免疫斑点试验
酶联免疫斑点试验检测技术(Elispot)在诊断结核性脑膜炎中的应用
提供 ， 脑脊液 Ｔ — Ｎ Ｐ Ｒ） 平 ≥５０ ｃｐｅ／ ｌ 断 为 阳 ＢＤ Ａ（ Ｃ 水 ０ ｏ ｉ ｍ 判 ｓ
性 ， ５ ０ｃｐｅ ｍ 判 断 为 阴 性 。 检 测 结 果 使 用 Ｐｉ ５０软 ＜ ０ ｏｉ ／ ｌ ｓ ｒｍ ． ｓ
件包进行数据统计和统计学分析。两组 间率 的比较采用卡方
特 异 性 ｒ 扰 素 （Ｆ —） 平 可 以 用 于 结 核 分 枝 杆 菌 感 染 的 干 ＩＮ ｒ 水
断为 阳性 ， 抗 原 检 测 结 果 为 阴性 ， 果 判 断 为 阴 性 ； 有 ３种 结 所 脑 膜 脑 炎 病 例 均 常 规 行 脑 脊 液 Ａ Ａ、 脊 液 Ｔ — Ｎ Ｐ Ｒ） Ｄ 脑 Ｂ Ｄ Ａ（ Ｃ
检测 。脑脊 液 Ａ Ａ使 用 酶 标 法 进 行 检 测 ， 据 国 内 同行 Ｄ 根 ２０ ０４年对脑脊 液 Ａ Ａ在结 核性脑 膜脑 炎 中研 究 的标准 Ｊ Ｄ ， 脑脊液 Ａ Ａ１８Ｕ Ｌ判断为 阳性 ， ８Ｕ Ｌ判断为阴性 ； Ｄ ＞ ／ ＜ ／ 脑脊
液 Ｔ —Ｎ Ｂ Ｄ Ａ荧 光 定 量 聚 合 酶 链 反 应 试剂 由达 安 基 因有 限 公 司
选 非 结 核 性 脑 膜 脑 炎 病 例 均 通过 临床 治 疗 转 归 及 实 验室 检 查 最终确诊 。
方 法
所 有 病 例 均抽 取 乙 二 胺 四 乙 酸 （ Ｄ Ａ） 凝 血 ５ｍ ， ＥＴ 抗 ｌ送
实 验 室 行 Ｅｉ ｏ检 测 。检 测 结 果 根 据 斑 点 数 量 设 定 ， 一 反 ｌｐ ｔ ｓ 每
术 在 结 核 性 脑 膜脑 炎 中 的应 用 价 值 。
临 床 资 料
、
果
在 ７ 例 结 核 性 脑 膜 脑 炎 的 诊 断 中 ，ｌｐ ｔ 性 者 ４ ３ Ｅｉ ｏ 阳 ｓ ５
免疫检验考试辅导：斑点免疫层析试验
斑点免疫层析试验（dotimmunochromatographicassay，DICA）简称免疫层析试验（ICA），也以硝酸纤维素膜为载体，但利用了微孔膜的毛细血管作用，滴加在膜条一端的液体慢慢向另一端渗移，犹如层析一般。
（二）试剂和操作
免疫层析试验以单克隆双抗体夹心法为例。
试验所用试剂全部为干试剂，多个试剂被组合在一个约6mm×70mm的塑料板条上，成为一单一试剂条，试剂条上端（A）和下端（B）分别粘贴吸水材料，免疫金复合物干片粘贴在近下端（C）处，紧贴其上为硝酸纤维素膜条。
硝酸纤维素膜条上有两个反应区域，测试区（T）包被有特异抗体，参照区（R）包被有抗小鼠IgG。
测定时将试纸条下端浸入液体标本中，下端吸水材料即吸取液体向上端移动，流经C处时使干片上的免疫金复合物复溶，并带动其向膜条渗移。
若标本中有待测特异抗原，其时可与免疫金复合物之抗体结合，此抗原抗体复合物流至测试区即被固相抗体所获，在膜上显出红色反应线条（T）。
过剩的免疫金复合物继续前行，至参照区与固相小鼠IgG结合（免疫金复合物中的单克隆抗体为小鼠IgG），而显出红色质控线条（R）。
反之，阴性标本则无反应线条，而仅显示质控线条。
斑点免疫层析试验在试剂形式和操作步骤上较前述的几种免疫测定法都更为简化，只用一个试剂，只有一步操作。
免疫酶斑点试验
应用领域
临床诊断
药物筛选
用于检测感染性疾病、自身免疫性疾病、 肿瘤等疾病的相关抗原或抗体，辅助临床 诊断和制定治疗方案。
用于筛选和鉴定药物的靶点、研究药物的 免疫活性等。
食品安全检测
环境监测
用于检测食品中的病原微生物、毒素等有 害物质。
用于检测环境中的有害物质、污染物等， 保障环境安全。
02
免疫酶斑点试验的原理与技术
肿瘤
免疫酶斑点试验也可用于肿瘤标志物的检测，如癌胚抗原、甲胎蛋白 等，有助于肿瘤的早期发现和监测。
在药物研发中的应用
新药筛选
免疫酶斑点试验可用于筛选和鉴定具有药理活性的小分子 化合物，为新药研发提供有力支持。
药物代谢研究
通过免疫酶斑点试验可以研究药物在体内的代谢过程，了 解药物在体内的分布、代谢和排泄情况，为药物设计和优 化提供依据。
04
免疫酶斑点试验的结果分析
阳性结果的判定
01
02
03
斑点颜色明显
如果斑点颜色深且清晰， 与背景形成明显对比，通 常被认为是阳性结果。
斑点大小
斑点大小超过一定阈值通 常被认为是阳性，具体阈 值可能因试验而异。
周围晕圈
在阳性结果中，有时会出 现围绕斑点的浅色晕圈， 这有助于识别阳性斑点。
阴性结果的判定
药物疗效评估
免疫酶斑点试验可检测药物对靶点的抑制作用，评估药物 的疗效和安全性，为临床用药提供参考。
在生物科学研究中的应用
01
蛋白质组学研究
免疫酶斑点试验可用于蛋白质组学研究，检测蛋白质的表达和修饰情况，
了解蛋白质的功能和作用机制。
02
细胞信号转导研究
通过免疫酶斑点试验可以检测细胞内信号转导通路的活性变化，了解细
酶联免疫斑点试验
酶联免疫斑点试验
酶联免疫斑点试验（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，简称ELISPOT）是一种高灵敏度的免疫学检测技术，可用于检测单个细胞
的分泌物，如细胞因子、抗体、酶等。
该技术广泛应用于疾病诊断、
药物筛选、疫苗研究等领域。
ELISPOT的原理是利用特定的抗体捕获分泌物，然后使用酶标记的二
抗或底物来检测捕获的分泌物。
具体步骤如下：
1. 准备试板：将多孔板涂上特定的抗体，使其能够捕获分泌物。
2. 细胞处理：将待检测的细胞加入试板中，使其与涂有抗体的孔相互
作用。
3. 洗涤：将试板洗涤，去除未结合的细胞和其他杂质。
4. 二抗标记：加入酶标记的二抗，使其与捕获的分泌物结合。
5. 洗涤：将试板洗涤，去除未结合的二抗和其他杂质。
6. 底物反应：加入底物，使其与酶标记的二抗反应，产生可见的斑点。
ELISPOT的优点是灵敏度高、特异性好、操作简单、结果可靠。
它可
以检测单个细胞的分泌物，因此可以用于研究细胞免疫应答、肿瘤免
疫学、感染病毒的免疫学等领域。
此外，ELISPOT还可以用于药物筛
选和疫苗研究，帮助科学家们开发更有效的药物和疫苗。
ELISPOT的缺点是需要较长的实验时间和较高的成本，同时需要专业
的实验技能和设备。
此外，ELISPOT只能检测单个细胞的分泌物，无
法检测细胞表面分子的表达情况。
总之，ELISPOT是一种重要的免疫学检测技术，具有广泛的应用前景。
随着技术的不断发展，ELISPOT将会在疾病诊断、药物筛选、疫苗研
究等领域发挥越来越重要的作用。
酶联免疫斑点法的操作方法
酶联免疫斑点法的操作方法酶联免疫斑点法是一种广泛应用于免疫学和生物化学领域的分析技术，用于检测和定量分析抗原-抗体相互作用。
下面将详细介绍酶联免疫斑点法的操作方法。
一、实验材料与试剂准备1. 试剂- 抗原：根据实验需要准备相应的抗原。
- 抗体：根据实验需要选择合适的抗体，可以是多克隆抗体也可以是单克隆抗体。
- 酶标记的二抗：选择适当的酶标记二抗，如HRP、碱性磷酸酶等。
- 底物：根据所选择的酶标记物选择相应的底物。
- 缓冲液：根据实验需要选择相应的缓冲液，如PBS、TBST等。
- 洗涤液：常用的洗涤液为PBS或TBST。
- 显色底物：根据所选择的酶标记物选择相应的显色底物，如TMB、BCIP/NBT 等。
2. 实验仪器- 酶标仪：用于测定底物酶解的吸光度或荧光值。
- 扫描仪：用于获得斑点形成的图像。
二、实验步骤1. 制备实验板- 选择合适的固相载体，如微孔板、膜、条或片等。
- 洗涤载体：根据选择的载体类型使用洗涤液充分洗涤载体，通常为3-4次洗涤。
- 固定抗原：将抗原溶液加入载体孔中，进行固定，通常需要孵育一段时间，如1-2小时。
- 停止固定反应：洗涤载体，用洗涤液洗涤3-4次。
2. 孔位的处理- 阻断孔位：加入阻断液阻断非特异性吸附，如BSA、Bovine serum albumin 等。
- 洗涤液洗涤孔位：用洗涤液洗涤3-4次。
3. 添加抗体和酶标记二抗- 加入抗体：添加适当稀释的抗体溶液到孔位中，孵育一段适当的时间，如1-2小时。
- 洗涤液洗涤孔位：用洗涤液洗涤孔位，洗涤3-4次。
- 加入酶标记二抗：添加适当稀释的酶标记二抗溶液到孔位中，孵育适当的时间，如1-2小时。
- 洗涤液洗涤孔位：用洗涤液洗涤孔位3-4次。
4. 显色和停止反应- 加入显色底物：加入适当的显色底物，添加适当的底物溶液，使酶解产生可见的色斑或显色反应。
- 停止反应：根据所使用的显色底物的不同，选择适当的反应停止液。
5. 结果读取与分析- 读取结果：将实验板放入酶标仪测定吸光度或荧光值，记录下各孔位的数值。
酶联免疫斑点试验流程图
酶联免疫斑点试验流程图英文回答：Enzyme-Linked Immunospot (ELISPOT) Assay Workflow. Materials:ELISPOT plate.Capture antibody.Cell suspension.Antigen or stimuli.Detection antibody.Substrate (e.g., chromogen or enzyme substrate)。
Procedure:1. Plate Coating: Capture antibody is coated onto the ELISPOT plate overnight at 4°C.2. Cell Addition: Cell suspension is added to the coated plate and incubated to allow cells to adhere (e.g., 4-18 hours at 37°C).3. Antigen Stimulation: Antigen or stimuli is added to the wells to activate antigen-specific cells.4. Cell Incubation: Cells are incubated with antigen or stimuli for a specific time (e.g., 16-24 hours) a t 37°C.5. Cell Removal: Cells are washed away, leaving behind spots corresponding to secreted cytokines or other molecules.6. Detection Antibody Addition: Detection antibody specific for the target cytokine or molecule is added and incubated to bind to the spots.7. Substrate Addition: Substrate is added to visualize the bound detection antibody, generating colored spots.8. Spot Counting: Spots are counted using an automated or manual method.Interpretation:The number of spots represents the number of cells that have secreted the target cytokine or molecule in response to the antigen or stimuli. This information can be used to assess cell-mediated immune responses, cytokine production, and immune cell activation.中文回答：酶联免疫斑点试验流程图。
斑点免疫层析试验报告
斑点免疫层析试验报告
一、实验目的
通过斑点免疫层析试验检测特定抗体的存在，判断样本中是否含有目标抗体。
二、实验原理
斑点免疫层析试验利用抗原与抗体的特异性结合性质，检测样本中是否存在与特定抗原结合的抗体。
在试验过程中，将包含目标抗原的蛋白质在膜上固定，待其干燥后滴加待检测样本，目标抗体与蛋白质结合，再加入掺杂有染色剂的检测抗体，与样本中的抗体结合后呈色，通过颜色变化来判断样本中是否含有目标抗体。
三、实验步骤
1.将含有目标抗原的蛋白质涂在膜上，在室温下静置1小时。
2.将膜表面上的蛋白质冲洗干净，并加入待检测样本。
3.样本和蛋白质在室温下结合30分钟。
4.将掺杂染色剂的检测抗体加入，与样本中含有目标抗体的检测位点结合。
5.再次冲洗样品，待染色剂充分浸染30分钟。
6.观察染料颜色的变化。
四、实验结果及分析
将待检测样品加入检测后，测定斑点颜色变化。
颜色变化为深棕色代表样品中含有目标抗体，未检测到颜色变化则代表样品中不含目标抗体。
五、实验结论
根据斑点颜色变化判断出待检测样品中存在/不存在目标抗体。
六、实验注意事项
1.斑点免疫层析试验产生的颜色变化取决于样品中的目标抗体
浓度。
如果样品中目标抗体浓度较低，则可能无法检测到颜色变化。
2.在试验过程中，一定要注意卫生和消毒，避免出现污染。
3.试剂的储存和使用必须遵从说明书的规定。
4.使用试剂前进行试剂准备，检查是否过期或损坏。
5.在试验过程中，必须严格按照实验步骤进行，避免试验失败。
酶联免疫斑点法
酶联免疫斑点法酶联免疫斑点法（Enzyme-linked immunospot assay, ELISPOT）是一种用于检测单个细胞分泌物（包括细胞因子、抗体和其他蛋白质）的方法。
该技术将单个细胞和特异性抗体共同培养于多孔的固体基质上，当特异性抗体捕获了细胞分泌物时，就会形成一个“免疫斑点”，而该斑点会通过化学反应显示出来，从而可进行定量分析。
该技术的优点一是提高了灵敏度和特异性，促进了单个细胞分泌物的检测能力。
二是实验条件较容易控制，能够极大地减少误差。
另外，与其他技术相比，ELISPOT技术具有较高的自动化水平和适应性。
同时，该技术可用于评估和比较不同治疗方案或疫苗的效果、评估细胞免疫反应、疾病诊断和监测、评估药物毒性和进行基础研究。
在实验中，ELISPOT可分为两个阶段。
第一阶段是细胞培养，即将感兴趣的细胞和特定的刺激物共同培养。
第二阶段是免疫斑点检测，即将细胞移到多孔的固体基质上，添加特异性抗体进行反应，以发现并定量斑点。
常用的免疫斑点计数仪可以通过电子显微镜对固定、染色的免疫斑点进行准确计数，从而获得准确的结果。
通过该技术，研究人员可以研究细胞免疫和疫苗的作用机制，及早发现传染病或肿瘤的预警信号，以促进更好的预防和治疗。
此外，酶联免疫斑点法也适用于儿童疫苗接种后对疫情的监测和跟踪，以及老年人免疫力的评估。
需要指出的是，这种技术并不能够直接用于临床检测，仅在研究领域发挥作用。
一些商业实验室已经开始使用该技术进行疫苗测试和特定蛋白质的检测，在检测和诊断方面具有很大的潜力。
总之，酶联免疫斑点法是一种基于细胞分泌物检测的技术手段，在生物医学研究、药物开发以及疾病预防和治疗等方面具有较为重要的应用价值。
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实验目的
1.了解免疫酶斑点技术的基本原理 及方法；
2.了解免疫酶斑点技术的用途。
免疫斑点酶技术的原理
硝酸纤维素膜和醋酸纤维素膜具有很强 的静电吸附力, 在中性条件下即可有效 地吸附蛋白质等生物大分子。
将免疫物质吸附于纤维素膜后，就可利 用纤维素膜作为固相进行抗原抗体反应。
7. 将膜片放入底物液中, 震荡15分钟左右观察。 明显棕色斑点者为阳性
实验结果
免疫斑点试验的影响因素
1. 包被NC膜的抗原浓度对试验结果影响较大。 多以蛋白质含量500～1000μg／ml为宜。浓度 过高可出现假阳性，过低则降低试验的敏感性。
2. 酶结合物浓度对试验成功与否至关重要。最 适浓度常与包被抗原浓度有关，应根据试验具 体条件作方阵滴定来确定。
方法(直接法)
1. 取硝酸纤维素膜片, 用笔做好标记方便加样; 2. 将稀释的抗原液2μl加于相应格内,室温自然干 燥! 3. 将膜片放入封闭液中震荡封闭15分钟;
4. 用洗涤液震荡洗3次, 每次1分钟, 吸干;
5. 将膜片放入稀释好的酶标抗体液体中，震荡 15分钟, 吸干;
钟, 吸干;
免疫酶斑点技术的特点
1. Ag-Ab反应—高特异性 2. 酶催化作用的高效性—高敏感性 3. NC膜的运用—微量抗原的检测
实验方法及注意事项
1. 分组为单位 (两桌为一组)
2. 膜片、抗原、洗涤液、吸水纸在实验台
上 3.
酶标抗体放置在冰箱，使用前取出
4. 底物临用前配置
5. 震荡器全班一台, 调整好频率后不要乱动
3. 显色时间，一般认为5-10分钟较好。显 色时间过长常导致本底着色加深，降低试 验的特异性。
4. 用抗原包被NC检测抗体时，待检样品 加样不宜过多。加样过多可使相邻的样品 混淆，一般5～10μl即可。
免疫酶斑点技术的应用
1. 微量抗原的检查; 2. 抗体分泌细胞、细胞因子产生细胞 的筛选; 3. 自身抗体的检查。