斑点金免疫渗滤试验
金免疫技术(斑点免疫层析试验)
金免疫技术（斑点免疫层析试验）一、原理金免疫技术是免疫标记技术之一，金盐被还原成原子金后形成金颗粒悬浮（胶体金），这种金颗粒呈红色，并能与蛋白质等大分子物质结合，因此，可用胶体金作为标记物来检测标本中的抗原或抗体。
典型的测定方法有斑点买免疫渗滤试验和斑点免疫层析试验等。
二、材料1 、HCG金标试纸条2、妊娠尿液正常尿液三、方法（一）胶体金的制备根据不同的还原剂可以制备大小不同的胶体金颗粒。
常用来制备胶体金颗粒的方法如下。
1．枸橼酸三钠还原法（1）10nm胶体金粒的制备：取0.01％HAuCl4水溶液100ml，加入1％枸橼酸三钠水溶液3ml，加热煮沸30min，冷却至4℃，溶液呈红色。
（2）15nm胶体金颗粒的制备：取0.01％HAuCl4水溶液100ml，加入1％枸橼酸三钠水溶液2ml，加热煮沸15min～30min，直至颜色变红。
冷却后加入0.1Mol/L K2CO30.5ml，混匀即可。
（3）15nm、18nm～20nm、30nm或50nm胶体金颗粒的制备：取0.01％HA uCl4水溶液100ml，加热煮沸。
根据需要迅速加入1％枸橼酸三钠水溶液4ml、2.5ml、1ml或0.75ml，继续煮沸约5min，出现橙红色。
这样制成的胶体金颗粒则分别为15nm、18～20nm、30nm和50nm。
（二）胶体金标记蛋白的制备胶体金对蛋白的吸附主要取决于pH值，在接近蛋白质的等电点或偏碱的条件下，二者容易形成牢固的结合物。
如果胶体金的pH值低于蛋白质的等电点时，则会聚集而失去结合能力。
除此以外胶体金颗粒的大小、离子强度、蛋白质的分子量等都影响胶体金与蛋白质的结合。
1．待标记蛋白溶液的制备将待标记蛋白预先对0.005Mol/L pH7.0 Na Cl溶液中4℃透析过夜，以除去多余的盐离子，然后100 000g4℃离心1 h，去除聚合物。
2．待标胶体金溶液的准备以0.1Mol/L K2CO3或0.1Mol/L HCl调胶体金液的pH值。
临床免疫学检验 名词解释整理
抗原抗体反应：是指抗原与相应抗体在体内或体外发生的特异性结合反应。
抗原抗体间的结合力涉及静电引力、范德华力、氢键和疏水作用力，其中疏水作用力最强，它是在水溶液中两个疏水基团相互接触，由于对水分子的排斥而趋向聚集的力。
亲和性（affinity）：是指抗体分子上一个抗原结合点与一个相应抗原表位（AD）之间的结合强度，取决于两者空间结构的互补程度。
亲合力（avidity）：是指一个完整抗体分子的抗原结合部位与若干相应抗原表位之间的结合强度，它与亲和性、抗体的结合价、抗原的有效AD数目有关。
抗原抗体反应的特点：特异性、可逆性、比例性、阶段性。
带现象（zone phenomenon）：一种抗原-抗体反应的现象。
在凝集反应或沉淀反应中，由于抗体过剩或抗原过剩，抗原与抗体结合但不能形成大的复合物，从而不出现肉眼可见的反应现象。
抗体过量称为前带，抗原过量称为后带。
免疫原（immunogen）：是指能诱导机体免疫系统产生特异性抗体或致敏淋巴细胞的抗原。
免疫佐剂（immuno adjustvant）：简称佐剂，是指某些预先或与抗原同时注入体内，可增强机体对该抗原的免疫应答或改变免疫应答类型的物质。
半抗原（hapten）：又称不完全抗原，是指仅具有与抗体结合的能力(抗原性)，而单独不能诱导抗体产生（无免疫原性）的物质。
当半抗原与蛋白质载体结合后即可成为完全抗原。
载体（carrier）：结合后能给予半抗原以免疫原性的物质。
载体效应：初次免疫与再次免疫时，只有使半抗原结合在同一载体上，才能使机体产生对半抗原的免疫应答，该现象称为~。
单克隆抗体（McAB）：将单个B细胞分离出来，加以增殖形成一个克隆群落，该B细胞克隆产生的针对单一表位、结构相同、功能均一的抗体，即~。
多克隆抗体（PcAb）：天然抗原分子中常含多种不同抗原特异性的抗原表位，以该抗原物质刺激机体免疫系统，体内多个B细胞克隆被激活，产生含有针对不同抗原表位的免疫球蛋白，即~基因工程抗体（GEAb）：是利用DNA重组及蛋白工程技术，从基因水平对编码抗体的基因进行改造和装配，经导入适当的受体细胞后重新表达的抗体。
斑点免疫金渗滤法检测血清抗结核分枝杆菌抗体
快、 疗效 显著 等特 点 ， 设备 简 单 ， 且 费用 低 ， 得 ｌ 值 临床
推 广应 用 。
参 考 文 献
［］ Ｔ １ ｅＡＥ， ｅｓＲ， ｐａ Ａ． Ｒｉ Ｋａ ｌ Ｓ ＴＶＰｉ ｅ ｄｆ ａｏ ｆ ｎ ｎｗ ｍｏ ｉｃｔｎ ｏ ａ ｉ ＴＵＲＰ
究结果 报道 如下 。 １ 材料 与 方法 １ １ 研 究对 象 肺 结 核 的 患 者组 ７ ． ３例 （ ４ 男 ８例 ，
２ ５例 ， ２ 女 ５例） 。 １ ２ 标本 的 采 集 血 液 采 集 肺 结 核 患 者 早 晨 静 脉 ． 血 标本 ２ ３ｍｌ３ ～ ， ７℃水浴 后立 即分 离血 清 送 检 ； 痰
是 一种 较 为理 想 的 临床 结核 病 辅 助诊 断 方 法 。
【 键 词 】 结核 分 枝 杆 菌 斑 点免 疫金 渗 滤 法 抗体 关
结 核病 是 一 种 常 见 的难 以诊 断 的 疾病 ， 去在 过 诊 断上 主要靠 痰涂 片法 、 痰培 养 、 部 Ｘ线 片 以及临 胸 床 症状 和体 征 进 行 诊 断 。近 年 来 ， 着 结 核 抗 体 检 随 测 技术 的不 断进 步 ， 点 免 疫 金 渗 滤法 （ Ｉ Ａ） 斑 Ｄ ＧＦ 的 开展 为结 核 病 的诊 断 提 供 了新 的 实 验 室 检 测 方法 。 研 究证 实 活 动性 结 核 病 患 者 细胞 免 疫 减 弱 ， 液 免 体 疫亢 进 ， 血液 及 其 他 体 液 中结 核 抗 体 （ 要 是 ＩＧ） 主 ｇ 升高 ， 我们 对 ７ 例 确诊 结核 病 患 者检 测 血清 中的 结 ３ 核抗 体 与 同 步条 件 的 痰 涂 片抗 酸 染 色 比较 ， 现将 研
该 电极 形似经 尿道 电切 的切 割 环 ， 表 面积 大 ， 但 带有
斑点免疫金渗滤法定量测定血清淀粉样蛋白A方法的建立及性能评估
斑点免疫金渗滤法定量测定血清淀粉样蛋白A方法的建立及性能评估陈长强;杨晶;顾志冬;万颖蕾;毛客自;冯晓静;徐建新;樊绮诗【摘要】目的建立斑点免疫金渗滤法(DIGFA)定量测定血清淀粉样蛋白A(SAA)并评估其分析性能.方法选用2株商品化抗SAA单克隆抗体,分别结合于硝酸纤维素膜和胶体金,制备免疫金渗滤试剂板条(SAA-DOT)以定量检测SAA.按照EP文件,评估SAA-DOT的分析性能(检测限、精密度、准确性、线性范围等).结果 SAA-DOT 最低检测限为5 mg/L；10和100 mg/L的批内变异系数(CV)分别为9.07％和10.21％,天间CV分别为11.33％和11.53％；线性范围为5～ 230 mg/L；SAA-DOT的测定结果与商品化乳胶增强速率散射比浊法(LERN)试剂具有良好的相关性(r=0.995,P＜0.05).表观健康者血清SAA浓度中位数为5.7 mg/L,95％可信区间为0～9.6 mg/L.结论基于DIGFA的SAA-DOT简便、快速,能在5 min内完成检测,各项分析性能指标达到国家食品药品监督管理局(SFDA)对体外诊断试剂的要求,可用于临床患者血清标本的检测.【期刊名称】《检验医学》【年(卷),期】2013(028)009【总页数】6页(P835-840)【关键词】斑点免疫金渗滤法;血清淀粉样蛋白A;即时检验;乳胶增强速率散射比浊法【作者】陈长强;杨晶;顾志冬;万颖蕾;毛客自;冯晓静;徐建新;樊绮诗【作者单位】上海交通大学医学院附属瑞金医院检验科,上海200025;上海奥普生物医药有限公司研发中心,上海201201;上海交通大学医学院附属瑞金医院检验科,上海200025;上海交通大学医学院附属瑞金医院检验科,上海200025;上海交通大学医学院附属瑞金医院检验科,上海200025;上海交通大学医学院附属瑞金医院检验科,上海200025;上海奥普生物医药有限公司研发中心,上海201201;上海交通大学医学院附属瑞金医院检验科,上海200025【正文语种】中文【中图分类】R446.61血清淀粉样蛋白A(serum amyloid A，SAA)是一类多基因编码的多态性蛋白家族，为组织淀粉样蛋白A的前体物质，属急性时相反应蛋白［1-2］。
斑点金免疫渗滤试验
斑点金免疫渗滤试验斑点免疫渗滤试验的基本原理是：以硝酸纤维素膜为载体，利用微孔滤膜的可滤过性，使抗原抗体反应和洗涤在一特殊的渗滤装置上以液体渗滤过膜的方式迅速完成。
斑点免疫渗滤试验最初是从斑点ELISA基础上发展起来建立的，应用的结合物是酶标记的，称为斑点酶免疫渗滤试验。
90年代初发展了以胶体金为标记物的斑点免疫渗滤试验（dotymmunogoldfiltrationassay，DIGFA），又名滴金免疫测定法（简称滴金法）。
在滴金法中不需酶对底物的反应，更加简便、快速，在临床检验中应用日渐广泛。
（一）原理以双抗体夹心法为例。
在硝酸纤维素膜的膜片中央滴加纯化的抗体，为膜所吸附。
当滴加在膜上的标本液体渗滤过膜时，标本中含抗原被膜上抗体捕获，其余无关蛋白等没滤出膜片。
其后加入的胶体金标记也在渗滤中与已结合在膜上的抗原相结合。
因胶体金本身呈红色，阳性反应即在膜中央显示红色斑点。
（二）试剂和操作1.渗滤装置渗滤装置是滴金法测定中的主要试剂成分之一，由塑料小盒、吸水垫料和点加了抗原或抗体的硝酸纤维素膜片三部分组成。
塑料小盒可以是多种形状的，盒盖的中央有一直径约0.4～0.8cm的小圆孔，盒内垫放吸水垫料，硝酸纤维素膜片安放在正对盒盖的中央有一直径约0.40.8cm的小圆孔，盒的垫放吸水塑料，硝酸纤维素膜片安放在正对盒的圆孔下，紧密关闭盒盖，使硝酸纤维素膜片贴紧吸水垫料。
如此即制备成一渗滤装置。
塑料小盒的形状最多见的是扁平的长方形小板，加之滴金法的整个反应过程都是在渗滤装置上进行的，因此又常称渗滤装置为滴金法反应板。
2.试剂盒组成滴金法试剂盒的三个基本试剂成分是滴金法反应板、免疫金复合和洗涤液。
为了提供质控保证，用于抗原测定的试剂盒还应包括抗原参照品，相应的检测抗体的试剂盒应有阳性对照品。
3.测定操作以双抗体夹心法为例，具体步骤如下：（1）将反应板平放于实验台上，于小孔内滴加血清标本1～2滴，待完全渗入。
（2）于小孔内滴加免疫金复合物试剂1～2滴，待完全渗入。
斑点免疫金渗滤法在结核病快速诊断和鉴别诊断中的应用价值
斑点免疫金渗滤法在结核病快速诊断和鉴别诊断中的应用价值叶一秀;王巍;夏湘宣;李洪敏;姚昊;刘伟民;欧阳晓辉
【期刊名称】《中国医师进修杂志》
【年(卷),期】2000(023)010
【摘要】@@ 近年来,结核病日益引起人们重视,多种检查结核病的方法已陆续报道[1～3],我们采用斑点免疫金渗滤试验(dot-immunogold filtration
assay,DIGFA)检测了结核组和对照组受检者血清中的特异性结核抗体,现将结果报告如下.
【总页数】1页(P36-36)
【作者】叶一秀;王巍;夏湘宣;李洪敏;姚昊;刘伟民;欧阳晓辉
【作者单位】解放军第三○九医院,北京,100091;解放军第三○九医院,北京,100091;解放军第三○九医院,北京,100091;解放军第三○九医院,北京,100091;解放军第三○九医院,北京,100091;解放军第三○九医院,北京,100091;解放军第三○九医院,北京,100091
【正文语种】中文
【中图分类】R521
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简介： 取代。一些新的测抗体的方法在国内使用 尚不普遍。本文主要介绍点免疫金渗滤法。
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临床意义：
抗原的选择将直接影响检ຫໍສະໝຸດ 的特异性 和敏感性。一般敏感性为92.3%，特异性 为99.4%。可用于弓形虫感染的诊断和流 行病学调查。
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谢谢！
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简介：
染色试验(MBD)是诊断弓形虫病的可 靠和敏感的方法，其在早期感染即出现阳 性，并能维持1年之久，但该试验需用活 的弓形虫，一般的医学检验室不易进行。 补体结合试验阳性反应出现在病程后期并 转阴较快，与染色试验结合使用有参考价 值，皆因操作繁琐而为间接血凝、荧光抗 体和酶免疫吸附测定等法所
5免疫荧光技术(修改后)-2解析
生物素 生物素
亲和素
生物素 生物素
亲和素— 生物素在ELISA中使用：
三.ELISA结果的判定
（一）肉眼判定
与阳性、阴性对照颜色比较：
结果判定
1.若待检孔显色浅于阴性对照则判定为阴性；
2.若待检孔显色深于或等于阳性对照孔则判 定为阳性；
3.若待检孔显色介于阴性对照孔和阳性对照 孔之间则判定为弱阳性。
（二）片子的制作：
1.常做切片、涂片、印片，要求薄、 均匀，并与玻片充分固定。固定后不 能被洗脱。
2.注意保持抗原完整性
3.不同材料固定方法不同（无水已醇、 丙醇、聚甲醛等）
（三）荧光抗体染色法
1.直接法
待测标本固定（Ag？）
洗涤，
AgAb
+ Ab
• 快、直接、干扰因素少
• 用于检测抗原
• 每检测一种抗原需标记相应的荧光抗 体,较麻烦
固相载体 聚苯乙烯
Ag 或 Ab 吸 附 到 固 相 载体上的过程,称为 包被
实验中所需酶标抗体的制备方法 同荧光抗体制备：
纯化后的抗体+酶 透析去除游 离酶 测定酶标抗体工作浓度
试验中有关术语及试剂：
包被(coat)：将Ag或Ab吸附在固相
载体上的过程，又称固相化或吸附。包被后， 不能被洗脱。包被缓冲液：PH9.6 CB
C.显微镜：普通的光学显微镜。
光路程序：
白炽光源 —— 发射紫外光or兰紫 光 —— 激发滤板 ——紫外光
——被检物（荧光染色标本）——紫 外光＋荧光 —— 抑制滤板——荧光 （显微镜下可见）
隔
光 源
热 滤 片
目镜 阻挡滤镜
激 发 滤 载玻片 片
物镜 聚光器
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斑点金免疫渗滤试验
斑点免疫渗滤试验的基本原理是：以硝酸纤维素膜为载体，利用微孔滤膜的可滤过性，使抗原抗体反应和洗涤在一特殊的渗滤装置上以液体渗滤过膜的方式迅速完成。
斑点免疫渗滤试验最初是从斑点ELISA基础上发展起来建立的，应用的结合物是酶标记的，称为斑点酶免疫渗滤试验。
90年代初发展了以胶体金为标记物的斑点免疫渗滤试验（dotymmunogoldfiltrationassay，DIGFA），又名滴金免疫测定法（简称滴金法）。
在滴金法中不需酶对底物的反应，更加简便、快速，在临床检验中应用日渐广泛。
（一）原理
以双抗体夹心法为例。
在硝酸纤维素膜的膜片中央滴加纯化的抗体，为膜所吸附。
当滴加在膜上的标本液体渗滤过膜时，标本中含抗原被膜上抗体捕获，其余无关蛋白等没滤出膜片。
其后加入的胶体金标记也在渗滤中与已结合在膜上的抗原相结合。
因胶体金本身呈红色，阳性反应即在膜中央显示红色斑点。
（二）试剂和操作
1.渗滤装置渗滤装置是滴金法测定中的主要试剂成分之一，由塑料小盒、吸水垫料和点加了抗原或抗体的硝酸纤维素膜片三部分组成。
塑料小盒可以是多种形状的，盒盖的中央有一直径约0.4～0.8cm
的小圆孔，盒内垫放吸水垫料，硝酸纤维素膜片安放在正对盒盖的中央有一直径约0.40.8cm的小圆孔，盒的垫放吸水塑料，硝酸纤维素膜片安放在正对盒的圆孔下，紧密关闭盒盖，使硝酸纤维素膜片贴紧吸水垫料。
如此即制备成一渗滤装置。
塑料小盒的形状最多见的是扁平的长方形小板，加之滴金法的整个反应过程都是在渗滤装置上进行的，因此又常称渗滤装置为滴金法反应板。
2.试剂盒组成滴金法试剂盒的三个基本试剂成分是滴金法反应板、免疫金复合和洗涤液。
为了提供质控保证，用于抗原测定的试剂盒还应包括抗原参照品，相应的检测抗体的试剂盒应有阳性对照品。
3.测定操作以双抗体夹心法为例，具体步骤如下：
（1）将反应板平放于实验台上，于小孔内滴加血清标本1～2滴，待完全渗入。
（2）于小孔内滴加免疫金复合物试剂1～2滴，待完全渗入。
（3）于小孔内滴加洗涤液2～3滴，待完全渗入。
（4）判读结果：在膜中央有清晰的淡红色斑点显示者判为阳性反应；反之，则为阴性反应。
斑点呈色的深浅相应地提示阳性强度。
（三）质量控制
滴金法的质量控制常采用在硝酸纤维素膜上点加质控点的方法。
质控小圆点多位于反应斑点的正下方。
医学|教育网搜集整理双抗体夹心法的质控点最好是相应抗原，若该抗原试剂不易制备或价格昂贵
时，也可用SPA或针对金标抗体的抗抗体来充当。
间接法的质控点采用盐析法粗提的人IgG最为经济、方便。
有将包被斑点由圆点改成短线条式的：质控斑点横向包被成横线条，如“－”；反应斑点纵向包被成竖线条，如“∣”；两者相交成“＋”。
这样，阳性反应结果在膜上显示红色的正号（＋），阴性反应结果则为负号（－），目视判断直观、明了。