高效液相色谱法测定粮食中玉米赤霉烯酮及其代谢物

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免疫亲和净化－超高效液相色谱－串联质谱法测定食品中玉米赤霉烯酮类真菌毒素

免疫亲和净化－超高效液相色谱－串联质谱法测定食品中玉米赤霉烯酮类真菌毒素作者：宁阳阳来源：《中国食品》2021年第21期当前在玉米赤霉烯酮类的真菌毒素检测中，使用液相色谱和液相色谱-质谱的方法较多，本文则构建了一种针对食品中6种玉米赤霉烯酮类真菌毒素的免疫亲和净化-超高效液相色谱-串联质谱检测法，包括玉米赤霉酮、α-玉米赤霉烯醇、β-玉米赤霉醇、α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉烯醇、玉米赤霉烯酮。

本检测方法的前处理工序非常简便，利用免疫亲和柱进行净化及液标法进行定量，能够同时测定6种玉米赤霉烯酮类真菌毒素。

除了谷物以外，本检测方法还能应用于肉、蛋、乳等食品的检测。

一、材料和仪器1.材料和试剂。

（1）样品：在市场购买大米、麦片、牛肉、猪肉脯、鸡蛋、牛奶等当作样品，大米和麦片研磨成粉，牛肉和猪肉脯捣碎，鸡蛋和牛奶混匀。

（2）试剂：乙腈，色谱纯;乙酸钠，分析纯;玉米赤霉酮标准品、α-玉米赤霉烯醇标准品、β-玉米赤霉醇标准品、α-玉米赤霉醇标准品、β-玉米赤霉烯醇标准品、玉米赤霉烯酮标准品;玉米赤霉烯酮类免疫亲和柱;β-葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯。

（3）标准储备溶液：称取10mg玉米赤霉烯酮类的各种标准品，置于10mL棕色容量瓶中，利用乙腈进行溶解后定容，制成1mg/mL的标准储备溶液，在-18℃的条件下避光保存。

（4）混合标准溶液：取100μL上述制成的各类标准储备溶液，利用乙腈定容至10mL，制作成10μg/mL的混合标准溶液，在-18℃的条件下避光保存。

2.仪器。

GM200型刀式研磨仪;ACQUITYTM超高效液相色谱-TQS质谱仪;组织捣碎机;T18均质器。

二、实验和方法1.样品处理方法。

（1）谷物。

取粉碎样品25g，添加氯化钠5g，再添加体积分数为80%的乙腈溶液100mL，搅拌提取2min，然后放于离心管（50mL）中，4000r/min离心5min。

取10mL上层提取液，加水40mL并混匀，10000r/min离心5min。

超高效液相色谱法快速检测粮食中玉米赤霉烯酮的含量

Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｇｒａｉｎ；ｚｅａｒａｌｅｎｏｎｅ（ＺＥＮ）；ｕｌｔｒａ —ｈｉｇｈｐｅｆｒｏｍａｒｎｃｅｌｉｑｕｉｄｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ（ＵＰＬＣ）；ｉｍ—
ａｄｖａｎｔａｇｅｓｏｆｓｉｍｐｌｉｃｉｔｙ，ｒａｐｉｄｎｅｓｓ，ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ，ｇｏｏｄｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｉｌｉｔｙ，ａｎｄｌｅｓｓｓｏｌｖｅｎｔ．
ＲａｐｉｄｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｚｅａｒａｌｅｎｏｎｅｉｎｇｒａｉｎｂｙＵＰＬＣ
ＸＩＥＧａｎｇ，ＷＡＮＧＳｏｎｇ—ｘｕｅ，ＣＵＩＨｕａ，ＺＨＡＮＧＹａｎ，ＬＩＲｕｉ
（Ｒ）ｏｆ０．９９９９．Ｒｅｃｏｖｅｒｙｒａｔｅｓｉｎｇｒａｉｎｓ（ｗｈｅａｔ，ｃｏｒｎ）ｓｐｉｋｅｄｗｉｔｈＺＥＮｗａｓｉｎｔｈｅｒａｎｇｅｏｆ８５％一
ＺＥＮ）的方法。ＺＥＮ的保留体积为０．４７ｍＬ，检出限为５ｐｇ，在１０～５００．０Ｐｇ范围内呈线性相关，相关系数Ｒ值为０．９９９９；在小麦、玉 பைடு நூலகம்样品中的加标回收率分别为８５％～１０２％和８３％～１ｌ２％，精密

C18固相萃取柱净化-超高效液相色谱法检测谷物中玉米赤霉烯酮

米、大麦、小米和燕麦等谷物中，主要作用于生殖系
有特异、快速等特点，可用于大批量样品的筛选；但检测结果重复性差，容易交叉反应，从而造成样品假阳性。高效液相法是目前最常用的检测方法，其特
ｚｅａｒａ［ｅｎｏｎｅｉｎｃｏｒｎｗａｓｅｓｔａｂｉｓｈｅｄ．Ｔｈｅｓａｍｐｌｅｗａｓｅｘｔｒａｃｔｅｄｗｉｔｈｍｅｔｈｙｔａｔｃｏｈｏｌ－ｗａｔｅｒ（ｖ／ｖ＝８０：２０），ｐｕｒｉｆｉｅｄｂｙＣ喁ｓｏｌｉｄ
ＤｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｚｅａｒａｌｅｎｏｎｅｉｎｃｏｒｎｂｙＵＰＬＣｗｉｔｈＣｌ８ｓｏｌｉｄｅｘｔｒａｃｔｃｏｌｕｍｎｃｌｅａｎｉｎｇ
郁等。
目前玉米赤霉烯酮的前处理净化技术主要包括
不仅柱效更高，而且通过改进仪器条件，可以使分离时间更短，峰容量更大，能够更好地满足复杂样品对
分离分析的要求。
液一液萃取和固相萃取等，前者操作繁琐，需要使用
（陕西省粮油产品质量监督检验所，陕西西安７１００１６）
摘
要：建立了谷物中玉米赤霉烯酮的Ｃ固相萃取柱净化一超高效液相色谱检测方法。样品经甲醇一ＮａＣ１水溶液

分子印迹亲和净化-高效液相色谱法测定玉米中玉米赤霉烯酮

ｐｉｎｒｔｉｎｇａｆｉｆｎｉｔｙＰｕｒｉｉｆａｔｉｏｎｃｏｌｕｍｎｃａｎｂｅｒｅ—ｕｓｅｄｓｅｖｅｒａｌｔｉｍｅｓｗｉｔｈｎｏｌｅｓｓｔｈａｎ８０％ｏｆｒｅｃｏｖｅｙｒｒａｔｅ．
ＰＥＩＲｕｉ —ｌｉ，ＬＩＵＪｉａ—ｐｅｎｇ，ＷＡＮＧＹｉｎｇ
（１．ＨｅｂｅｉＰｒｏｖｉｎｃｅＧｒａｉｎａｎｄＯｉｌＱｕａｌｉｔｙＴｅｓｔｉｎｇＣｅｎｔｅｒ，Ｓｈｉｊｉａｚｈｕａｎｇ０５００２１；２．Ｈｕａ—ａｎＭａｇｎｅｃｈＢｉｏ—ＴｅｃｈＣｏ．，Ｌｔｄ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１０２２００）
ａｎｄ９２．９％，９０．７％ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙｆｏｒｔｈｅｂｌａｎｋｓａｍｐｌｅｓａｄｄｅｄｗｉｔｈ６０ｇ／ｋｇａｎｄ５００￣ｇ／ｋｇ，ｎｄａｍｏｌｅｃｌａｕｒｉｍ－
疑致癌性等¨ ］，因此，检测并监控玉米赤霉烯酮在
由于免疫亲和色谱产品中的主要成分是生物抗体，
其活性在使用后会有部分丧失，故不适合多次重复
刀菌、三线镰刀菌和雪腐镰刀菌等菌种产生的有毒代谢产物，主要存在于玉米和玉米制品中，小麦、大麦、高梁及大米中也有一定程度的分布。玉米赤霉烯酮具有生殖发育毒性、免疫毒性、基因毒性和可

高效液相色谱—串联质谱法测定玉米油中的玉米赤霉烯酮

高效液相色谱—串联质谱法测定玉米油中的玉米赤霉烯酮摘要：实验建立了玉米油中检测玉米赤霉烯酮的方法，用5 mL正己烷溶解后，10 mL乙腈提取，高效液相色谱-串联质谱法测。

外标法定量，在1-50 μg/L范围内，玉米赤霉烯酮的线性方程相关系数r2 >0.999，方法的检出限和定量限，分别为5.0 μg/kg和10.0 μg/kg，平均回收率为88.7 %~90.4 %，日内精密度为5.0 %~6.4 %，日间精密度为6.1 %~8.1 %。

该方法简便、快捷、准确，可用于玉米油中玉米赤霉烯酮的测定。

关键词：正己烷；乙腈；高效液相色谱-串联质谱；玉米赤霉烯酮玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEN），也称为F2毒素，是由镰刀菌产生的一种具有类雌性激素活性的一类真菌毒素[1]。

它广泛存在于霉变的玉米、高粱、小麦、大麦等粮食谷物中，是污染范围最广的一种镰刀菌毒素[2]。

玉米赤霉烯酮具有很大的毒性作用，可损伤DNA、诱发肿瘤、对免疫功能方面造成影响[3-4]。

玉米油作为最常见的植物性食用油之一，具有很高的营养价值，是我国主要食用油品之一，但在其收获加工过程中很容易产生玉米赤霉烯酮，食用后会对人体产生一定危害。

GB 2761-2017《食品中真菌毒素限量》中规定谷物及其制品的玉米赤霉烯酮限量值为60 μg/kg，而对玉米油中的含量暂无要求，只是做为风险监测的一项指标。

目前用于粮谷和植物性油脂中玉米赤霉烯酮的检测方法主要有薄层色谱法、酶联免疫吸附法、液相色谱法和液相色谱-串联质谱法[5-9]等。

但是，由于薄层色谱和免疫分析法准确度较低且存在干扰，很容易出现假阳性，只适合于定性或初筛，现在已较少使用；液相色谱法被广泛使用，能满足日常检测需要；而高效液相色谱—串联质谱法抗干扰能力强，准确度和精密度更高，可用于定性定量分析。

对于样品的前处理方法主要有直接稀释法[10]、免疫亲和柱[11]、固相萃取柱净化[12]等方法，稀释法的前处理存在净化不彻底、基质干扰大的问题，而免疫亲和柱虽使用范围广、特异性强，适用于处理复杂基质的样品，但价格昂贵，批量检测成本高，且前处理较为复杂。

粮油检测粮食中玉米赤霉烯酮的检测超高效液相色谱方法编制说明

《粮油检测粮食中玉米赤霉烯酮的测定超高效液相色谱方法》行业标准制定编制说明玉米赤霉烯酮(Zearalenone) 又称F-2毒素，主要由木贼镰刀菌（）、尖孢镰刀菌（）、禾谷镰刀菌、三线镰刀菌（）、茄病镰刀菌（）、串珠镰刀菌（Fusarium. moniliforme）等产生。

ZEN是一种生殖系统毒素（雌性激素），有强烈的致畸作用,被国际癌症研究中心归类为3类致癌物,主要污染小麦、大麦、水稻、玉米、小米和燕麦等谷物。

面粉、啤酒等农产品加工品中也常能检测到该毒素的存在。

阿根廷报道新收获玉米的含量在未检出到83 mg/kg之间, 储存玉米的含量在未检出到17 mg/kg之间。

我国小麦和玉米中也经常发生玉米赤霉烯酮的污染，危害消费者健康。

研究表明：我国成人通过玉米制品暴露ZEN 的量超过每日允许限量（TDI），部分儿童通过玉米制品暴露ZEN 的量也超过了TDI。

我国食品安全国家标准《GB2761-2011 食品中真菌毒素限量》中规定谷物及其制品中玉米赤霉烯酮限量为60 μg/kg。

目前报道用于检测玉米赤霉烯酮的分析方法有酶联免疫法、免疫胶体金试纸法、气相色谱质谱联用法、高效液相色谱法、液相色谱质谱联用法、多不对称波形离子迁移谱质谱、间接竞争免疫分辨荧光免疫分析、薄层色谱法等。

薄层色谱法由于操作复杂，目前应用较少；胶体金和酶联免疫方法用于快速筛查;普通液相色谱方法目前应用较多，但分析速度较慢，耗费溶剂较多，成本增加；液质联用仪检测需要高端的质谱仪。

当前急需建立一种更加灵敏、高效、低溶剂量的玉米赤霉烯酮微量快速定量方法。

为了满足当前我国粮食绿色检测、监测定量分析的需要，通过查阅文献，根据范德米特(van Deemeter)方程理论，结合免疫亲和净化手段，基于UPLC分离技术，建立了一种进样量小、分离度高、快速准确、环保的玉米赤霉烯酮定量分析方法。

本标准项目的研究有助于提高粮食样品检测、监测效率，降低成本，保护环境，保障从业人员健康安全。

玉米赤霉烯酮检测方法

玉米赤霉烯酮检测方法玉米赤霉烯酮是一种由产自赤霉菌的黄曲霉烯酮合成的毒素。

该毒素在玉米和其他谷物中广泛存在，对人和动物的健康有害。

因此，玉米赤霉烯酮的检测方法至关重要，以保障食品安全和质量。

目前，市场上常用的玉米赤霉烯酮检测方法主要有以下几种：1. 高效液相色谱法（HPLC）：该方法是将样品溶解后经过净化处理，然后使用高效液相色谱仪进行分析。

这种方法可以测定不同类型的赤霉烯酮类毒素，但是需要较复杂的样品预处理过程。

2. 气相色谱法（GC）：这种方法是将样品中的赤霉烯酮蒸发，然后通过气相色谱进行定量分析。

该方法对于特定类型的赤霉烯酮类毒素的测定较为准确，但需要耗费较多的时间和资源。

3. 免疫分析法：这种方法利用特殊的抗体与赤霉烯酮结合，产生可见的信号，从而测定样品中的赤霉烯酮含量。

这种方法操作简便，结果可即时获得，但是对样品中的干扰物较为敏感。

4. 毛细管电泳法（CE）：这种方法利用样品在毛细管中的化学性质差异，通过分离电泳来测定赤霉烯酮的含量。

该方法适用于复杂的样品矩阵，并且可同时测定多种赤霉烯酮。

除了以上主流的检测方法，还有一些新兴的检测技术被应用到玉米赤霉烯酮的检测中：1. 生物传感器：利用生物分子与赤霉烯酮的特异性结合，通过传感器产生的电信号来测定赤霉烯酮含量。

这种方法具有灵敏度高、响应速度快的优势，但是需要对传感器进行特定设计和构建。

2. 分子印迹技术：利用功能单体与赤霉烯酮形成特异的相互作用，构建具有特异性识别能力的分子印迹聚合物。

该方法具有高选择性和较好的再生性，但是制备分子印迹聚合物需要较长的时间和较高的成本。

以上只是介绍了部分常用的玉米赤霉烯酮检测方法，每种方法都有其优缺点和适用范围。

在实际应用中，可以根据实验室条件、检测要求和经济成本等方面考虑选择合适的方法。

同时，需要注意的是，不同国家和地区可能存在不同的食品安全标准和监管要求，因此在检测过程中也需要遵循相应的法规和指南。

高效液相色谱法分析(玉米赤霉烯酮)原始记录

高效液相色谱法分析（玉米赤霉烯酮）原始记录
受理号：第1页，共页
检测项目
玉米赤霉烯酮
检测开始时间
年月日
检测依据
GB 5009.209-2016第一法
检测结束时间
年月日
检测方法
液相色谱法
温度及相对湿度
℃％
仪器名称及型号
Waters 2695高效液相色谱仪
仪器编号
××/××-036
FA2004电子天平
××/××-074
样品处理情况
按照GB 5009.209-2016对样品进行处理。
标准使用液名称及浓度
玉米赤霉烯酮标准使用液1.0μg/mL
仪器
检测条件
检测器：2475荧光检测器
色谱柱：C18反相柱
柱温：室温
流速：1.0 mL/min
激发波长：274 nm
发射波长：440 nm
流动相：乙腈-水-甲醇（46:46:8体积比）
情况
质控措施
样品总数
平行样个数
质控样个数
仪器使用情况使用前：使用后：
检验人：复核人：审核人：
高效液相色谱法分析（玉米赤霉烯酮）原始记录第页，共页
样品编号
试样质量
(g)定容体积（mL）浓度（ng/mL）
结果
(μg/kg）
平均值
（μg/kg）
相对偏差（%）
备注
试验允差要求：≤15%
仪器使用情况使用前：使用后：
酱油、醋、酱及酱制品:165μg/kg；
食用植物油、大豆、油菜籽：33μg/kg
样品空白值
计算公式：X=
式中：X--样品中玉米赤霉烯酮的含量（μg/kg）;
ƿ—待测试样中玉米赤霉烯酮的含量（ng/mL）；

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高效液相色谱法测定粮食中玉米赤霉烯酮及其代谢物曾红燕　黎源倩3　敬海泉(四川大学华西公共卫生学院,成都610041)摘　要　采用甲醇2水提取,C 18小柱净化,反相HP LC 荧光检测器测定了玉米、面粉、小麦样品中的玉米赤霉烯酮及其代谢物和黄曲霉B 1。

对样品预处理和高效液相色谱测定条件进行了优化,Z ON,α2Z OL,β2Z OL 和AFTB 1的线性范围分别为5.0μg/L ～146g/L,25.0μg/L ～200g/L ,25.0μg/L ～160g/L 和0.4μg/L ～2.0g/L,检出限分别为0.5、2.5、2.5和0.04μg/kg;加标回收率在80.0%～110.0%范围内;日间相对标准偏差为415%～9.2%,日内精密度2.7%～7.4%。

本方法灵敏准确,易于推广,适用于粮食中玉米赤霉烯酮及其代谢物的检测。

关键词　玉米赤霉烯酮,黄曲霉毒素B 1,高效液相色谱法,粮食　2005203224收稿;2005210202接受本文系国家自然科学基金重点(No .30030120)资助项目1　引言玉米赤霉烯酮(zearalenone )是由粉红镰刀菌Fusariu m r oseum (F .gra m inearum )和其它镰刀菌产生的一种激素类真菌毒素。

可引起各种谷物病变,主要发生在玉米、高粱、燕麦、小麦、大麦及谷子等农作物中。

研究表明,玉米赤霉烯酮(Z ON )及其代谢物(α2zearalenol,β2zearalenol )具有类雌激素作用,能导致动物雌激素水平过高及严重的生殖和不育问题[1]。

动物实验表明:玉米赤霉烯酮有致癌活性[2],Z ON 、α2Z OL 和β2Z OL 是否对人体也有潜在致癌性正在研究中。

玉米赤霉烯酮污染饲料和食品后,不仅使农业经济受到严重影响,而且还会带来严重的食品安全问题,威胁到人类的健康。

我国目前尚未制定食品中玉米赤霉烯酮的最大允许限量及标准检测方法。

澳大利亚、法国和俄罗斯等已经制定了食品和动物饲料中玉米赤霉烯酮的最大允许限量为30～1000μg/kg [3]。

测定玉米赤霉烯酮的方法主要有高效液相色谱法(HP LC )、薄层色谱法(T LC )[4]、气相色谱法(GC )[5]和毛细管电泳法(CEC )[6]。

美国AOAC 的方法是薄层色谱法和高效液相色谱法。

由于玉米赤霉烯酮在样品中的含量甚微,而共存干扰物质甚多,因此在玉米烯酮的测定中,提取和净化是十分重要的步骤。

一般采用有机溶剂或有机溶剂2水体系提取,净化的方式主要有液2液萃取、固相萃取小柱和免疫亲和柱净化等。

目前,国内对玉米赤霉烯酮的检测方法鲜有报道,只有少数用高效液相色谱法[7,8]和免疫分析[9]的报道,而且都只检测玉米赤霉烯酮一种组分。

本实验采用甲醇2水提取样品,经二氯甲烷萃取后,C 18硅胶小柱固相萃取,直接荧光检测2高效液相色谱同时测定玉米赤霉烯酮等多种真菌毒素。

较之AOAC 的方法,本方法简化了样品的前处理,可同时检测玉米赤霉烯酮及其代谢产物,具有简便快速,灵敏准确的优点,用于粮食样品的测定取得了满意的结果。

2　实验部分2.1　仪器与试剂HP LC 带荧光检测器(HP1100,Agilent 公司);C 18硅胶小柱(J.T .Baker );超声波提取仪。

标准品:Zearalenone (Z ON )、α2Zearalenol (α2Z OL )、β2Zearalenol (β2Z OL )和Aflat oxin B 1(AFT B 1)(Sig ma 公司产品)用甲醇配制成标准储备液,浓度分别为1.46g 、2.00、1.60和0.02g/L,于-20℃冰箱保存。

甲醇和乙腈(色谱纯,fisher 公司)。

本实验所用水均为重蒸水,所用试剂除指明外,均为分析纯(A.R.)。

2.2　实验方法2.2.1　色谱条件　色谱柱:Pheno menex ODS C 18柱,25c m ×4mm ,5μm;流动相:水2甲醇2乙腈第34卷2006年3月分析化学(FE NX I HUAXUE )　研究简报Chinese Journal of Analytical Che m istry 第3期351～354(46∶10∶44,V/V);流速:1.0mL/m in;经荧光扫描测定各真菌毒素的激发光谱和荧光光谱,确定荧光检测器工作波长,λem=236nm;λem=418nm;柱温:25℃。

2.2.2　标准曲线　在上述色谱条件下,测定不同浓度的混合标准溶液:β2Z OL(0、8.0、16.0、32.0 mg/L),α2Z OL(0、10.0、20.0、40.0mg/L),AFT B1(0、0.10、0.20、0.40mg/L),Z ON(0、7.3、14.6、29.2 mg/L),测定各待测物的色谱峰面积。

2.2.3　样品处理　以市售玉米面、面粉和针对性采摘的麦粒麦穗等为样品,经粉碎混匀后,称取10.0g 样品置于100mL容量瓶中,加30mL甲醇,50g/L NaCl溶液20mL,振摇5m in后,超声提取30m in,用滤纸过滤到分液漏斗中,加入二氯甲烷萃取(分3次,每次20mL),二氯甲烷层经无水硫酸钠脱水并收集于蒸发皿内,于恒温水浴(50±1℃)上挥干溶剂。

用6mL甲醇2水(40∶60)分3次溶解残渣,转入C18小柱后,用4mL甲醇洗脱,收集洗脱液于具塞刻度离心管中,用氮气吹至1.0mL,以3000r/m in,离心5m in,取上清液进样测定。

以保留时间定性,峰高增量法确认,标准曲线法定量。

3　结果与讨论3.1　提取条件的选择分别用三氯甲烷、二氯甲烷、甲醇和乙腈等有机溶剂对粮食样品中待测物进行提取条件实验。

结果表明,以甲醇和乙腈的提取效率好,杂质峰较少,二者对待测物的提取效率差异不大。

因乙腈价格高,毒性大,本实验采用甲醇做提取溶剂。

由于样品提取时需要溶胀,为避免乳化,提取体系中加以5g/L的NaCl溶液。

当用50mL甲醇25g/L NaCl(30∶20)提取时,粮食样品中待测组分的回收率最好(8210%～103.0%)。

提取后,滤出提取液,残渣再经此提取液提取后测定,未检出待测组分,表明甲醇25g/L NaCl (30∶20,V/V)提取一次已将待测成分提取完全。

所以用50mL甲醇25%NaCl(30∶20,V/V)为提取溶剂。

在甲醇25g/L NaCl提取后,需进一步从中提取待测物,比较了石油醚、乙酸乙酯、三氯甲烷和二氯甲烷等有机溶剂。

采用石油醚提取,对各组分的提取效率为26%～92%;乙酸乙酯萃取时分层困难;三氯甲烷提取后杂峰较多,各组分的提取效率低;而二氯甲烷提取效率为82.0%～103.0%,而且杂峰少,故本实验采用二氯甲烷(3×20mL)为提取溶剂。

3.2　净化条件的选择传统的液2液萃取要耗费大量有毒的有机溶剂,操作繁琐、耗时,而固相萃取则具有消耗试剂少,操作简单的优点。

本实验采用了C18小柱净化。

以甲醇、乙腈等有机溶剂或它们的水溶液为洗脱剂,通过比较,发现用甲醇洗脱效率最高。

当甲醇的用量为4mL时,洗脱效率达98%以上(见表1),故本实验选择4mL甲醇洗脱。

表1　洗脱效率实验Table1　The efficiency tests of eluti on组分Component加入量Added(ng)脱用甲醇体积The volume of methanol(mL)1.02.03.04.05.0洗脱效率The efficiency of eluti on(%)β2Zearalenol(β2Z OL)16.08.27.9ND ND ND100.6α2Zearalenol(α2Z OL) 5.00 4.120.520.33ND ND99.4Aflat oxin B(AFT B1)0.500.360.090.030.01ND98.0Zearalenone(Z ON)14.611.8 2.10.50.1ND99.3　ND:Not detected.3.4　流动相、流速和柱温的选择按美国AOAC方法中流动相的组成H2O∶CH3OH∶CH3CN(43∶22∶35,V/V)对标准混合溶液进行检测,但α2Z OL、AFT B1和Z ON3个色谱峰未能完全分离。

进一步改变条件,当水的比例小于40%时,保留时间太短,各色谱峰分离差;在60%以上时,峰展宽严重而且峰形拖尾;当水的比例为46%时,各峰分离较好;甲醇比例为10%时,色谱峰峰形对称。

在此基础上对流动相的组成(H2O、CH3OH、CH3CN)进行了三因素四水平L16(4)3正交试验,选择本实验的最佳流动相组成,因素水平见表2。

253 分析化学第34卷　图1　混合标准溶液(a )和样品(b )的色谱图Fig .1　The chr omat ogra m s of m ixed standards (a )and samp le (b )1.β2玉米赤霉烯醇(β2zearalenol );2.α2玉米赤霉烯醇(α2zearalenol );3.黄曲霉毒素B 1(Aflat oxin B 1);4.玉米赤霉烯酮(zearalenone )。

结果表明,当流动相的组成为H 2O ∶CH 3OH ∶CH 3CN =46∶10∶44,流速为1.0mL /m in,色谱柱温度为25℃时,待测组分与杂质峰均能达到完全分离,峰形对称,分析时间不超过15m in 。

标准溶液和样品的色谱图见图1。

表2　因素水平表Table 2　O rthogonal design test水平Level 流动相组成Compositi on of mobile phase,H 2O ∶CH 3OH ∶CH 3CN流速Rate of fl ow(mL /m in )柱温Column te mperature (℃)146∶11∶430.825246∶10∶44 1.030346∶9∶451.2353.4　方法性能指标考察3.4.1　线性范围及检出限　在本实验优化的条件下Z ON 、α2Z OL 、β2Z OL 和AFT B 1的标准曲线线性范围分别为:5.0μg/L ～146g/L,25μg/L ～200g/L,25μg/L ～160g/L 和0.4μg/L ～2.0g/L,线性相关系数为0.995～0.999。

以试剂空白的基线噪声3倍所对应的浓度作为方法的检出限,以上4种真菌毒素的检出限分别为:0.5、2.5、2.5和0.04μg/kg 。

3.4.2　精密度　在选定的色谱条件下,在同1d 内连续7次测定混合标准溶液,每次均为10μL,测定各组分的峰面积,计算日内精密度,RS D 为2.7%～7.4%。