胶体金免疫分析技术

胶体金免疫层析
❖ 胶体金（颗粒） ▪ 显色性（紫色）
❖ 抗原-抗体特异性结合 ❖ 层析（毛细管作用）
▪ 结合
▪ 富集 ▪ 分离
POCT Point of care testing 即时检验 床边检验
POCT
金免疫层析试验 即时检验的重要类型之一
重点内容
❖ 胶体金与免疫金 ❖ 胶体金免疫渗滤试验 ❖ 胶体金免疫层析试验 ❖ 技术评价与临床应用
重点内容
❖ 胶体金与免疫金
❖ 胶体金免疫渗滤试验 ❖ 胶体金免疫层析试验 ❖ 技术评价与临床应用
胶体金与免疫金
❖ 胶体金 ▪ colloidal gold or gold solution ▪ 胶体溶液
❖ 免疫金 ▪ 金标记抗原（抗体）
胶体金（ colloidal gold ）
❖ 氯金酸(HAuCl4)在还原剂（柠檬酸钠）作 用下，可聚合成一定大小的金颗粒，并形 成带负电的疏水胶溶液。此颗粒由于静电 作用而成为稳定的胶体状态，故称胶体金
重点内容
❖ 胶体金与免疫金 ❖ 胶体金免疫渗滤试验
❖ 胶体金免疫层析试验
❖ 技术评价与临床应用
金免疫层析试验
❖ 斑点金免疫层析试验 ▪ dot immunogold chromatographic assay,DICA
❖ 金免疫层析试验 ▪ immunogold chromatographic assay, ICA
实例：HIV-1+2 抗体
重点内容
❖ 胶体金与免疫金 ❖ 胶体金免疫渗滤试验 ❖ 胶体金免疫层析试验
❖ 技术评价与临床应用
金免疫层析方法学建立
❖ 原材料 ▪ 胶体金 ▪ NC膜 ▪ PVC ▪ 吸水材料
金免疫层析方法学建立
❖ 原材料（hCG检测试剂为例) ▪ 抗原和抗体 • 抗HCG（β链）单克隆抗体 • 抗HCG（α链）单克隆抗体 • 羊抗鼠多克隆抗体
金免疫层析方法学建立
❖ 标记胶体金与制备金垫 ▪ 抗HCG（α链）- Au
❖ 喷膜（NC膜） ▪ 检测区-抗HCG（β链） ▪ 质控区-羊抗鼠Ig
❖ 组装
相关设备
❖ 喷膜与切割
重点内容
❖ 胶体金与免疫金 ❖ 胶体金免疫渗滤试验 ❖ 胶体金免疫层析试验
❖ 技术评价与临床应用
技术评价
❖ 优点 ▪ 快速 ▪ 简便 ▪ 灵活 ▪？
金免疫层析试验
❖ 固定位置预先放置反应试剂 ❖ 在层析过程中实现：
▪ 特异性结合 ▪ 免疫复合物富集 ▪ 游离标记物分离
检测板（条）结构
❖ 样品区 ❖ 金标记抗体区 ❖ NC膜
▪ 检测线（区） ▪ 质控线（区） ❖ 吸水区
分析模式-双抗体夹心
图：分析原理示意图
实例：hCG
❖ 金标记抗体区 ▪ 鼠抗人hCG（α链）
❖ 分析模式 ▪ 夹心法 ▪ 间接法
双抗体夹心分析模式（原理）
A
B
双抗体夹心分析模式（结果）
InstantChek HIV 1+2的结果判断 (图 像)
阳性
阴性
测定无效
实例:HIV-1+2 抗体检测
❖ NC膜 ▪ 质控区（重组抗原）
▪ 测试区（兔抗鼠IgG）
❖ 金标记抗体 ❖ 缓冲液
实例:HIV-1+2 抗体检测
胶体金的结构模式图
H+

H+
H+ AuCl2-
H+ AuCl2- Au AuCl2- H+
H+
AuCl2-
H+
H+
胶体金的特性
❖胶体性质 ▪ 单一金颗粒均匀分散于溶液中
❖呈色性 ▪ 随颗粒大小不同，呈现不同色泽
❖光吸收性 ▪ 最大吸收波长与颗粒大小相关
如何制备胶体金
煮沸氯金酸 滴加柠檬酸钠 灰色→黑色→红色 冷却回复体积
❖ 缺点 ▪ 定量 ▪ 分析敏感度 ▪ 精密度
附1：斑点酶免疫印记
附2：斑点酶免疫印记
❖ NC膜 ▪ 检测线（区） • 鼠抗人hCG（β链） ▪ 质控线（区）兔抗鼠IgG
尿hCG测定-双抗体夹心
尿hCG测定-双抗体夹心
分析模式-竞争
实例：吗啡
❖ 金标记抗体区 ▪ (金标记抗吗啡抗体，兔型）
❖ NC膜 ▪ 检测线（区） • 特异性抗原 ▪ 质控线（区） • 羊抗兔IgG
分析模式-双抗原夹心
高质量胶体金 金颗粒大小 金颗粒均一性
免疫金—金标记抗体（抗原）
❖ 标记方法 ▪ 物理吸附（电荷）
❖ 核心环节 ▪ 抗体量 ▪ 酸碱度
金标记抗体
❖ 赖氨酸 ❖ 色氨酸 ❖ 半胱氨酸
金标记抗体
❖ 胶体金-IgG
金标记抗体
❖ 纯化 ▪ 高速离心
❖ 储存 ▪ 中性磷酸盐缓冲液或Tris缓冲液
重点内容
❖ 胶体金与免疫金
❖ 胶体金免疫渗滤试验
❖ 胶体金免疫层析试验 ❖ 技术评价与临床应用
金免疫渗滤试验
❖ 斑点金免疫渗滤 ▪ dot immunogold filtration assay, DIGFA ▪ 渗滤膜（NC） ▪ 在渗滤过程中 • 结合并富集，分离游离标记物
结构示意图
结构示意图
金免疫渗滤试验
胶体金免疫分析技术
李会强 天津医科大学
引言
❖ 胶体金电镜技术
❖ 胶体金免疫分析 ▪ 胶体金免疫渗滤试验 ▪ 胶体金免疫层析试验
胶体金免疫分析技术
❖以胶体金（colloidal gold）作为示踪物质， 以硝酸纤维膜（NC）作为固相载体，通过 渗滤作用或层析作用，利用抗原-抗体特异 性反应的原理，实现对待测抗原（或抗体） 的快速检测技术。 ▪ colloidal gold immunoassay