肿瘤干细胞的分离与鉴定
肿瘤干细胞的分离和鉴定技术研究
肿瘤干细胞的分离和鉴定技术研究肿瘤干细胞是肿瘤组织中具有自我更新和分化能力的一类细胞，具有高度的分化状态异质性和治疗耐药性，并在肿瘤的生长、转移以及复发中扮演了重要的角色。
因此，肿瘤干细胞已经成为肿瘤研究的热点之一，肿瘤干细胞的分离和鉴定技术也成为了肿瘤干细胞领域的重要技术之一。
肿瘤干细胞分离技术一、流式细胞术流式细胞术是门捷列夫技术在细胞生物学中的应用，该技术可以根据细胞的表面分子进行细胞的分类、分离和鉴定。
在肿瘤干细胞的分离和鉴定中，流式细胞术常常用于筛选肿瘤干细胞，通过标记表面干细胞标记物，如CD44、CD133、EpCAM等，实现肿瘤干细胞的分选和分离。
二、磁珠分离技术磁珠分离技术是一种基于特定的细胞表面标记，利用特别制备的磁珠对细胞进行快速高效的分离和鉴定的技术。
在肿瘤干细胞的分离和鉴定中，磁珠分离技术与流式细胞术具有类似的功能，即通过特异的肿瘤干细胞标记物，如CD44、CD133、EpCAM等，将肿瘤干细胞与其他细胞分离开来。
三、单细胞分离技术单细胞分离技术是一种高解析度的细胞分离方法。
该技术可以将个体细胞进行极端稀释，将单个的细胞分离出来，并进行单线索扩增(Single Cell Amplification)。
在肿瘤干细胞的分离和鉴定中，单细胞分离技术能够通过对单个肿瘤细胞进行检测和分离，发现并鉴定肿瘤干细胞及其生物学特征。
肿瘤干细胞鉴定技术一、肿瘤干细胞的生物学特征1.自我更新和分化能力在肿瘤干细胞中，只有极少数的干细胞可以不断更新和分化，形成不同类型的肿瘤细胞，并维持了肿瘤的生长和转移。
2.高表达肿瘤干细胞标记物CD44、CD133、EpCAM等干细胞标记物是肿瘤干细胞的共性，用这些标记物能够分离出具有肿瘤干细胞特性的细胞。
3.抗药性肿瘤干细胞具有耐药性，即能够在化疗或放疗后存活下来，并继续生长和分化，从而导致肿瘤复发和耐药性。
二、肿瘤干细胞的功能鉴定1.能力分析肿瘤干细胞的自我更新和分化能力是其最基本的生物特征，可以通过形成肿瘤瘤球和体外培养的方法来分析其发育潜能。
干细胞研究进展
干细胞研究进展【摘要】干细胞是人体及其各种组织细胞的最初来源，具有高度自我复制，高度增殖和多向分化的潜能。
干细胞研究正在向现代生命科学和医学的各个领域交叉渗透，干细胞技术也从一种实验室概念逐渐转变成能够看得见的现实。
干细胞研究已成为生命科学中的热点。
基于此，本篇文章就干细胞的最新研究进展情况进行了综述，旨在为读者提供了解干细胞研究的平台。
【关键词】干细胞；肿瘤干细胞；神经干细胞干细胞是一类具有自我复制能力的多潜能细胞，在一定条件下它可以分化成多种功能细胞。
干细胞的用途非常广泛，涉及到医学的多个领域。
目前科学家已经能够在体外鉴别、分离、纯化、扩增和培养人体胚胎干细胞，并以这样的干细胞为“种子”，培育出一些人的组织器官。
干细胞及其衍生组织器官的广泛临床应用，将产生一种全新的医疗技术，也就是再造人体正常的甚至年轻的组织器官，从而使人能够用上自己的或他人的干细胞或由干细胞所衍生出的新的组织器官，来替换自身病变的或衰老的组织器官。
本文将对肿瘤干细胞、心肌干细胞以及神经干细胞的研究做如下综述。
1、肿瘤干细胞概述1.1肿瘤干细胞学说的提出。
1960年以来，许多动物实验证明只有当肿瘤细胞数大于100万时才可以形成新的肿瘤。
一些研究显示并不是所有的肿瘤细胞都能增殖，可能只有小部分肿瘤细胞具有滞留源性，而大部分是肿瘤起始细胞或肿瘤干细胞。
随着对干细胞研究的不断深入，发现干细胞和肿瘤干细胞之间具有许多共同特征：他们都具有多向分化潜能和自我更新能力，以及相似的细胞表面标志和相同的信号调节通路等[1]。
于是提出肿瘤起源于肿瘤干细胞，是一种干细胞疾病，肿瘤是正常干细胞累计突变的结果，“肿瘤干细胞学说”应运而生。
1.2肿瘤干细胞的分离和鉴定。
近年来，干细胞研究的发展很大程度上依赖于细胞分化抗原的研究进展，细胞表面特异性标志的确定是肿瘤干细胞分离的第一步。
一般原则为结合谱系标志，正常干细胞特异标志（如btsc的cd133与分离lsc的cd34）以及正常组织特异性标志等综合评价[2]，很多学者认为结合阳性标志和阴性标志可以更有效地分离干细胞。
卵巢癌细胞系ID8中肿瘤干细胞的分离及生物学特性鉴定
《中国组织工程研究》 Chinese Journal of Tissue Engineering Research文章编号:2095-4344(2018)29-04687-05 4687www.CRTER .org·研究原著·俞晓毓，女，1992年生，江苏省盱眙县人，汉族，东南大学在读硕士，主要从事肿瘤干细胞研究。
并列第一作者：吴迪，女，1987年生，江苏省淮安市人，汉族，东南大学在读博士，主要从事肿瘤干细胞疫苗研究。
通讯作者：窦骏，教授，博士生导师，东南大学医学院病原微生物学与免疫学系，江苏省南京市 210009中图分类号:R394.2 文献标识码:A稿件接受：2018-05-15Yu Xiao-yu, Master candidate, Department of Pathogenic Biology and Immunology, Medical College of Southeast University, Nanjing 210009, Jiangsu Province, ChinaWu Di, Doctorate candidate, Department of Pathogenic Biology and Immunology, Medical College of Southeast University, Nanjing 210009, Jiangsu Province, China; Department of Gynecology & Obstetrics, Zhongda Hospital, Southeast University, Nanjing 210009, Jiangsu Province, ChinaYu Xiao-yu and Wu Di contributed equally to this work.Corresponding author: Dou Jun, Professor, Doctoral supervisor, Department of Pathogenic Biology and Immunology, Medical College of Southeast University, Nanjing 210009, Jiangsu Province, China卵巢癌细胞系ID8中肿瘤干细胞的分离及生物学特性鉴定俞晓毓1，吴 迪1，2，王 净2，李 菲1，白绪乐1，2，赵枫姝1，窦 骏1 (1东南大学医学院病原生物学与免疫学系，江苏省南京市 210009；2东南大学附属中大医院妇产科，江苏省南京市 210009)DOI:10.3969/j.issn.2095-4344.0968 ORCID: 0000-0003-4459-1618(俞晓毓)文章快速阅读：文题释义：肿瘤干细胞或癌干细胞(cancer stem cell ，CSC)：是指肿瘤组织中极小部分能够自我更新、无限分化并具有耐受放化疗等特点的肿瘤细胞，与干细胞的基本特性十分相似，被认为是肿瘤形成、进展、复发和耐药的根源。
人食管鳞癌细胞系EC109中肿瘤干细胞的分离(富集)与鉴定
【 键 词 】 食 管鳞 状 细胞 癌 ； 瘤 干 细 胞 ； 胞 球 ； Ｃ ０ 关 肿 细 Ｅ １９
【 图分 类 号 】 Ｒ ３ ． １ 中 ７ ７ ３ 【 献 标 志 码】 Ａ 文
Ｉｏ ａ ｉｎ（ ｎ ｉ ｈ ｎ ） ｎ ｈ ｒ ｃｅ ｉａ ｉ ｎ ｏ ａ ｃ ｒ ｓｅ ｃ ｌ ｎ ｅ ｏ ｈ ｇ ａ ｅ ｕ ｍｏ ｓｃ ｌ ｃ ｒ ｉ ｏ ｅｌｌ ｅ Ｅ ０ ｓｌｔ ｏ ｅ ｒｃ ｍｅ ｔ ａ ｄ ｃ ａ ａ ｔ ｒｚ ｔ ｆｃ ｎ ｅ ｔｍ ｅｌ ｉ ｓ ｐ ａ ｅ ｌｓｑ ａ ｕ ｅｌ ａ ｃｎ ｍａ ｃ ｌ ｉ Ｃ１ ９ ｏ ｓ ｎ
ＣＵＩＸｉ ｎ ， ＡＮＧ ｎ ， ａｇ Ｙ Ｌａ ｇ ｙＵ ａ ， Ｑｉｎ ＲＥＮ ｎ ， Ｙｏ ｇ ＧＵＯ ｈ ｎ －ｕ 。 ＬＩ Ｑｉｎ ， Ｕ ｎ ， Ｚ ｅ ｇ ｊ ｎ ， Ｕ ａ ＡＮ ｕＷＵ ＺＨＡＮＧ ｅ ｇ ｗｕ ｏ ｇ ＢＩ Ｘｉ— ， Ｃｈ ｎ －
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论 著 ・
人食 管鳞 癌 细胞 系 Ｅ １ ９中肿 瘤 干细胞 的 Ｃ ０
分 离 （ 集 ） 鉴 定 富 与
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Ｍ ｅ ｃ ｌＵｎ ｖ ｒ ｉｙ， ｏ ｔ ｗｅ ｔ ｎ ｅ ｎ ｅ Ｃｈ ｎ ｑ ｎ ｔ ０ ３ ） ｄｉａ ｉ ｅ ｓｔ Ｓ ｕ ｈ ｓ Ｃａ ｃ ｒ Ｃｅ ｔｒ， ｏ ｇ ｉ ｇ Ｃｉｙ ４ ０ ８
［ ｓｒｃ］ Ｏｂ ｅｔ ｅ Ｔｏ ｉｏａｅ ｅ ｒ ｈ ａ ｄ ｃ ａａ ｔｒｚ ｈ ａ ｃ ｒｓｅ ｃｌ ｎ ｅ ｏ ｈ ｇ ａ ｓｑ ａ ｕ ｅｌ Ａｂ ｔａ ｔ ｊｃｉ ｖ ｓ ｌｔ／ ｎ ｉ ｎ ｈ ｒｃｅ ｉ ｔ ｅｃ ｎ ｅ ｔｍ ｅｌ ｉ ｓ ｐ ａ ｅ ｌ ｅ ｕ ｍｏ ｓ ｃｌ ｃ ｅ ｓ
肿瘤干细胞的分离方法
肿瘤干细胞的分离方法肿瘤干细胞（tumor stem cells）是肿瘤组织中一小部分细胞群的亚群，具有自我更新、自我复制和多向分化的能力，能够发起和维持肿瘤的生长和进展。
肿瘤干细胞的存在被认为是肿瘤的一个重要特征，因为它们在肿瘤的发展、转移和复发中起着重要的作用。
因此，肿瘤干细胞的分离与研究对于了解肿瘤的发生机制、寻找新的治疗策略以及改善临床预后具有重要的价值。
下面将介绍几种常用的肿瘤干细胞的分离方法。
1. 黑色素瘤干细胞（melanoma stem cells）分离方法：a. 表面标记法：利用特定的细胞表面标记物，如CD271、ABCB5等，可以通过荧光激活细胞分选（fluorescence-activated cell sorting，FACS）技术，将肿瘤干细胞从肿瘤组织中分离出来。
例如，采用CD271阳性细胞的FACS来分选肿瘤组织，可以得到具有肿瘤干细胞特性的细胞亚群。
b. 功能分选法：通过肿瘤干细胞的自我更新和多向分化能力，可以利用体外球形培养（spheroid culture）技术分离肿瘤干细胞。
相比于非干细胞，干细胞可以形成独立的球形结构，并表达特定的干细胞特性标记物，如ALDH1（aldehyde dehydrogenase 1）等。
2. 乳腺癌干细胞（breast cancer stem cells）分离方法：a. 流式细胞术：利用特定的细胞表面标记物，如CD44和CD24，可以通过流式细胞术将肿瘤干细胞从乳腺癌组织中分离出来。
例如，CD44+/CD24-细胞的分选可以得到乳腺癌中富含干细胞的细胞亚群。
b. 磁性珠分选法：通过特定的标记物，如EpCAM（epithelial cell adhesion molecule）和CD44，可利用磁性珠（magnetic beads）结合的方法将肿瘤干细胞从乳腺癌组织中分离出来。
3. 前列腺癌干细胞（prostate cancer stem cells）分离方法：a. 表面标记法：利用特定的细胞表面标记物，如CD44和CD133，可以通过流式细胞术或磁性珠分选法将肿瘤干细胞从前列腺癌组织中分离出来。
一步法快速分离鉴定肿瘤干细胞的单细胞微流控芯片
一步法快速分离鉴定肿瘤干细胞的单细胞微流控芯片马丛丛;朱强远;徐亚楠;牟颖【摘要】应用多层软光刻技术，以聚二甲基硅氧烷(PDMS)作为芯片材料，制作一种新型的可用于单细胞鉴定研究的微流控芯片(60 mm×40 mm×4 mm).将肺癌细胞 A549无血清悬浮培养富集肿瘤干细胞，制成单细胞悬液，与逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)的反应液混合后通入芯片，细胞随机分布在2048个微腔室中裂解并进行RT-PCR.该芯片集细胞捕获、分离、裂解及聚合酶链式反应(PCR)于一体，实现了一步法快速鉴定肿瘤干细胞的目的，通过统计阳性小室数可计算出肿瘤细胞中肿瘤干细胞的比例.%Using multilayer soft lithography technology,poly-dimethylsiloxane (PDMS)as the chip material,we made a novel microfluidic chip (60 mm×40 mm×4 mm)for single cell identific ation research.We enriched tumor stem cells in serum-free suspension culture of lung cancer cell A549 into single cell suspension. RT-PCR reaction liquid mixed into the chip, and cells were randomly distributed and reverse transcription PCR (RT-PCR)in 2 048 micro chamber.The chip integrated in cellcapture,separation,lysing and PCR reaction to achieve rapid identificationof tumor stem cells. By counting the number of positive reaction,we could calculate the proportion of tumor stem cell in the total cells.【期刊名称】《吉林大学学报（理学版）》【年(卷),期】2016(054)006【总页数】6页(P1456-1461)【关键词】单细胞;微流控芯片;肿瘤干细胞;分离鉴定;一步法【作者】马丛丛;朱强远;徐亚楠;牟颖【作者单位】浙江大学工业控制技术国家重点实验室，分析仪器研究中心，生命科学学院，杭州 310058;浙江大学工业控制技术国家重点实验室，分析仪器研究中心，生命科学学院，杭州 310058;浙江大学工业控制技术国家重点实验室，分析仪器研究中心，生命科学学院，杭州 310058;浙江大学工业控制技术国家重点实验室，分析仪器研究中心，生命科学学院，杭州 310058【正文语种】中文【中图分类】Q31单细胞分析对重大疾病的早期诊断、治疗、药物筛选及细胞生理、病理过程的研究有重要意义[1-2]. 传统的细胞学研究依赖于大量细胞(103～104个),将群体值作为反应结果[3],但相同状态下的细胞在表型和基因型方面也存在异质性[4-5]. 通过细胞群体分析获得的统计平均结果,掩盖了单个细胞之间的差异[1]. 检测单个细胞内化学组分,有助于检测和鉴别大量细胞群体中少量非正常细胞(如肿瘤干细胞和循环肿瘤细胞). 肿瘤干细胞(tumor stem cell,TSC)是肿瘤发生、发展、转移的主要原因,也是肿瘤复发与耐药的根源[6],目前对肿瘤干细胞理论的研究较少. Wallingford等[7]首次采用毛细管电泳(CE)分析单细胞,由于毛细管的结构限制,单细胞进样和溶膜操作复杂,分析速度慢,不易实现连续操作,因此连续测定的报道较少. 流式细胞仪技术可以实现高通量获取单细胞,但设备昂贵,需要专业人员操作及特定的抗体标记,且需要的细胞量较大(>104个),因此应用较少. 微流控芯片具有高通量、低消耗、微型化、集成化和大规模平行处理等特点,且微流控技术可以准确地操作分析微量样品,从而为单细胞的研究提供了一个新平台[8-10]. 文献[11-14]通过重力、流体力、磁力实现对单细胞的捕获,但均不能在芯片上进行单细胞后续分析. White等[15]研制出单细胞RT-qPCR微流控芯片,该芯片集成了细胞捕获、裂解、逆转录以及聚合酶链式反应(PCR),但其捕获细胞及进样依赖于微阀控制,芯片结构复杂,且通量较低(300个/次). 本文基于文献[16-17]设计针对单细胞研究的微流控芯片,实现了单细胞捕获、裂解、逆转录PCR(RT-PCR)于一体,一步法快速实现对肺癌细胞A549中肿瘤干细胞的鉴定及分析. 该芯片操作简单、价格低廉,并具有微阵列芯片高通量的特性.1.1 试剂与仪器A549肺癌细胞(中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心)； SU8-3025,SU8-3050负性光胶(美国MicroChem Corp公司)；聚二甲基硅氧烷(PDMS,美国Dow Corning公司)； MGL96G型PCR仪(杭州朗基科学仪器有限公司)；Maestro Ex IN-VIVO IMAGING SYSTEM型荧光成像仪(美国CRI Maestro公司)；IX71型荧光倒置显微镜(日本Olympus公司)；TaqMan® One-Step RT-PCR Master Mix Reagent Kit(美国Life Technologies公司)； DMEM/F-12培养基(美国Thermo Scientific公司)；细胞计数仪(美国Life Technologies公司).1.2 微流控芯片的设计与制作用Corel DRAW软件设计芯片通道图样,采用多层软光刻技术制作芯片模具. 微流控芯片包括3层PDMS和防水涂层,用玻璃片封接底部. 先配m(PDMS单体(A))∶m(PDMS固化剂(B))=5的PDMS预聚合物,抽真空除气后,旋涂到模具上,85 ℃烘烤使其凝固. 再配制m(A)∶m(B)=10的PDMS预聚合物,倾倒在模具上,厚度为4 mm,于85 ℃烘烤40 min; 再配制m(A)∶m(B)=30的PDMS预聚合物,旋涂到空白硅片上作为基底层,于85 ℃烘烤40 min. 将PDMS层从模具上剥下,打孔,再将其覆到基底层PDMS上,于85 ℃烘烤黏合. 待两层PDMS黏合后从控制层模具上剥下切割成合适体积的块,将盖玻片和芯片用等离子体处理后,黏合并于85 ℃下烘烤4 h固定.1.3 肿瘤干细胞培养及分离取对数期生长的A549细胞,用体积分数为0.25%的胰蛋白酶消化,制成单细胞悬液,用无血清DMEM/F-12培养液培养. 在100 mL DMEM/F-12培养液中,先加入100 μg/mL表皮生长因子(EGF)50 μL,再加入100 μg/mL碱性成纤维生长因子(bFGF)和白细胞介素-6(IL-6)各20 μL. 每隔2 d添加1次培养液(半数换液),直至球体形成收集细胞,TrypLETM Express酶消化,离心制成单细胞悬液,用细胞计数仪计数.1.4 肿瘤干细胞染色用ALDEFLOUR®试剂盒对肿瘤干细胞染色. 取1 mL A549细胞和培养7 d后的A549 CSC制成单细胞悬液于1.5 mL EP管中,1 000 r/min离心5 min,弃上清液,向EP管中加入1 mL的ALDHFLOUR®缓冲液轻轻吹打,再向其中加入10 μL的ALDHFLOUR®染料并用移液枪反复吹打,使细胞充分接触染料,置于37 ℃培养箱中温育40 min. 染色完成后,用1 mL 1×PBS(磷酸盐缓冲液)冲洗3遍,最后加入1 mL 1×PBS重悬,用细胞计数仪计数统计.1.5 微流控芯片进样及反应配制反应体系：将一步法反应混合物5 μL、无RNA酶水10 μL、 CD133探针1 μL、φ(吐温)=0.1% 1 μL及A549 CSC细胞悬液3 μL混匀,取4.5 μL样品通入芯片.PCR反应程序：50 ℃预热2 min；95 ℃预变性10 min；95 ℃变性15 s,60 ℃退火延伸60 s,进行45个循环.1.6 检测和分析反应结束后,用荧光成像仪进行观察,用电荷耦合元件(CCD)成像系统对芯片的反应结果进行成像,荧光激发光为455 nm,发射光为520 nm. 成像后用软件分析,可计算阳性小室个数.2.1 用于单细胞研究的微流控芯片设计与制作设计的微流控芯片是一种集细胞分离捕获、操纵、溶胞及检测等多个步骤于一体的用于单细胞分析的集成流路芯片装置,其结构如图1所示. 芯片共4层,包括上层10∶1的PDMS支撑层、防蒸发的纳米涂层、5∶1的PDMS微阵列层以及30∶1的PDMS基底层,最后用玻璃片封接芯片底部. 芯片尺寸为60 mm×40 mm×4 mm (图1(C)),一张芯片包括两个反应区,每个区含有2 048个小室,小室的尺寸为100 μm× 100 μm × 250 μm,小室体积为2.5 nL. 芯片只有进样口而无出样口,从而防止反应液流出导致气溶胶污染，且节省试剂. 测得所培养的肿瘤干细胞直径为10～30 μm. 为防止细胞在通道中发生堵塞,设计的通道宽为50 μm、高为40 μm. 芯片的通道结构逐级等分,进样口到每个小室的距离等距,从而保证反应液均匀分布在各小室中. 芯片有一层PDMS基底层,可保证小室四周均为PDMS,避免通入细胞后产生贴壁现象. 该装置无需外接驱动系统和阀门开关控制装置,减少了装置的复杂性,在高通量、低消耗和大规模平行处理方面具有较大优势.2.2 微流控芯片的进样设计的芯片利用PDMS溶气性原理驱动实现无动力、无阀进样. 当PDMS脱气后,芯片处于负压状态,当与外界大气相通时,芯片的内外压力差驱使液体引入芯片. 反应液和油相在压力差的作用力下相继引入芯片,反应液先进入通道再进入反应小室,然后油相进入通道,将主通道中的样品溶液冲入后续的反应小室,直至样品进入所有的反应小室,从而将反应样品封入反应小室内,使其在反应过程中彼此独立,实现样品的无阀隔离与自吸分液式进样. 进样过程如图2所示.2.3 单细胞捕获将细胞制成单细胞悬液,稀释成特定浓度,与RT-PCR的反应液混合后通入芯片,使通入芯片的细胞数约为微反应室数目的3/4(1 500/2 048). 图3为细胞通入芯片后,在荧光倒置显微镜下观察细胞在微反应室中的分布情况. 由图3可见,细胞随机分配到微反应室中,实现了单细胞捕获.2.4 RT-PCR反应结果分析反应完将芯片擦拭干净,用荧光成像仪观察反应结果,激发光为455 nm,绿色荧光发射波长为520 nm. 图4(A)和(B)分别为A549普通肿瘤细胞和无血清悬浮培养7 d 后的A549 CSC用一步法的RT-PCR反应结果,其中绿色亮点表示阳性反应,右侧图为荧光倒置显微镜下观察到的细胞在微反应室中的分布情况,分别对应左侧反应结果荧光图中的红色框区域. 由图4可见,多数含有细胞的微反应室反应结果呈阴性,说明原始细胞中只有少数肿瘤干细胞,而反应结果呈阳性(绿色框)的微反应室所含的细胞为肿瘤干细胞. 因此,利用所设计的单细胞微流控芯片通过一步法可以达到快速鉴定肿瘤干细胞的目的.在显微镜下观察细胞在微反应室中的分布情况,反应结束后统计荧光亮点(阳性微反应室),可计算出阳性百分数(原始细胞中含有肿瘤干细胞的百分数),实现对肿瘤干细胞的定量分析,计算结果列于表1. A549细胞中含有少量具有干性的细胞,可通过无血清悬浮培养进行筛选,达到富集的目的. 由表1可见,A549细胞中约含有(2.64±0.22)%的干性细胞,通过无血清悬浮培养后干性细胞百分数为(10.08±1.19)%,表明无血清悬浮培养能达到富集肿瘤干细胞的目的.2.5 肿瘤干细胞的染色结果分析ALDEFLUOR®试剂盒法是根据乙醛脱氢酶(ALDH)的底物氟化硼配合氨基乙醛(BAAA)可以通过自由扩散进入细胞膜,并在细胞内被ALDH氧化成具有极性荧光的物质,使高表达ALDH的细胞带有绿色荧光. 基于ALDH活性的Aldefluor分析法已应用于分选和鉴定多种肿瘤干细胞[18-20]. 邹爱梅[21]通过Alderflour流式细胞仪从A549细胞株分选出ALDH1+细胞,并研究了其生物学功能,发现ALDH1+细胞仅占(2.00±0.26)%,相比于A549细胞,由于ALDH1+肺癌细胞具有自我更新、增殖克隆、迁移以及高致瘤性,具备肿瘤干细胞特性,因此ALDH1可作为肺癌干细胞的标志物. ALDEFLUOR®试剂盒染色后用细胞计数仪检测A549细胞和A549 CSCs染色情况,激发光为488 nm,发射光为525 nm. 染色法统计结果表明,A549细胞中ALDH1+百分数约为(2.12±0.91)%,与文献[21]中用流式细胞仪检测结果相符,无血清悬浮培养7 d后ALDH1+百分数约为(12±0.94)%. 用单细胞微流控芯片检测与染色法检测结果相符,表明本文设计用于单细胞研究的微流控芯片可用于肿瘤干细胞的鉴定及定量分析.微流控芯片用于单细胞分析,可将细胞捕获分离、培养、分选、裂解、反应以及分析检测等步骤集成在一块芯片上,微流控装置能准确操纵单细胞，使其成为单细胞研究的重要工具[22-24]. 本文研制的单细胞微流控芯片,可将数千个细胞单独分隔到不同的微反应室,不再互相干扰,也不易发生漏检,随即将分离的单细胞直接裂解并进行RT-PCR. 反应结束后,芯片可以直接在荧光成像仪或荧光显微镜上观察反应结果,无需开盖进行电泳分析,不会对实验环境产生产物气溶胶污染.综上所述,本文研制的微流控芯片可自吸分液式进样,无需辅助设备控制流路. 芯片易操作、敏感度高(单细胞)、准确性好(可计数)、节省试剂(几微升/芯片),适于实验室进行肿瘤干细胞等稀少细胞的快速鉴定. 为肿瘤干细胞的研究提供了一种单细胞分离与特异性鉴定的新工具,可用于鉴定肿瘤干细胞的分子遗传特征和特异标志物,解决了肿瘤干细胞特异性鉴定较难的问题，可用于癌症及感染性疾病的早期诊断、单细胞分析以及产前诊断.【相关文献】[1] Di C D,Aghdam N,Lee L P. Single-Cell Enzyme Concentrations,Kinetics,and Inhibition Analysis Using High-Density Hydrodynamic Cell Isolation Arrays [J]. Analytical Chemistry,2006,78(14): 4925-4930.[2] Ryan D L,REN Kangning,WU Hongkai. Single-Cell Assays [J]. Biomicrofluidics,2011,5(2): 1399-1406.[3] Toriello N M,Douglas E S,Thaitrong N,et al. 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肿瘤干细胞
肿瘤干细胞研究的前景及方向
继续寻找各类肿瘤干细胞特异性的表面 标记，以便进一步分离、纯化肿瘤干细 胞，并设计针对肿瘤干细胞的特异性的 治疗方案；
进一步阐明正常干细胞生理和肿瘤干细 胞病理生理功能的分子调控途径以及导 致成肿瘤干细胞生成的分子机制，以便 找到新的治疗靶点； 进一步研究肿瘤细胞群体的异质性并设 计综合性的治疗方案。
二 起源于过渡细胞群 过渡细胞群细胞也有可能成为肿瘤突 变的靶细胞，过渡细胞的突变可使其重 新获得自我更新能力并诱导干细胞表面 标记的表达，从而成为肿瘤干细胞。
肿瘤干细胞和正常干细胞自我 更新的共同调控途径
（一）Bmi-1信号通路 Bmi-1是一种转录抑制因子，在小鼠 和人的HSC中呈高表达，说明Bmi-1可能 参与正常造血。 Bmi-1通过抑制 P16lnk4a和P19Alf蛋白的表达发挥作用， 这两种蛋白分别具有抑制细胞增殖和促 进细胞死亡功能
研究人员将Bmi-1基因敲除小鼠的干细胞 植入放射线照射后的正常小鼠体内，发 现HSC只能短暂地产生正常血细胞，至 第8周时来源于植入细胞的血细胞几乎全 部消失。同时，如果第6周时将该植入小 鼠的骨髓再次植入第二只小鼠体内，则 未见Bmi-1缺失的血细胞生成。
肿瘤干细胞研究的临床启示
肿瘤干细胞可逃避放疗和化疗药物 的作用， 的作用，是肿瘤耐药和复发的根源
肿瘤干细胞
武汉大学医学院免疫学系
概述
肿瘤-较均质的细胞群体 20世纪50年代提出-异质性-肿瘤干细胞 目前已证实: 白血病干细胞 乳腺癌干细胞 脑癌干细胞
干细胞的分裂特性
它们分裂时,一个子细胞分化成特定类型 的细胞并最终停止分裂,而另一个仍保持 干细胞的特性,以相同的途径再次分裂的 能力
传统观点
癌症干细胞的分离和鉴定
癌症干细胞的分离和鉴定癌症是一种极具威胁性的疾病，目前尚无完全有效治疗方法。
研究发现，癌症干细胞是癌症发生和发展的关键。
因此，分离和鉴定癌症干细胞成为了当前癌症研究的热点之一。
1. 背景癌症干细胞是一类可以自我更新并且具有不成熟状态的细胞。
它们能够长时间分裂，同时也能产生仍旧具有干细胞性的细胞和更多成熟的细胞。
因此，这些细胞是癌症发生和发展的关键。
2. 分离方法癌症干细胞的分离是癌症研究的基础。
科学家们采用了多种方法来分离癌症干细胞，例如：磁性分选法、流式细胞仪分选法和单细胞克隆扩增法等。
磁性分选法利用了磁性珠子和特定的抗体。
这些抗体会与癌症干细胞表面的蛋白质结合，从而将这些细胞与其他细胞分离开来。
流式细胞仪分选法是一种流式细胞术，它可以将细胞按照大小、形状、荧光等性质进行分离。
这种方法可以高效、准确地分离出癌症干细胞。
单细胞克隆扩增法是一种通过单个细胞进行扩增的方法。
这种方法能够避免干扰性因素的影响，同时也可以得到更纯的细胞群。
3. 鉴定方法鉴定癌症干细胞的方法主要包括：静态培养、肿瘤形成实验和移植实验等。
静态培养是一种将细胞在培养皿中培养并观察细胞的形态和特性的方法。
这种方法可以确定细胞的干细胞特性。
肿瘤形成实验是一种将细胞在小鼠体内培养，以观察是否会形成肿瘤。
这种方法可以确定细胞是否具有癌症干细胞的特性。
移植实验是一种将细胞移植到患者体内，观察其对癌症治疗的影响。
这种方法可以验证细胞的干细胞性质以及其对癌症治疗的响应。
4. 发展前景癌症干细胞的分离和鉴定对于癌症治疗具有重要意义。
科学家们通过对癌症干细胞的鉴定，可以确定其对癌症治疗的响应，为临床治疗提供有力的依据。
同时，这些研究也为癌症的早期筛查以及预防提供了新的思路。
值得一提的是，随着人工智能的发展和成熟，机器学习算法在癌症诊断和治疗上的应用也越来越广泛。
一些研究利用机器学习算法，成功地识别出了患有肺癌的患者中，患者起始时是否有高度可能发展出带有癌症干细胞的恶性肿瘤。
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专业
目录
01 肿瘤干细胞的特性 02 肿瘤干细胞分离 03 肿瘤干细胞鉴定 04 几种常见肿瘤2 肿瘤干细胞的分离 03 肿瘤干细胞的鉴定 04 几种常见肿瘤干细胞的分离与鉴定
2
01
肿瘤干细胞特性
1 具有无限增殖和分化潜能
4
01 肿瘤干细胞特性
（2）比例小
肿瘤干细胞主要通过两种方式分裂：一种是对称 分裂，即形成两个相同 的肿瘤干细胞或两个相同 的分化肿瘤细胞；另一种是非对称分裂，即肿瘤 干细胞分裂后形成的两个细胞中有一个细胞不 可 逆地走向分化的终端成为功能专一的分化肿瘤细 胞，而另 一个保持亲代的特征，仍作为肿瘤干细 胞保留下来。由 于这种类似于干细胞的分裂方式 ，低密度的肿瘤干细胞能在 维持自身数量的同时 产生出分化的肿瘤细胞[PMID：19194462]。
（2）流式细胞分选（FACS）
14
02肿瘤干细胞分离
（3）根据生物学特性分离
根据肿瘤干细胞具有的某些生物学特 性将肿瘤干细胞分离筛选出的方法。 如可以通过细胞核对核染料的拒染性 质、肿瘤干细胞体外培养所需的特殊 条件等特性，分离出肿瘤干细胞 [PMID:14711994 ] 。
15
02肿瘤干细胞分离
序，阻断Bid和Bad等促凋亡蛋白引起的线粒体凋亡途径，并进一步阻断胱天蛋白酶凋亡途径，防止肿
瘤干细胞发生凋亡[PMID: 20394737 ]。 7
01 肿瘤干细胞特性
（5）DNA修复能力显著增强
研究发现，肿瘤干细胞内与DNA损伤修复 相关的核酸内切酶、DNA聚合酶和DNA连 接酶等酶蛋白的合成增加、活性增强，增 强了肿瘤干细胞的抗DNA损伤能力，使得 肿瘤干细胞可逃避以DNA损伤为主的肿瘤 治疗手段[PMID: 11751422]。
17
02 肿瘤干细胞分离
（6）联合多种方法分离
在目前的研究中，肿瘤干细胞的分离并不是采用单 一的方法，而是选用两种或者两种以上的分离方法 ，以获得数量更多、纯度更高的肿瘤干细胞。
根据生物学特性分离
无血清培养基分选法(SFM)
1
2
3
4
5
流式细胞分选（FACS）
旁群细胞分选法(SP)
12
02肿瘤干细胞分离
（1）免疫磁珠分选（MACS）
MACS是基于肿瘤干细胞表面特异性抗 原能与连接有磁珠的特异性单克隆抗体 相结合，之后在外部磁场的作用下，连 接有单克隆抗体磁珠的肿瘤干细胞停留 在磁场中，而无特异性表面抗原的肿瘤 细胞则不能与免疫磁珠结合，因而不能 在磁场中停留，从而得以分离出肿瘤干 细胞。[PMID：30009677]。
5
01 肿瘤干细胞特性
（3）具有高端粒酶活性
高活性的端粒酶可抑制细胞增殖过程中端粒长度 的缩 短，延长肿瘤干细胞的增殖寿命，这为肿 瘤干细胞的不断增殖和分化提供了基础条件 [PMID: 20420952 ]。
6
01 肿瘤干细胞特性
（4）抗凋亡家族蛋白过表达
研究发现，大部分肿瘤干细胞中抗凋亡基因Bcl-2的表达量显著增加，从而启动肿瘤干细胞内抗凋亡程
（4）旁群细胞分选法(SP)
肿瘤干细胞具有对核染料Hoechst 33342拒染的特性。Hoechst 33342是一种核酸染料，在紫外光激发下可发出蓝色荧光(波长450 nm左右)和红色荧光(波长650 nm左右)，肿瘤干细胞可将染料外排 ，而不发出荧光，从而可将这类旁群细胞分离出来。 [PMID:14711994]。
5 DNA修复能力显著增强
2 比例小
6 长时间处于G0期
3 具有高端粒酶活性 4 抗凋亡家族蛋白过表达
7 处于低氧环境中 8 表达干细胞特异标志物
3
01 肿瘤干细胞特性
（1）具有无限增殖和分化潜能
肿瘤的发生是一个长期的突变积累过程，在 皮肤及肠黏膜上皮等肿瘤的高发部位，衰老 细胞不断地死去并脱离机体，只有干细胞是 唯一可以长期存在的细胞，有可能积累多次 突变而生成肿瘤干细胞，进而最终形成肿瘤 [PMID: 20420952 ]。
8
01 肿瘤干细胞特性
（6）长时间处于G0期
临床上普遍使用的化疗药物主要是针对增殖旺盛的肿瘤细胞进行杀伤，处在G0期的大多数肿瘤干 细胞能逃避传统肿瘤治疗方法的杀伤，一旦时机成熟或停止用药，它们便成为复发的根源[PMID: 23358473]。
9
01 肿瘤干细胞特性
（7）处于低氧环境中
肿瘤干细胞通常位于由发育良好的三维细胞外基质包裹的低氧环境中，这些细胞外基质起到很好的屏 障作用，尽可能避免了肿瘤干细胞接触到抗肿瘤药物。同时由于射线引起的DNA损伤需要氧气，所 以肿瘤干细胞所处的低氧环境使得放疗对肿瘤干细胞的杀伤作用也非常局限旧。[PMID: 15170446]
13
02 肿瘤干细胞分离
（2）流式细胞分选（FACS）
FACS是通过将待分选的肿瘤细胞和肿瘤干细胞用同一种或多种荧光素标记的特异性抗体标记，根
据肿瘤干细胞与肿瘤细胞结合荧光素标记抗体能力的差异，通过流式细胞仪将肿瘤干细胞分选出
来的方法。[PMID：27517564 ]。 14
02 肿瘤干细胞分离
16
02 肿瘤干细胞分离
（5）无血清培养基分选法(SFM)
在合成培养基的基础上，引入特定的生 长因子和细胞添加剂，使绝大多数肿瘤细胞由于缺乏生长 所必须的血清成分而停止生长，经长时间培养后最终死亡，而 肿瘤干细胞则可以在含特定生长因 子和添加剂的无血清培 养基中呈球状悬浮生长，经几代的培养增殖形成富含肿瘤于 细胞的肿瘤细 胞球在合成培养基的基础上，引入特定的生长因子和细胞添加剂，使绝大多数肿瘤细胞由于缺乏 生长所必须的血清成分而停止生长，经长时间培养后最终死亡，而肿瘤干细胞则可以在含特定生 长因子和添加剂的无血清培养基中呈球状悬浮生长，经几代的培养增殖形成富含肿瘤于细胞的肿 瘤细胞球。[PMID: 14645703] 。
10
01 肿瘤干细胞特性
（8）表达干细胞特异标志物
这些特异性蛋白或标志物在肿瘤干细胞 的增殖、肿瘤干细胞分化成肿瘤组织周 围所必须的血管等组织、肿瘤干细胞的 迁移等过程中发挥至关重要的作用。利 用这些特异性的表面标志物达到肿瘤干 细胞分离或鉴定的目的。
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02 肿瘤干细胞分离
免疫磁珠分选（MACS）