常用的单克隆抗体检测方法
单克隆抗体的抗体检测原理
单克隆抗体的抗体检测原理单克隆抗体是由单个克隆细胞分泌的抗体所组成的，具有高度的特异性和亲和性。
抗体检测是一种重要的生物分析技术，它可以用于检测、定量和鉴定特定分子的存在和表达水平。
单克隆抗体的抗体检测原理主要包括特异性识别、抗原结合和信号放大等过程。
首先，单克隆抗体具有高度的特异性，可以识别并结合到特定的抗原分子上。
在抗原与抗体结合时，抗体的可变区域与抗原表面的特定区域形成互补的结合，从而实现抗原的特异性识别。
这种特异性识别可以使得单克隆抗体只与目标分子结合，而不与其他非特异性分子发生交互作用。
接下来，抗原与抗体的结合可以通过多种方式进行检测。
其中，最常用的方法是免疫荧光检测和酶联免疫吸附试验（ELISA）。
在免疫荧光检测中，抗体与荧光染料标记的二抗结合，形成复合物后通过荧光显微镜观察荧光信号的强度和分布情况，从而获得目标分子的定性和定量信息。
而在ELISA中，抗体会与酶标记的二抗结合，通过底物的化学反应产生可测量的信号，例如颜色变化。
通过比较信号的强度和标准曲线，可以确定目标分子的存在和浓度。
此外，为了增强检测信号的灵敏度和准确性，还可以采用信号放大的策略。
常用的信号放大方法有放射性同位素标记、荧光信号放大和报告基因放大等。
放射性同位素标记是将放射性同位素与抗体结合，通过放射性的衰变过程来产生可测量的信号。
荧光信号放大是将荧光染料标记于抗体上，通过扩增荧光信号的强度来提高检测的敏感度。
而报告基因放大是将报告基因与抗体结合，通过报告基因的表达来产生可测量的信号。
这些信号放大的方法可以有效提高抗体检测的灵敏度。
总结起来，单克隆抗体的抗体检测原理主要包括特异性识别、抗原结合和信号放大等过程。
通过这些过程，可以实现对目标分子的高特异性和高敏感性的检测。
抗体检测技术已经在医学诊断、生物学研究、食品安全等领域得到广泛应用，对于人类健康和生命科学研究具有重要意义。
常用的单克隆抗体检测方法
常用的单克隆抗体检测方法单克隆抗体检测方法是一种常用的实验技术，用于检验抗体的特异性和亲和力。
以下是几种常用的单克隆抗体检测方法：1. 免疫组化（Immunohistochemistry，IHC）：免疫组化是一种常见的单克隆抗体检测方法，用于检测组织学样本或细胞涂片中特定分子的表达情况。
该方法利用免疫反应来检测抗原-抗体的结合。
首先，将样品固定在载玻片上，然后用单克隆抗体特异地结合目标抗原。
通过可视化标记物，如酶或荧光标记物，可以检测到抗原-抗体的结合，从而实现对特定分子的检测。
2. 免疫印迹（Western Blotting）：免疫印迹是一种常用的单克隆抗体检测方法，用于分析蛋白质的存在和相对数量。
在这个方法中，蛋白质样本通过电泳分离，并转移到薄膜上。
然后，薄膜与特异的单克隆抗体结合，用于检测目标蛋白质的存在。
最后，通过可视化标记物实现目标蛋白质的检测。
免疫印迹可用于研究蛋白质的表达量、分子量和剪接变异等。
3. 流式细胞术（Flow Cytometry）：流式细胞术是一种常用的单克隆抗体检测方法，用于检测细胞表面标记物的存在和表达水平。
在这个方法中，通过单克隆抗体标记标记物，然后通过激光照射悬浮在流式细胞仪中的细胞。
细胞经过激光激发后，通过检测散射和荧光信号，可以确定单个细胞的性质和数量。
流式细胞术广泛应用于细胞免疫学和细胞生物学中。
4. 免疫沉淀（Immunoprecipitation，IP）：免疫沉淀是一种常用的单克隆抗体检测方法，用于富集靶蛋白及与其相互作用的蛋白质。
在这个方法中，样品中的蛋白质与特异的单克隆抗体结合形成免疫复合物。
然后，通过添加沉淀剂，如蛋白A/G琼脂糖，将免疫复合物富集并沉淀下来。
最后，通过洗涤和分离，可以得到蛋白质的纯化，并用其他方法进一步分析。
5. 酶联免疫吸附试验（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA）：酶联免疫吸附试验是一种常用的单克隆抗体检测方法，用于测定抗原或抗体的存在和浓度。
单克隆抗体的鉴定
单克隆抗体的鉴定引言：单克隆抗体是一种重要的生物医学研究工具，可用于疾病的诊断、治疗和药物研发等领域。
单克隆抗体的鉴定是确保其特异性、亲和性和稳定性的重要步骤，以保证其在实际应用中的准确性和可靠性。
本文将介绍单克隆抗体鉴定的基本原理、常用的鉴定方法和相关的实验步骤。
一、单克隆抗体鉴定的基本原理单克隆抗体鉴定的基本原理是通过筛选和鉴定细胞克隆，确定具有特定抗原识别能力的单个细胞克隆，然后将其扩增并纯化得到单克隆抗体。
鉴定的关键在于筛选出具有高特异性、高亲和力和稳定性的单克隆抗体。
二、单克隆抗体鉴定的常用方法1. 杂交瘤技术：杂交瘤技术是最常用的单克隆抗体鉴定方法之一。
该技术通过将抗原刺激的B细胞与骨髓瘤细胞融合，形成杂交瘤细胞，然后通过限稀稀释法或酶联免疫吸附试验（ELISA）筛选出特异性抗原的单克隆抗体。
2. 胶体金法：胶体金法是一种快速、灵敏的单克隆抗体鉴定方法。
该方法利用胶体金颗粒与抗原或抗体的特异性结合，形成可见的颜色反应，通过观察颜色变化来确定是否存在特定的抗原-抗体反应。
3. 免疫组化技术：免疫组化技术是一种广泛应用于单克隆抗体鉴定的方法。
该技术通过将细胞或组织样本与单克隆抗体反应，然后通过显色剂或荧光染料来观察特定抗原的表达情况，以判断单克隆抗体的特异性和亲和力。
三、单克隆抗体鉴定的实验步骤1. 抗原制备：首先需要制备纯化的抗原，可通过基因工程技术获得重组蛋白或通过提取生物体中的抗原蛋白。
2. 免疫动物免疫：将抗原注射到小鼠等免疫动物体内，激发其免疫系统产生特异性抗体。
3. 杂交瘤细胞融合：将免疫动物的脾细胞与骨髓瘤细胞融合，形成杂交瘤细胞。
4. 杂交瘤细胞筛选：通过限稀稀释法或ELISA等方法筛选出特异性抗原的单克隆抗体。
5. 单克隆抗体扩增：将筛选出的单克隆抗体进行扩增，并经过多次培养和纯化，以获得足够的纯净抗体。
6. 单克隆抗体鉴定：通过免疫组化技术、胶体金法等方法对单克隆抗体进行鉴定，确定其特异性、亲和力和稳定性。
常用的单克隆抗体检测方法
常用的单克隆抗体检测方法通过杂交瘤技术制备单克隆抗体，在杂交瘤制备完成后，需要对抗体进行一个检测，本文介绍了几种常用的抗体检测的方法（1）免疫酶技术免疫酶技术是将抗原抗体反应的特异性和酶对底物显色反应的高效催化作用有机结合而成的免疫学技术。
由于它特异性强，灵敏度高，现已广泛用于筛选和鉴定单抗。
①器材和试剂a、包被缓冲液：碳酸盐缓冲液：取L Na2CO3 8ml，L NaHCO3 17ml混合，再加75ml 蒸馏水，调PH至。
Tris-HCl缓冲液（，L）：取L Tris 100ml，L HCl 混合，加蒸馏水至1000ml。
b、洗涤缓冲液（的PBS）：KH2PO4 ，KCl ，Na2HPO4·12H2O ，NaCl ，Tween-20 ，加蒸馏水至1000ml。
c、稀释液和封闭液：牛血清白蛋白（BSA），加洗涤液至100ml；或用洗涤液将小牛血清配成5-10%使用。
d、酶反应终止液（2mol/L H2SO4）：取蒸馏水，滴加浓硫酸（98%）。
e、底物缓冲液（，磷酸盐-柠檬酸缓冲液）：取L Na2HPO4 ，L柠檬酸，再加50ml蒸馏水。
柠檬酸溶液及配成的底物缓冲液不稳定，易形成沉淀，因此一次不宜配制过多。
f、底物使用液：OPD底物使用液（测490nm的OD值）：OPD 5mg，底物缓冲液10ml，3% H2O2 。
TMBS或TMB底物使用液（测450nm的OD值）：TMBS或TMB（1mg/ml），底物缓冲液10ml，1% H2O2 25ul。
ABTS底物使用液（测410nm的OD值）：ABTS ，底物缓冲液1ml，3% H2O2 2ul。
g、抗体对照：以骨髓瘤细胞培养上清作为阴性对照，以免疫鼠血清作为阳性血清。
h、抗原：可溶性抗原：尽量纯化，以获得高特异性。
病毒感染的传代细胞或全菌抗原。
淋巴细胞等悬液。
i、酶标抗鼠抗体或酶标SPA或其他类似试剂。
j、细胞固定液：-20℃丙酮；或丙酮-甲醛固定液：Na2HPO4 100mg，KH2PO4 500mg，蒸馏水150ml，丙酮225ml，甲醛125ml；或丙酮-甲醛溶液（1；1）；或-20℃甲醇。
ELISA法测定单克隆抗体的效价的操作步骤
ELISA法测定单克隆抗体的效价的操作步骤摘要：ELISA是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术。
免疫酶技术是将酶标记在抗体/抗原分子上，形成酶标抗体/酶标抗原，称为酶结合物。
该酶结合物的酶在免疫反应后，作用于底物使之呈色，根据颜色的有无和深浅，定位或定量抗原/抗体。
找产品，上生物帮>> >>一、实验目的1、深入了解ELISA法测定抗体效价的原理。
2、掌握ELISA法测定单克隆抗体效价的方法。
间接ELISA效价图二、实验原理ELISA是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术。
免疫酶技术是将酶标记在抗体/抗原分子上，形成酶标抗体/酶标抗原，称为酶结合物。
该酶结合物的酶在免疫反应后，作用于底物使之呈色，根据颜色的有无和深浅，定位或定量抗原/抗体。
ELISA法是免疫酶技术的一种，其特点是利用聚苯乙烯微量反应板(或球)吸附抗原/抗体，使之固相化，免疫反应和酶促反应都在其中进行。
在每次反应后都要反复洗涤，这既保证了反应的定量关系，也避免了末反应的游离抗体/抗原的分离步骤。
在ELISA法中。
酶促反应只进行一次，而抗原、抗体的免疫反应可进行一次或数次，即可用二抗(抗抗体)、三抗再次进行免疫反应。
目前常用的几种ELISA方法有：测定抗体的间接法，测定抗原的双抗体夹心法和测定抗原的竞争法等。
本实验采用间接法测定单克隆抗体效价。
其主要过程为：首先将已知定量抗原吸附在聚苯乙烯微量反应板的凹孔内，加待测抗体，保温后洗涤以除去未结合的杂蛋白质，加酶标抗抗体，保温后洗涤，加底物保温30分钟后，加酸或碱终止酶促反应，用目测或光电比色测定抗体含量。
三、仪器、原料和试剂仪器聚苯乙烯96孔酶标板、微量移液管、酶联免疫阅读仪、水浴锅。
原料单克隆抗体试剂1、抗原及酶标记抗体①抗原：兔抗人IgG(RabbitAanti-humanIgG，CodeNo.A0423);②酶标抗抗体：兔抗鼠IgG-HRP(RabbitAnti-mouseIgG-HRP，CodeNo.P0260);均为DAKO公司产品，使用时按照说明书要求稀释。
单克隆抗体的应用及原理
单克隆抗体的应用及原理单克隆抗体是指由单一细胞株产生的、只针对特定抗原的抗体。
相对于多克隆抗体，单克隆抗体具有更高的特异性和稳定性，因此在医学、生物学、生物技术等领域有着广泛的应用。
本文将从单克隆抗体的原理、制备方法和应用三个方面进行介绍。
一、单克隆抗体的原理单克隆抗体的制备基于生物学中的免疫原理。
当机体受到外来抗原的侵袭时，免疫系统会产生对抗原的免疫应答，其中的一种反应是产生抗体。
抗体是一种由免疫细胞（主要是B细胞）合成的蛋白质，它可以结合到抗原表面的特定区域（抗原决定簇，Epitope），从而识别和中和抗原。
抗体的结构包括两个重链和两个轻链，每个链都含有一个可变区（variable region，V区）和一个恒定区（constant region，C区）。
V区是抗体分子中最为多样化的部分，它决定了抗体的特异性。
当抗原与B细胞表面的抗体结合后，B细胞会被激活并分化成浆细胞，进而产生大量的抗体分子。
单克隆抗体的制备过程中，需要先制备出特定的抗原。
然后，将该抗原注射到小鼠等动物体内，激活其免疫系统产生抗体。
接着，从动物的脾脏等淋巴组织中分离出B细胞，并将其与肿瘤细胞融合，形成一种称为杂交瘤（hybridoma）的细胞。
杂交瘤细胞既具有B细胞的抗体合成能力，又具有肿瘤细胞的无限增殖能力。
在一系列的筛选和鉴定过程中，可以筛选出只针对特定抗原的单克隆抗体细胞株，进而大规模制备单克隆抗体。
二、单克隆抗体的制备方法单克隆抗体的制备主要包括以下几个步骤：1. 抗原的制备：首先需要准备出特定的抗原，可以是蛋白质、多肽、糖类、药物等。
2. 动物免疫：将抗原注射到小鼠等动物体内，激活其免疫系统产生抗体。
注射的方式有多种，如皮下注射、腹腔注射、静脉注射等。
3. B细胞的分离：从动物的脾脏等淋巴组织中分离出B细胞，可以使用离心、梯度离心等方法。
4. 杂交瘤的制备：将B细胞与肿瘤细胞融合，形成一种称为杂交瘤的细胞。
杂交瘤细胞既具有B细胞的抗体合成能力，又具有肿瘤细胞的无限增殖能力。
辛酸-硫酸铵法纯化单克隆抗体
辛酸-硫酸铵法纯化单克隆抗体??辛酸-硫酸铵法纯化单克隆抗体(一) 原理蛋白质在溶液中的溶解度取决于蛋白质周围亲水基团与水形成水化膜的程度, 以及蛋白质分子带有的电荷。
如改变这两个因素,蛋白质就容易沉淀折出。
引起蛋白质沉淀的主要方法有(1) 盐析, 即加入大量中性盐破坏蛋白质的胶体稳定性而使其析出, 沉淀不同蛋白质所需盐浓度及pH 值不同;(2) 生物碱以及某些酸类, 在pH 值小于等电点时可以与蛋白质形成不溶的盐使其沉淀;(3) 重金属离子如隶、铅、铜、银等, 在pH 值大于等电点时可以与蛋白质结合成不溶的盐使其沉淀;(4) 有机溶剂如酒精、甲醇、丙酮等, 对水的亲和力很大, 能破坏蛋白质水化膜, 在等电点时使蛋白质沉淀。
辛酸(caprylic acid) 在偏酸条件下能与血清或腹水中除IgG外的其他蛋白质结合并将其沉淀下来,IgG 则溶于上清液中, 再用硫酸镀盐析, 即可达到纯化IgG 的目的。
辛酸-硫酸铵法是目前实验室中较常用的纯化单克隆抗体的方法, 利用该方法纯化单克隆抗体, 回收率和纯度都可达80% 以上。
(二) 试剂和器材1. 试剂(1) 小鼠腹水。
(2) 硫酸铵或饱和硫酸铵溶液。
称(NH4)2S04(AR)400~425 克, 以50 ℃~80 ℃蒸馆水500ml溶解, 搅拌2O min, 趁热过滤。
冷却后以浓氨水(15M NH40H) 调pH 值至7.4 。
配制好的饱和硫酸铵, 瓶底应有结晶析出。
(3)0.06M pH 4.8 醋酸盐缓冲液。
贮存液: A 液,0.06M NaAc: 无水NaAc0.49218g 加蒸馆水至100mlB 液,0.06M HAc: 冰醋酸0.344ml 加蒸馆水至100ml应用液: 取上述 A 液59ml 与 B 液41ml 昆合, 用5M NaOH 调pH 值至 4.80.(4)0.lM pH 7.4 磷酸盐缓冲液(PBS). 取Na2HP04 · 12H20 28.94g,KH2P04 2.61g, 加蒸馆水至100Om1(5) 含137mM NaCl 2.6mM KCl 0.2mM EDTA 的pH 7.4 磷酸盐缓冲液(PBS): 取Na2HP04 12H20 28.94g KH2P04 2.61g NaC1 8.Og 、KCl 0.2g EDTA 0.06g, 加蒸馆水至100Oml2. 器材普通冰箱、低温离心机、电磁搅拌器, 紫外分光光度计、天平; 透析袋、塑料夹、精密pH 试纸; 烧杯、量桶、吸管、滴管、小瓶等。
单克隆抗体等电点
单克隆抗体等电点
单克隆抗体（mAb）的一个重要特征是它们的等电点（pI），本质上是抗体不带净电荷时的pH值，该值取决于抗体所含的带电氨基酸。
如果周围环境的pH值低于抗体的pI，则该分子带有净正电荷，而当pH值高于pI时，抗体将带有净负电荷。
在评估治疗性抗体的药代动力学（PK）特性时，靶介导的药物处置（TMDD）与非靶标相关机制都会影响整体PK行为，pI是后者的重要因素。
由于大多数细胞表面带负电荷，抗体需要带正电荷以进行有效的液相内吞作用（胞饮作用），因此环境pH值需要低于抗体的pI。
常用的检测单克隆抗体等电点的方式有电聚焦凝胶电泳（IEF）、阳离子交换色谱（CEX）、阴离子交换色谱、毛细管等电聚焦（CIEF），以及成像毛细管等电聚焦（iCIEF）等。
等电点值反映了蛋白质药物电荷与空间构象的均一性。
在实际应用中，单克隆抗体等电点的准确测定对于抗体药物的生产和质量控制至关重要。
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常用的单克隆抗体检测方法通过杂交瘤技术制备单克隆抗体，在杂交瘤制备完成后，需要对抗体进行一个检测，本文介绍了几种常用的抗体检测的方法（1）免疫酶技术免疫酶技术是将抗原抗体反应的特异性和酶对底物显色反应的高效催化作用有机结合而成的免疫学技术。
由于它特异性强，灵敏度高，现已广泛用于筛选和鉴定单抗。
①器材和试剂a、包被缓冲液：碳酸盐缓冲液：取0.2mol/L Na2CO3 8ml，0.2mol/L NaHCO3 17ml混合，再加75ml蒸馏水，调PH至9.6。
Tris-HCl缓冲液（PH8.0，0.02mol/L）：取0.1mol/L Tris 100ml，0.1mol/L HCl 58.4ml混合，加蒸馏水至1000ml。
b、洗涤缓冲液（PH7.2的PBS）：KH2PO4 0.2g，KCl 0.2g，Na2HPO4·12H2O 2.9g，NaCl 8.0g，Tween-20 0.5ml，加蒸馏水至1000ml。
c、稀释液和封闭液：牛血清白蛋白（BSA）0.1g，加洗涤液至100ml；或用洗涤液将小牛血清配成5-10%使用。
d、酶反应终止液（2mol/L H2SO4）：取蒸馏水178.3ml，滴加浓硫酸（98%）21.7ml。
e、底物缓冲液（PH5.0，磷酸盐-柠檬酸缓冲液）：取0.2mol/L Na2HPO4 25.7ml，0.1ml/L柠檬酸24.3ml，再加50ml蒸馏水。
柠檬酸溶液及配成的底物缓冲液不稳定，易形成沉淀，因此一次不宜配制过多。
f、底物使用液：OPD底物使用液（测490nm的OD值）：OPD 5mg，底物缓冲液10ml，3% H2O2 0.15ml。
TMBS或TMB底物使用液（测450nm的OD值）：TMBS或TMB（1mg/ml）1.0ml，底物缓冲液10ml，1% H2O2 25ul。
ABTS底物使用液（测410nm的OD值）：ABTS 0.5mg，底物缓冲液1ml，3% H2O2 2ul。
g、抗体对照：以骨髓瘤细胞培养上清作为阴性对照，以免疫鼠血清作为阳性血清。
h、抗原：可溶性抗原：尽量纯化，以获得高特异性。
病毒感染的传代细胞或全菌抗原。
淋巴细胞等悬液。
i、酶标抗鼠抗体或酶标SPA或其他类似试剂。
j、细胞固定液：-20℃丙酮；或丙酮-甲醛固定液：Na2HPO4 100mg，KH2PO4 500mg，蒸馏水150ml，丙酮225ml，甲醛125ml；或丙酮-甲醛溶液（1；1）；或-20℃甲醇。
k、聚苯乙烯微孔板：40孔、96孔、或条孔；硬板或软板均可使用。
l、酶联免疫阅读仪；或光镜。
m、吸管、加样器及水浴箱、离心机等。
②可溶性抗原的酶联免疫吸附试验（ELISA）a、纯化抗原用包被液稀释至1-20ug/ml。
b、以50-100ul/孔量加入酶标板孔中，置4℃过夜或37℃吸附2小时。
c、弃去孔内的液体，同时用洗涤液洗3次，每次3-5分钟，拍干。
d、每孔加200ul封闭液4℃过夜或37℃封闭2小时；该步骤对于一些抗原，可省略。
e、洗涤液洗3次；此时包被板可-20℃或4℃保存备用。
f、每孔加50-100ul待检杂交瘤细胞培养上清，同时设立阳性、阴性对照和空白对照；37℃孵育1-2小时；洗涤，拍干。
g、加酶标第二抗体，每孔50-100ul，37℃孵育1-2小时，洗涤，拍干。
h、加底物液，每孔加新鲜配制的底物使用液50-100ul，37℃10-30分钟。
i、以2mol/L H2SO4终止反应，在酶联免疫阅读仪上读取OD值。
j、结果判定：以P/N2.1，或PN+3D为阳性。
若阴性对照孔无色或接近无色，阳性对照孔明确显色，则可直接用肉眼观察结果。
③全菌抗原的ELISASa、新鲜培养的细菌用蒸馏水或PBS悬浮，并调整细菌浓度至1×108个/ml。
必须指出，对于人畜共患病病原体需注意安全操作，最好是灭活处理。
b、每孔中加100ul 5%戊二醛溶液（0.1mol/L NaHCO3 95ml+25%戊二醛溶液5ml），37℃作用2小时，蒸馏水洗涤3次；加上述细菌悬液50ul/孔；37-56℃烘干；每孔加200ul封闭液4℃过夜或37℃ 2小时封闭。
c、步骤b也可采用先每孔加50ul细菌悬液，37℃-56℃烘干，然后用-20℃预冷的无水甲醇室温作用15分钟，蒸馏水洗涤3次；每孔加200ul封闭液4℃过夜或37℃ 2小时封闭。
d、洗涤液洗3次；此时包被板可在-20℃或4℃保存备用。
e、以下步骤同上法。
④用全细胞抗原的ELISAa、按常规方法培养细胞，接种病毒，收获感染细胞和未感染细胞，进行细胞计数，用PBS制成适当浓度悬液。
b、淋巴细胞悬液的制备采用新鲜外周血加肝素抗凝后，滴加于淋巴细胞分离液之上，1500rpm离心30分钟，吸取界面细胞洗涤二次，即为新鲜淋巴细胞悬液。
该细胞悬液中若仍混有红细胞，离心后加0.83%的氯化铵溶液，室温10分钟，洗涤一次即可。
将该细胞悬液稀释至适当浓度。
c、每孔加100ul上述a或b的细胞悬液，使每孔含细胞5×104个；1500r/min 15分钟，甩去上清；室温干燥或吹干后用丙酮-甲醇（1：1）4℃固定10分钟；可4℃或-20℃保存备用。
d、以下步骤同上法。
⑤抗体捕捉ELISA试验本法用抗BALB/c小鼠Ig的多克隆抗体捕捉待检样品中的McAb，再依次加抗原、酶标多克隆抗体及底物显色。
该法是常用的ELISA中较理想的一种；其操作步骤如下：a、以适当浓度的纯化抗鼠Ig抗体包被酶标板，每孔加100ul，37℃ 2小时或4℃过夜。
b、洗涤、拍干后加待测的McAb样品，37℃ 1-2小时。
c、洗涤后加适量的抗原，37℃ 1-2小时。
d、洗涤后加入酶标多克隆抗体，37℃ 1-2小时。
洗涤后加底物显色，判定结果。
⑥ABC-ELISA试验ABC-ELISA是在常规ELISA原理的基础上，增加了生物素（Biotin）与亲和素（Avidin）间的放大作用。
亲和素有4个亚单位组成，对生物素有高度的亲合力。
生物素很易与蛋白质共价结合。
因此，结合了酶的亲和素与结合有抗体的生物素发生反应即起到了多极放大作用。
其操作步骤如下：a、已知抗原的包被及加待检McAb样品，同间接ELISA试验。
b、加生物素化抗鼠Ig抗体，每孔100ul，37℃ 1小时；洗涤。
c、加酶标亲和素，每孔100ul，37℃ 30分钟洗涤；加底物显色，判定结果。
⑦Dot-ELISA试验免疫斑点试验（Dot-ELISA）是以硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜为固相载体，进行抗原抗体反应的免疫检测手段。
该法采用不溶性底物（如DAB，或4-氯萘酚或AgNO3等），其与相应标记物（HRP、AP、胶体金）作用形成不溶性产物，呈现斑点状着色，从而易于判定结果。
根据所用的标记物不同，可分为HRP 免疫斑点试验、AP免疫斑点试验和免疫金银斑点法等。
其操作步骤大致如下：a、将抗原液2-5ul点加于纤维素膜上，室温37℃干燥。
b、将纤维膜浸入封闭液中，37℃ 30分钟。
c、用洗涤液洗2次，吸干后加待检McAb样品，37℃ 1小时；用洗涤液振荡洗涤三次，每次5分钟，加HRP或AP或胶体金标记的抗鼠Ig抗体，37℃作用30分钟。
d、同法洗涤，吸干，用新配的相应底物溶液显色，然后水洗终止反应，观察结果。
⑧免疫组化染色法该法主要用于检测针对细胞抗原成分的McAb，常用的方法是间接免疫过氧化物酶试验（IIP，indirect immunoperoxidase）及APAAP技术。
其结果用光镜或倒置显微镜检查。
（2）免疫荧光技术免疫荧光技术可用于多种抗原的杂交瘤抗体检测，如细胞性抗原（包括细菌和动物细胞）、感染细胞中的病毒抗原和膜抗原等。
其操作简单、敏感性高，可直接观察抗原定位等优点，在McAb的筛选与鉴定上具有重要的应用价值。
①器材和试剂a、供检测抗体用的抗原制备固定细胞片或板，活细胞悬液。
b、PBS（PH7.2，0.01mol/L）c、待检的McAb样品。
d、冷丙酮e、FITC（异硫氰酸荧光素）或TRITC（四甲基异硫氰酸罗丹明荧光素）标记的抗鼠Ig抗体等f、荧光显微镜，磁力搅拌器，离心机，水浴箱等。
②间接免疫荧光法a、固定细胞片的制备：生长在盖片上的细胞（接种或未接种病毒），可直接收获盖片，在PBS中洗涤，用4℃丙酮固定10分钟，空气干燥，置密封容器于-20℃保存备用；单细胞悬液可在盖片上制成涂片，固定方法同上。
细胞涂片的制备：将10ul细菌悬液（1×108个/ml）涂抹7×21mm盖片上，自然干燥后，用-20℃丙酮固定10-15分钟，于-20℃保存备用。
b、盖片在去离子水中湿润后置架上滴加10-20ul杂交瘤上清或其他待检样品；设立阳性、阴性对照；置37℃水浴孵育0.5-1小时。
c、取出盖片置PBS中用磁力搅拌器洗涤15分钟。
d、盖片置架上，滴加工作浓度的抗鼠Ig的荧光抗体10-20ul，37℃孵育0.5-1小时。
e、同法洗涤15分钟；取出盖片，用延缓荧光碎灭的封载剂（如缓冲甘油，9份甘油加1份PBS）封于干净载玻片上。
f、光显微镜上观察，阳性结果可见特异性荧光（FITC为黄绿色荧光，TRITC为桔红色荧光）。
g、细胞固定片的制备，也可改在培养板孔中进行，其余步骤同上，在观察结果时，将培养板翻转置于荧光显微镜下，判断标准不变。
③细胞的膜荧光染色完整的活细胞的细胞膜，抗体不能透过。
如果细胞在4℃操作，则荧光染色仅限于细胞膜。
必须注意死细胞常以非特异性方式吸附大量荧光抗体，因此试验过程中要保证细胞的高活力。
活细胞的膜荧光染色大致步骤如下：a、制备活性较好的细胞悬液，调节浓度至107个/ml。
b、在小试管（5×50mm）中加入100ul细胞悬液，再加入100ul 待检McAb的样品，混匀，4℃作用30-90分钟。
c、用洗涤液（PBS 900ml，小牛血清50ml，4%NaN3 50ml）洗二次，每次加洗涤液1-5ml，1000r/min离心5分钟，弃上清。
加入100ul荧光抗体，4℃作用30-90分钟。
d、同法洗涤，将细胞重新悬于20-30ul含10%甘油和10-100ug 苯二胺/ml的溶液中；滴加于载玻片上，加盖片封载。
e、立即在荧光显微镜上检查。
f、细胞也可在染色后用1%多聚甲醛生理盐水固定，立即检查，或至少在4℃可保存一周。
（3）间接血凝试验间接血凝试验又称被动血凝试验（PHA），是目前应用较广的检测方法之一。
本试验是以包被可溶性抗原的红细胞作为指示系统，当被检抗体与包被在红细胞上的抗原产生特异性反应时，导致红细胞呈凝集现象。
可见，该法具有灵敏、快速、容易操作和无需昂贵仪器等优点，而且经改用醛化红细胞以后，克服原来重复性差的缺点。
①器材和试剂a、绵羊抗凝血，或人“O”型抗凝血。