、生物工程等领域的研究提供了重要的实验手段和依据。
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202X年脉冲场凝胶电泳(1)
2) 噬菌体载体DNA的分离
纯净病毒颗粒 病毒载体DNA
M13mp载体可采用质粒DNA的分离方法
第十二页，共三十八页。
二、RNA的分离与纯化
1. 制备RNA的关键—防止内外源RNase的作用
1) RNase的特点：抗酸抗碱,具很广pH作用范围; 抗高温严寒 (0~65℃均具活性）；抗变性剂
单子叶植物 151（玉米）~182kb（浮萍） 藻类 132（裸藻）~191kb（衣藻）
第八页，共三十八页。
1) DNA分离纯化过程
破碎细胞 + DNA抽提液(EDTA、去污剂、还原剂) 65℃温育
20’
冰浴冷却 离心去细胞碎片 苯酚抽提法①
CsCl密度梯度离心②
1) 苯酚抽提法 上清液 缓冲液用水饱和苯酚抽提2~3次 上层液相用氯仿抽 至界面无蛋白变性物 上层液相用两倍体积冷乙醇沉淀 沉 淀物用70%冷乙醇洗涤,干燥 溶于缓冲液 加入RNAase处理 除去RNA 苯酚氯仿抽提 沉淀干燥
2) 按电泳装置分: 水平式/琼脂糖凝胶; 竖式/聚丙烯酰胺凝胶
3) 两种方法比较：分离效果和分离范围; 操作难易
2. 用途
琼脂糖凝胶用于DNA和RNA的常规(chángguī)分析；聚丙烯酰胺凝胶常 用于小分子核酸分析。
3. 凝胶电泳的一般程序
制胶 点样 电泳 染色 观察
二、DNA电泳
1. DNA分子种类
288 kb
痘病毒
196 kb
质体 几~100以上kb
线粒体
藻类 线状
15kb
酵母 环状
19~78 kb
脉冲场凝胶电泳.
脉冲场凝胶电泳(PFGE实验原理、操作步骤和注意事项【实验原理】大分子DNA(一般长度超过20kb ，在某些情况下，超过40kb 在电场作用下通过孔径小于分子大小的凝胶时，将会改变无规卷曲的构象，沿电场方向伸直，与电场平行从而才能通过凝胶。
此时，大分子通过凝胶的方式相同，迁移率无差别(也称“极限迁移率”，不能分离。
脉冲场凝胶电泳技术解决了这一难题，它应用于分离纯化大小在10～2000kb 之间的DNA 片段。
这种电泳是在两个不同方向的电场周期性交替进行的，DNA 分子在交替变换方向的电场中作出反应所需的时间显著地依赖于分子大小，DNA 越大，这种构象改变需要的时间越长，重新定向的时间也越长，于是在每个脉冲时间内可用于新方向泳动的时间越少，因而在凝胶中移动越慢。
反之，较小的DNA 移动较快，于是不同大小的分子被成功分离。
在许多实用的PFGE 方法中，倒转电场凝胶电泳是最简单最常用的方法(FIGE。
通过把一个在不同电场方向有不同脉冲方式的脉冲电场加在样品上，倒转电场凝胶电泳(FIGE设备能把大小范围在10～2000kb 的DNA 片段分开。
FIGE 也可通过重新确定一个对准完全固定好角度的电场，这样会进一步扩展其分离极限达到10Mb 。
【仪器、材料与试剂】1. 制备DNA 样品所需材料1TEN 缓冲液(0.1mol/LTris，pH7.5；0.15mol/LNaCl；0.1mol/LEDTA。
2Seaplaque 琼脂糖(EC 缓冲液中浓度为2%。
3EC 缓冲液(6mol/LTris，pH7.5；lmol/L NaCl；0.5%4ESP 缓冲液(0.5mol/L EDTA，1%十二烷基肌氨酸钠，lmg/mL 蛋白酶K 。
5 溶葡萄球菌素(5mg/mL。
6RNase(10mg/mL。
7 胶模(由常规琼脂糖凝胶制得或购买成品。
8 苯甲基横酰氟(PMSF(17.4mg/mL 于乙醇中。
90.5μg/mL 溴化乙锭2. 分离、纯化大的DNA 片段所需材料1 紫外递质。
鲍曼不动杆菌脉冲场凝胶电泳实验步骤
鲍曼不动杆菌脉冲场凝胶电泳标准操作程序生物安全警告：所操作菌为条件致病菌，请按二级生物安全水平操作，转移和操作活菌时更要注意。
处理大量菌株，请在生物安全柜中进行。
以正确方式对接触培养物的塑料制品和玻璃制品进行消毒或丢弃。
开始操作之前，请阅读所有指导。
把所有接触过细胞悬液或凝胶块的塑料制品、玻璃制品、吸管、小铲等当作污染材料，按照实验室的生物要求丢弃或消毒。
可重复使用的制胶模具须在清洗前消毒；可丢弃的制胶模具及胶带和用来把凝胶块从样品孔中推出的小片，应该用10%漂白剂消毒30分钟以上，然后清洗和重复使用。
提前准备从检测培养基上挑取单菌落，接种于营养琼脂平板（或相当的培养基）上培养；用同一个接种针/环，穿刺或接种于小螺帽管中半固体培养基，以保证必要时重复检测同一个克隆。
37℃培养14-18小时。
第一天1、打开水浴摇床（54℃）、水浴箱（56℃）。
2、用TE缓冲液（具体试剂配制方法见附件）制备1%Seakem Gold：1%SDS琼脂糖，以配制25ml体积为例说明，方法如下：1）准确称取0.25g SeaKem Gold agarose, 放入250ml的蓝色瓶内。
2）加入22.5ml TE缓冲液，轻柔摇荡瓶子使琼脂均匀散开。
3）微松瓶盖，将玻璃瓶放于微波炉内高火加热30秒，取出轻柔摇荡，再次加热30秒，重复操作直至琼脂彻底溶解（无颗粒物、悬浮物，透光均一，无明显异常折光，无气泡）。
4）将溶解的SeaKem Gold agarose放入56℃（55-60℃均可）水浴箱内至少15分钟，再加入预热到56℃的10%SDS溶液2.5ml，置于56℃水浴箱备用。
3、在Falcon 2054管（或其他相当的管）上标记样品名称和空白对照；在1.5ml微量离心管上标记好对应样品的名称。
4、在Falcon 2054管中分别加入约2ml细胞悬浊液CSB（配制方法见附件）。
注：使用测定细菌浓度的容器不同加入CSB的量也不同。
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脉冲场凝胶电泳实验流程一、准备样品1. 琼脂糖包埋的样品常用的DNA提取方法不能得到完整的大分子量DNA。
大分子量DNA很脆弱，在制备过程中容易因移液等操作造成机械剪切。
将完整细胞包埋入琼脂糖后再进行裂解，去除蛋白的操作，可防止大分子量DNA的断裂。
琼脂糖块包埋的DNA可以避免被机械剪切，并且是一种简单的操作方法。
处理过的包埋有DNA的琼脂糖块可以直接放入琼脂糖凝胶的点样孔。
在将细胞包埋入琼脂糖之前要先确定细胞浓度，尽管吸光度很常用，但是并不可靠。
单位吸光度对应的细胞浓度会因菌株不同或培养基不同而有差异。
这会影响琼脂糖块中DNA的含量，导致上样量过大或不足。
不论细菌、真菌还是哺乳动物细胞，使用血球计数板均可得到准确和高重复性的细胞浓度。
Bio-Rad提供一次性的样品模具（货号：170-3713）。
每个模具可制备50个10 x 5 x 1.5 mm的琼脂糖胶块。
样品制备过程中的酶可以快速有效的扩散进入胶块，用Bio-Rad标准梳子制胶，胶块不需要修剪就可直接放入点样孔。
2. 液体样品小于200kb的DNA片断可以不用琼脂糖包埋，可直接以液体形式加入点样孔。
当操作的DNA大于50kb时，必须用大开口的吸头。
如果只电泳液体样品，使用厚度0.75 mm的梳子可以获得更锐利的条带和更高的分辨率。
3. 制备琼脂糖包埋的哺乳动物DNA该方法中用到的缓冲液，酶和琼脂糖均包含于试剂盒CHEF Mammalian Genomic DNA Plug Kit （货号：170-3591）。
1)将细胞悬浮于等渗盐溶液或不含血清的培养基中并置于冰上。
用血球计数板对细胞计数，每毫升琼脂糖块需要5 x 107个细胞，每个10 x 5 x 1.5 mm的样品块需要0.1 mL琼脂糖。
2)准备2% CleanCut™琼脂糖（货号：170-3594），用微波炉融化并置于50 °C水浴。
3)1000g、4 °C离心细胞悬液5分钟，用琼脂糖块一半体积的细胞悬浮缓冲液（10 mM Tris, pH 7.2,20 mM NaCl, 50 mM EDTA）重悬细胞并置于50 °C水浴。
4)将细胞悬液与等体积的2% CleanCut琼脂糖轻揉且彻底混匀并放回50 °C水浴，用移液器将混合物加入样品模具。
静置使琼脂糖凝固，可以将模具置于4 °C冰箱10-15 min，这样可以加速凝固并增加琼脂糖的强度以方便从模具中移出。
5)使用50 mL离心管，每1 mL琼脂糖块加入5 mL蛋白酶K反应液（100 mM EDTA, pH 8.0, 0.2%sodium deoxycholate, 1% sodium lauryl sarcosine, 1 mg/mL Proteinase K）。
将凝固的琼脂糖块从模具中捅入盛有蛋白酶K反应液的50 mL离心管中。
于50 °C水浴中消化过夜，不需要振荡。
注：根据细胞特性不同，有的样品需要延长消化时间至4天，但这并不会损伤DNA。
6)用50 mL洗涤缓冲液（20 mM Tris, pH 8.0, 50 mM EDTA）洗涤琼脂糖块4次，于室温轻柔振荡，每次30-60 min。
如果样品接下来要进行限制性内切酶消化，建议在第2、3次洗涤时加入1 mMPMSF使残余的蛋白酶K失活。
7)琼脂糖块可于4 °C保存3个月至1年。
8)琼脂糖块可于洗涤缓冲液中长期保存，但必须在限制性内切酶消化前降低EDTA浓度。
请在酶切前用10倍稀释的洗涤缓冲液或TE（10 mM Tris, 1mM EDTA, pH8.0）洗涤琼脂糖块30分钟。
4. 制备琼脂糖包埋的细菌DNA该方法中用到的缓冲液，酶和琼脂糖均包含于试剂盒CHEF Bacterial Genomic DNA Plug Kit （货号：170-3592）。
1)用50mL LB培养基或其他培养基培养细菌至OD600到达0.8 - 1.0。
2)当OD600到达0.8 - 1.0，加入氯霉素至终浓度180μg/m L并继续培养1小时注：氯霉素可使不同细菌个体间染色体复制同步化并抑制染色体下一轮的复制。
本步骤为可选步骤，但省略此步骤会导致靠近染色体复制终点的区域含量较低。
过长时间的氯霉素处理会导致细胞形态变化，因此请迅速进入下一步操作。
3)将上步得到的细菌培养液稀释20倍计数：取10μL上步得到的细菌培养液，加入20μL GramCrystal Violet和170μL PBS，用血球计数板在400倍镜下计数。
4)准备2% CleanCut™琼脂糖（货号：170-3594），用微波炉融化并置于50 °C水浴。
5)每毫升琼脂糖块需要5 x 108个细菌。
离心收集细菌，并用琼脂糖块一半体积的细胞悬浮缓冲液（10 mM Tris, pH 7.2, 20 mM NaCl, 50 mM EDTA）重悬细胞并置于50 °C水浴。
注：有些细菌对EDTA浓度或悬浮缓冲液的渗透压敏感，并因此而提前裂解，这将导致DNA不适合脉冲场凝胶电泳。
有些细菌如Enterococci需要悬浮缓冲液中含有1M NaCl才能防止因渗透压导致的裂解。
又如Pseudomonas对EDTA浓度敏感，需要对悬浮缓冲液进行稀释才能避免过早裂解。
尽管大多数的细菌不需要改变悬浮缓冲液，但还是要尽可能快地完成细菌包埋。
6)将细胞悬液与等体积的2% CleanCut琼脂糖轻揉且彻底混匀并放回50 °C水浴，用移液器将混合物加入样品模具。
静置使琼脂糖凝固，可以将模具置于4 °C冰箱10-15 min，这样可以加速凝固并增加琼脂糖的强度以方便从模具中移出。
7)用50mL离心管，每1 mL琼脂糖块加入5mL lysozyme反应液(10 mM Tris, pH 7.2, 50 mM NaCl,0.2% sodium deoxycholate, 0.5% sodium lauryl sarcosine, 1 mg/mL lysozyme)。
将凝固的琼脂糖块从模具中捅入盛有lysozyme反应液的50 mL离心管中。
于37 °C水浴中消化30到60分钟，不需要振荡。
注：有些细菌如Staphylococcus aureus对lysozyme不敏感，因此需用lysostaphin代替lysozyme。
8)倒掉lysozyme反应液并用25mL洗涤缓冲液（20 mM Tris, pH 8.0, 50 mM EDTA）洗涤琼脂糖块。
每1 mL琼脂糖块加入5 mL蛋白酶K反应液（100 mM EDTA, pH 8.0, 0.2% sodium deoxycholate,1% sodium lauryl sarcosine, 1 mg/ml Proteinase K）。
于50 °C水浴中消化过夜，不需要振荡。
注：根据细胞特性不同，有的样品需要延长消化时间至4天，但这并不会损伤DNA。
9)用50 mL洗涤缓冲液（20 mM Tris, pH 8.0, 50 mM EDTA）洗涤琼脂糖块4次，于室温轻柔振荡，每次30-60 min。
如果样品接下来要进行限制性内切酶消化，建议在第2、3次洗涤时加入1 mMPMSF使残余的蛋白酶K失活。
10)琼脂糖块可于4 °C保存3个月至1年。
11)琼脂糖块可于洗涤缓冲液中长期保存，但必须在限制性内切酶消化前降低EDTA浓度。
请在酶切前用10倍稀释的洗涤缓冲液或TE（10 mM Tris, 1mM EDTA, pH8.0）洗涤琼脂糖块30分钟。
5. 制备琼脂糖包埋的酵母DNA该方法中用到的缓冲液，酶和琼脂糖均包含于试剂盒CHEF Yeast Genomic DNA Plug Kit （货号：170-3593）。
1)用50mL到100mL YPG培养基或其他培养基培养酵母至OD600超过1.0。
2)当OD600达到1.0，5000g、4 °C离心10分钟收集酵母。
并用10mL冰冷的50mM，pH8.0的EDTA溶液重悬酵母。
3)取10μL酵母悬液加入990μL水，用血球计数板于400倍镜下计数。
4)准备2% CleanCut™琼脂糖（货号：170-3594），用微波炉融化并置于50 °C水浴。
5)每毫升琼脂糖块需要6 x 108个真菌。
离心收集真菌，并用琼脂糖块一半体积的细胞悬浮缓冲液（10 mM Tris, pH 7.2, 20 mM NaCl, 50 mM EDTA）重悬真菌并置于50 °C水浴。
6)在酵母悬液中加入Lyticase至1 mg/mL，并立即进行下一步。
注：有些酵母在包埋后用Lyticase消化效果不佳，故推荐在包埋前将Lyticase加入酵母悬液。
7)将细胞悬液与等体积的2% CleanCut琼脂糖轻揉且彻底混匀并放回50 °C水浴，用移液器将混合物加入样品模具。
静置使琼脂糖凝固，可以将模具置于4 °C冰箱10-15 min，这样可以加速凝固并增加琼脂糖的强度以方便从模具中移出。
8)用50mL离心管，每1 mL琼脂糖块加入5mL lyticase反应液(10 mM Tris, pH 7.2, 50 mM EDTA, 1mg/ml lyticase)。
将凝固的琼脂糖块从模具中捅入盛有lyticase反应液的50 mL离心管中。
于37 °C水浴中消化30到60分钟，不需要振荡。
9)倒掉lyticase反应液并用25mL洗涤缓冲液（20 mM Tris, pH 8.0, 50 mM EDTA）洗涤琼脂糖块。
每1 mL琼脂糖块加入5 mL蛋白酶K反应液（100 mM EDTA, pH 8.0, 0.2% sodium deoxycholate,1% sodium lauryl sarcosine, 1 mg/ml Proteinase K）。
于50 °C水浴中消化过夜，不需要振荡。
注：根据细胞特性不同，有的样品需要延长消化时间至4天，但这并不会损伤DNA。
10)用50 mL洗涤缓冲液（20 mM Tris, pH 8.0, 50 mM EDTA）洗涤琼脂糖块4次，于室温轻柔振荡，每次30-60 min。
如果样品接下来要进行限制性内切酶消化，建议在第2、3次洗涤时加入1 mMPMSF使残余的蛋白酶K失活。
11)琼脂糖块可于4 °C保存3个月至1年。
12)琼脂糖块可于洗涤缓冲液中长期保存，但必须在限制性内切酶消化前降低EDTA浓度。
请在酶切前用10倍稀释的洗涤缓冲液或TE（10 mM Tris, 1mM EDTA, pH8.0）洗涤琼脂糖块30分钟。
6. 加快样品制备过程在某些情况下，上面的流程可以简化以加快样品制备速度。