食品检验工大肠菌群教案
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2014实验六 食品中大肠菌群的检验
项目：菌落总数 、大肠菌群、耐热大肠菌 群、总大肠菌群
一、实验目的
1. 了解大肠菌群在食品检验中的意义。 2. 掌握检验的程序和步骤。 3. 通过MPN检索表的检索得出实验结果。
二、基本原理
大肠菌群系指一群在32～37℃下24h内，能 发酵乳糖产酸、产气、需氧或兼性厌氧的革 兰氏阴性无芽孢杆菌。该菌群主要来源于人 畜粪便，故以此作为粪便污染指标，来评价 食品卫生质量状况，推断食品中肠道致病菌 污染的可能。具有广泛的卫生学意义。
（2）BGLB：煌绿乳糖胆盐肉汤
成分：蛋白胨10.0g，乳糖10.0g，牛胆粉溶液 200mL，0.1%煌绿水溶液13.3mL，蒸馏水 800mL，pH7.2±0.1。
3个三角瓶（含玻珠）中，225ml/个 9支试管，3支/组，9ml/支
抑菌剂的选择
大肠菌群检验中常用的抑菌剂有胆盐、十二烷基 硫酸钠、洗衣粉、煌绿、龙胆紫、孔雀绿等。
大肠菌群、粪大肠菌群、大肠杆菌的从属关系
大肠菌群并非细菌学分类命名，而是卫生细菌领域的用语， 它不代表某一个或某一属细菌，而指的是具有某些特性的 一组与粪便污染有关的细菌，这些细菌在生化及血清学方 面并非完全一致。一般认为可包括大肠埃希氏菌、柠檬酸
杆菌、产气克雷伯氏菌和阴沟肠杆菌等。
大肠杆菌是人和温血动物肠道 内普遍存在的细菌，是粪便中 的主要菌种产。气一克般雷生白活氏在菌 人大 肠中并不致病，但它侵入人体 一些部位时，可引起感染 。
LST产气（+）
0
将产气的试管内 样品接种到 BGLB肉汤
4）初发酵试验
选择10-2、10-3、10-4三个稀释度的样品均液 （液体样品可以选择原液）， 用无菌移液管分别 吸取1mL到LST发酵液试管中，每管接种1mL， 每 个稀释度做3个平行（共9管）,36℃±1 ℃培养24 h±2 h，观察倒管内是否有气泡产生，24 h±2 h 产气者进行复发酵试验，如未产气则继续培养至 48 h±2 h，产气者进行复发酵试验。未产气者为 大肠菌群阴性。
一、实验目的
1. 了解大肠菌群在食品检验中的意义。 2. 掌握检验的程序和步骤。 3. 通过MPN检索表的检索得出实验结果。
二、基本原理
大肠菌群系指一群在32～37℃下24h内，能 发酵乳糖产酸、产气、需氧或兼性厌氧的革 兰氏阴性无芽孢杆菌。该菌群主要来源于人 畜粪便，故以此作为粪便污染指标，来评价 食品卫生质量状况，推断食品中肠道致病菌 污染的可能。具有广泛的卫生学意义。
（2）BGLB：煌绿乳糖胆盐肉汤
成分：蛋白胨10.0g，乳糖10.0g，牛胆粉溶液 200mL，0.1%煌绿水溶液13.3mL，蒸馏水 800mL，pH7.2±0.1。
3个三角瓶（含玻珠）中，225ml/个 9支试管，3支/组，9ml/支
抑菌剂的选择
大肠菌群检验中常用的抑菌剂有胆盐、十二烷基 硫酸钠、洗衣粉、煌绿、龙胆紫、孔雀绿等。
大肠菌群、粪大肠菌群、大肠杆菌的从属关系
大肠菌群并非细菌学分类命名，而是卫生细菌领域的用语， 它不代表某一个或某一属细菌，而指的是具有某些特性的 一组与粪便污染有关的细菌，这些细菌在生化及血清学方 面并非完全一致。一般认为可包括大肠埃希氏菌、柠檬酸
杆菌、产气克雷伯氏菌和阴沟肠杆菌等。
大肠杆菌是人和温血动物肠道 内普遍存在的细菌，是粪便中 的主要菌种产。气一克般雷生白活氏在菌 人大 肠中并不致病，但它侵入人体 一些部位时，可引起感染 。
LST产气（+）
0
将产气的试管内 样品接种到 BGLB肉汤
4）初发酵试验
选择10-2、10-3、10-4三个稀释度的样品均液 （液体样品可以选择原液）， 用无菌移液管分别 吸取1mL到LST发酵液试管中，每管接种1mL， 每 个稀释度做3个平行（共9管）,36℃±1 ℃培养24 h±2 h，观察倒管内是否有气泡产生，24 h±2 h 产气者进行复发酵试验，如未产气则继续培养至 48 h±2 h，产气者进行复发酵试验。未产气者为 大肠菌群阴性。
食品中大肠菌群检测PPT课件
食品卫生监督中的应用
餐饮业卫生监督
在餐饮业卫生监督中，大肠菌群 检测是重要的检测指标之一，用 于评估餐饮企业的卫生状况和食
品安全水平。
超市食品安全检测
超市食品安全检测中，大肠菌群 检测是必检项目之一，用于检测 食品是否符合国家食品安全标准。
食品进出口检验
在食品进出口检验中，大肠菌群 检测是重要的检测指标之一，用 于评估食品的卫生状况和安全性，
自动化检测技术
利用机器人和自动化设备进行样品处理和数据分析，提高检测效 率。
快速检测技术
开发新型培养基和试剂，缩短检测时间，提高检测速度。
基因检测技术
利用基因测序和生物信息学技术，提高检测准确性和特异性。
提高检测效率和准确性的方法
标准化操作流程
01
制定统一的大肠菌群检测标准，规范操作流程，减少误差。
05
大肠菌群检测的挑战和未来发展
当前面临的挑战
检测方法不统一
目前大肠菌群检测方法多样，缺乏统一的标准， 导致检测结果存在差异。
检测效率低下
传统检测方法过程繁琐，耗时长，无法满足快速、 大批量检测的需求。
检测准确性不高
由于操作复杂和干扰因素多，传统检测方法容易 出现假阳性或假阴性结果。
技术发展与未来趋势
检测步骤
采集样品、增菌培养、分 离培养、生化鉴定和计数。
培养法检测
传统培养法
将样品接种在选择性培养 基上，通过培养后观察菌 落形态、染色和生化反应 等特征进行鉴定。
自动化培养法
利用自动化仪器进行样品 接种、培养和检测，提高 检测效率和准确性。
培养法优缺点
培养法准确度高，但检测 周期较长，需要专业人员 操作。
确保食品的安全进出口。
教学设计：大肠菌群测定(精)
教师姓名20 年月日星期授课班级
项目名称
《食品微生物技术实训项目教程》
项目八微生物检验技术实训任务2 大肠菌群检验
目的与要求1.掌握微生物检验流程
2.熟悉微生物检验的相关国标
3.掌握微生物检验的一般操作技术
课时 2
测定原理
大肠菌群是一群以大肠埃希氏菌为主的需氧及兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌，在37℃生长时，能在48小时内发酵产酸产气。
食品中大肠菌群数是以1mL（g）检样内大肠菌群最近似数（The most probable number，简称MPN）表示。
据此含义，所有食品卫生标准中所规定的大肠菌群均应以1mL（g）食品内允许含有大肠菌群的实际数值为报告标准。
仪器、试剂
生理盐水、月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤、煌绿乳糖胆盐（BGLB）肉汤管、试管、小倒管、三角瓶等。
教学过程及时间安排1.实验内容讲解50min
2.取样及样品处理60min
3.样品稀释及接种培养初发酵（48h）40min
4.阳性计数及复发酵20min
5.查MPN表、讨论评分、实验整理10min
注意事项1.在进行样品稀释时，每做一个稀释度要换一支吸管；
2.接种时要先加入稀释液后再到培养基；
3.注意无菌操作；
4.正确查找MPN表。
结果分析依据国标查MPN值。
课后体会
教案。
实验四--食品中大肠菌群的测定课件
实验四 食品中大肠菌群的测定
一、实验目的
▪ 掌握大肠菌群的原理及其检验方法，以判 别食品的卫生质量
▪ 了解MPN测定法在食品卫生检验中的意义
二、实验原理
▪ 大肠菌群是指一群在一定培养条件下可发酵 乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴 性无芽孢杆菌。
▪ 该菌主要来源自人畜粪便，作为粪便污染指 标评价食品的卫生状况，推断食品中肠道致 病菌污染的可能。
NaCl 8.5g 水 1000mL 分装：
➢ 3个三角瓶（含玻珠）中，225mL/个 ➢ 9支试管，3支/组，9mL/支 灭菌： 121~126℃灭菌20min
2、月桂基硫酸盐蛋白胨肉汤（LST）培养基：300mL
➢ 分装到27个已装有杜氏小管试管中，10mL/个
➢ 包扎（3支一捆），112~115℃灭菌30min
三、实验器材
（一）培养基 月桂基硫酸盐蛋白胨肉汤（LST）培养基 煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB）培养基
（二）实验材料 市售饮料
（三）其他 三角瓶，试管，培养皿，移液管
（四）仪器 超净工作台，电子天平，高压蒸汽灭菌锅
四、实验准备
（一）配制培养基和试剂（以中央台为单位） 1、配制生理盐水：1000mL
7、37℃培养48h 8、观察BGLB小倒管中是否有气泡，如有气泡，
则记为大肠阳性管（+）；如无气泡，则记为 大肠阴性管（-）。
9、根据经确证后的对应浓度阳性管数查MPN表，报 告样品中大肠菌群MPN值。
五、实验结果与分析
▪ 经查MPN表，样品中大肠菌群数为 MPN/g（mL） 分析
六、思考题
胰蛋白胨 6g
NaCl
1.5g
乳糖 KH2PO4
水
1.5g 0.825g
一、实验目的
▪ 掌握大肠菌群的原理及其检验方法，以判 别食品的卫生质量
▪ 了解MPN测定法在食品卫生检验中的意义
二、实验原理
▪ 大肠菌群是指一群在一定培养条件下可发酵 乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴 性无芽孢杆菌。
▪ 该菌主要来源自人畜粪便，作为粪便污染指 标评价食品的卫生状况，推断食品中肠道致 病菌污染的可能。
NaCl 8.5g 水 1000mL 分装：
➢ 3个三角瓶（含玻珠）中，225mL/个 ➢ 9支试管，3支/组，9mL/支 灭菌： 121~126℃灭菌20min
2、月桂基硫酸盐蛋白胨肉汤（LST）培养基：300mL
➢ 分装到27个已装有杜氏小管试管中，10mL/个
➢ 包扎（3支一捆），112~115℃灭菌30min
三、实验器材
（一）培养基 月桂基硫酸盐蛋白胨肉汤（LST）培养基 煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB）培养基
（二）实验材料 市售饮料
（三）其他 三角瓶，试管，培养皿，移液管
（四）仪器 超净工作台，电子天平，高压蒸汽灭菌锅
四、实验准备
（一）配制培养基和试剂（以中央台为单位） 1、配制生理盐水：1000mL
7、37℃培养48h 8、观察BGLB小倒管中是否有气泡，如有气泡，
则记为大肠阳性管（+）；如无气泡，则记为 大肠阴性管（-）。
9、根据经确证后的对应浓度阳性管数查MPN表，报 告样品中大肠菌群MPN值。
五、实验结果与分析
▪ 经查MPN表，样品中大肠菌群数为 MPN/g（mL） 分析
六、思考题
胰蛋白胨 6g
NaCl
1.5g
乳糖 KH2PO4
水
1.5g 0.825g
实验五食品中大肠菌群的测定
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（4） 用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1:10 样品匀液1mL，沿管壁缓缓注入9mL磷酸盐缓冲 液或生理盐水的无菌试管中（注意吸管或吸头 尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1 支1mL无菌吸管反复吹打，使其混合均匀，制成 1:100 的样品匀液。
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1、乳糖发酵试验 根据食品卫生要求或对检样污染程
度的估计，选择三个稀释度，每个稀释 度接种三管乳糖胆盐发酵管。
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接种量在1ml以上者，用双料乳糖胆盐
发酵管，1ml及1ml以下者，用单料乳糖胆盐
发酵管，同时用大肠埃希氏菌和产气肠杆菌
混合菌种混合接种于1支作单料乳糖胆盐发酵
选取菌落数在15-150 之间的平板，分别计数 平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落。典 型菌落为紫红色，菌落周围有红色的胆盐沉 淀环，菌落直径为0.5 mm 或更大。
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2、 平板计数
（4）、 证实试验
从VRBA 平板上挑取10 个不同类型的典型和 可疑菌落，分别移种于BGLB 肉汤管内， 36℃±1℃ 培养24h-48h ，观察产气情况。凡 BGLB 肉汤管产气，即可报告为大肠菌群阳性。
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比较区别 GB/T4789.38 -- 2019大肠杆菌的计数
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03版 流程
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一、 步骤
取样及稀释方法与菌落总数检验方法 相同，做成1:10的均匀稀释液为检样。
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同一稀释度在做菌落总数测定的同时接 种乳糖胆盐发酵管，并且用大肠埃希氏 菌、产气肠杆菌混合菌种作对照 。
2020实验六_食品中大肠菌群的检验课件
LST结果判断
大肠菌群的产气量，多者可以使发酵倒管全部充 满气体，少者可以产生比小米粒还小的气泡。如 果对产酸但未产气的乳糖发酵如有疑问时，可以 用手轻轻打动试管。
5）复发酵试验 用接种环从产气的LST肉汤管中分别取培
养物1环，移种于煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB） 管中，36 ℃±1℃培养48 h±2 h，观察产气 情况。产气者，计为大肠菌群阳性管。
食品中大肠菌群数以每g（mL）样品中大肠菌 群的最可能数来表示，即为大肠菌群MPN值。
需要用到的培养基
（1）LST肉汤培养基：月桂基硫酸盐胰蛋白胨 成分：胰蛋白胨或胰酪胨（Tryticase）20g，NaCL
5.0g，乳糖5.0g，K2HPO4 2.75g，KH2PO4 2.75g，月桂基硫酸钠0.1g，蒸馏水1000mL。 制法：将各成分溶解于蒸馏水中。分装到有倒立发酵 管的20mm×150mm试管中，每管10mL。 121℃高压灭菌15min。最终pH6.8±0.2。
食品中大肠菌群的检验
1. 食品微生物检验的意义
有害微生物对人类和生产的影响：
引起食品变质 引起食物中毒 导致人体患病
1. 食品微生物检验的意义
是衡量食品卫生质量的重要指标,也是判定 被检食品能否食用的科学依据
可以判断食品加工环境及食品卫生的情况, 为卫生管理工作提供科学依据
可以有效地防止或减少食物中毒和人畜共 患病的发生
保证产品的质量,避免不 必要的损失
2. 食品微生物检验的范围
食品加工、储藏、销售 储环节的检验
原辅料的检验
食品的检验
生产环境的检验
3. 食品卫生标准中的微生物指标
指示菌
概念:在常规安全卫生监测中，用以指示检 样卫生状况及安全性的指示性微生物
项目十七 大肠菌群的检验
项目十七 大肠菌群计数
④用1 mL 无菌吸管或微量移液器吸取1:10 样品匀液1 mL， 沿管壁缓缓注入9 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌试 管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试 管或换用1 支1 mL 无菌吸管反复吹打，使其混合均匀， 制成1:100 的样品匀液。 ⑤ 根据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成十 倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释1 次，换用1 支1 mL 无菌吸管或吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕， 全过程不得超过15 min。
项目十七 大肠菌群计数
3.革兰氏染色
（1）所需试剂
结晶紫染色液、革兰氏碘液、沙黄复染液
（2）染色法
革兰氏染色
项目十七 大肠菌群计数
1）用接菌环取一滴灭菌生理盐水于载玻片上，然后再 用灭菌环挑取少量菌种于载玻片上与生理盐水充分混合。 2）将涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染色液，染1min 水洗。 3）滴加革兰氏碘液，作用1min，水洗。
项目十七 大肠菌群计数
2） 初发酵试验
每个样品，选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液 （液体样品可以选择原液），每个稀释度接种3管月桂基 硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤，每管接种1mL（如接种量 超过1 mL，则用双料LST肉汤），36℃±1 ℃培养24 h±2 h，观察倒管内是否有气泡产生，24 h±2 h产气者 进行复发酵试验，如未产气则继续培养至48 h±2 h，产 气者进行复发酵试验。未产气者为大肠菌群阴性。
大肠菌群阴性
报告
乳糖发酵管 36℃±1℃ 48h±2h
革兰氏染色
革兰氏阳性
革兰氏阴性 无芽孢杆菌
产气
不产气
大肠菌群阴性
大肠菌群阴性
大肠菌群阳性
实验二 食品中大肠菌群的检验
②用1mL灭菌吸管吸取1：10稀释液1mL，注入含有9mL灭 菌生理盐水的试管内，混匀，制成1 ：100的稀释液。
③另取1mL灭菌吸管，按②操作依次做10倍递增稀释液，每
稀释一次，换用一支1 mL灭菌吸管。
2）乳糖发酵实验 接种1mL待检样品于乳糖胆盐 发酵管内。接种3个稀释度，每一 稀释度接种3管，置（36土1)℃
汤），36℃±1 ℃培养24 h±2 h，观察倒管内是
否有气泡产生，24 h±2 h产气者进行复发酵试验，
如未产气则继续培养至48 h±2 h，产气者进行复
发酵试验。未产气者为大肠菌群阴性。
LST结果判断
大肠菌群的产气量，多者可以使发酵倒管全部充 满气体，少者可以产生比小米粒还小的气泡。如 果对产酸但未产气的乳糖发酵如有疑问时，可以 用手轻轻打动试管。
阳性管 10ml 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1ml 0 0 0 1 1 1 1 2 2 2 2 3 3 3 3 0 0 0 0 1 1 1 1 0.1ml 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 3 6 9 3 6 9 12 6 9 12 16 9 13 16 19 4 7 11 15 7 11 15 19 MPN 10ml 1 1 1 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 阳性管 1ml 2 2 2 2 3 3 3 3 0 0 0 0 1 1 1 1 2 2 2 2 3 3 3 0.1ml 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 11 15 20 24 16 20 24 29 9 14 20 26 15 20 27 34 21 28 35 42 29 36 44 MPN 10ml 2 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 阳性管 1ml 3 0 0 0 0 1 1 1 1 2 2 2 2 3 3 3 3 0.1ml 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 53 23 39 64 95 43 75 120 160 93 150 210 290 240 460 1100 1100+ MPN
③另取1mL灭菌吸管，按②操作依次做10倍递增稀释液，每
稀释一次，换用一支1 mL灭菌吸管。
2）乳糖发酵实验 接种1mL待检样品于乳糖胆盐 发酵管内。接种3个稀释度，每一 稀释度接种3管，置（36土1)℃
汤），36℃±1 ℃培养24 h±2 h，观察倒管内是
否有气泡产生，24 h±2 h产气者进行复发酵试验，
如未产气则继续培养至48 h±2 h，产气者进行复
发酵试验。未产气者为大肠菌群阴性。
LST结果判断
大肠菌群的产气量，多者可以使发酵倒管全部充 满气体，少者可以产生比小米粒还小的气泡。如 果对产酸但未产气的乳糖发酵如有疑问时，可以 用手轻轻打动试管。
阳性管 10ml 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1ml 0 0 0 1 1 1 1 2 2 2 2 3 3 3 3 0 0 0 0 1 1 1 1 0.1ml 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 3 6 9 3 6 9 12 6 9 12 16 9 13 16 19 4 7 11 15 7 11 15 19 MPN 10ml 1 1 1 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 阳性管 1ml 2 2 2 2 3 3 3 3 0 0 0 0 1 1 1 1 2 2 2 2 3 3 3 0.1ml 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 11 15 20 24 16 20 24 29 9 14 20 26 15 20 27 34 21 28 35 42 29 36 44 MPN 10ml 2 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 阳性管 1ml 3 0 0 0 0 1 1 1 1 2 2 2 2 3 3 3 3 0.1ml 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 53 23 39 64 95 43 75 120 160 93 150 210 290 240 460 1100 1100+ MPN
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三、实训材料及器具(每组)
材料：乳糖胆盐发酵培养基，乳糖发酵培养基，伊红美蓝琼脂培养基,革兰氏染色试剂，液体石蜡，黄酒等
器具：显微镜1台，酒精灯1只，接种环1根，载波片2-3片，大试管23支，短杜氏小管18支，刻度吸管1ml 8支，10ml 1支，25ml 1支，500锥形瓶1个，250锥形瓶1个，培养皿10套，300ml烧杯1个，玻璃棒1支。
用卢戈氏碘液媒染约lmin，水洗。
（6）脱色
用滤纸吸去玻片上的残水，将玻片倾斜，在白色背景下，用滴管连续滴加95%的乙醇通过涂面脱色20～30s，至玻片下端流出的乙醇无色时，立即水洗，将载玻片上的积水甩干。革兰氏染色结果是否正确，乙醇脱色是操作的关键环节。
（7）复染
在涂片上滴加番红液复染约2～3min，水洗，然后用吸水纸吸干。在染色的过程中，不可使染液干涸。
3．分离培养(第二天下午)
将产气管接种伊红美蓝琼脂培养基36±1℃培养18-24小时。然后观察菌落形态，并做革兰氏染色和证实实验。
大肠菌群可疑菌落的特点是：
①．深紫黑色，具有金属光泽的茵落；
②．紫黑色，不带或略带金属光泽的菌落；
③．淡紫黑色，中心色较深的菌落。
4．证实实验：(第四天下午)
在上述平板上，挑取可疑大肠菌落1-2个进行革兰氏染色。镜检为革兰氏阴性无芽孢杆菌时，挑取该菌落片的—部分，接种乳糖复发酵管，置(36±1)℃恒温箱内，培养(24±2)h，观察产气情况。凡乳糖发酵管产酸产气，证实有大肠菌群存在，即可报告为大肠菌群阳性。
（三）仪器包扎：（每组用量）(第一天上午)
培养皿6套，刻度吸管1ml 6支，25ml 1支，灭菌备用。
（四）测定
1．样品稀释处理：(第一天下午)
用25ml灭菌吸管吸取25ml黄酒，加入225ml灭菌生理盐水制成1：10稀释液。再用1ml灭菌吸管取制备好的1：10稀释液1ml，加入9ml灭菌盐水制成1：100稀释液，依次作10倍递增稀释液，每递增稀释一次，换用一支1ml灭菌吸管。
2．乳糖发酵试验：(第一天下午)
根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计，选择三个稀释度(10-1、10-2、10-3)，接种乳糖胆盐发酵管，每个稀释度接种三管。每管接种量1ml（乳糖胆盐发酵管10ml+1ml稀释液）置36±1℃培养24±2小时，如果所有发酵管都不产气，记录大肠菌群阴性，如有产气按下列程序进行。
2.哪些环节会影响革兰色染色结果的正确性？其中最关键的环节是什么？
主要有两点：A、革兰染色G+菌培养12～18h为宜,菌龄太老，因菌体死亡或自溶常使阳性菌呈阴性反应。B、革兰染色要严格控制各试剂的作用时间，尤其是酒精脱色，时间过短，G-可染成紫色造成假阳性；反之，G+也可染成红色造成假阴性。
其中最关键的环节是酒精脱色的时间要控制好
25ml黄酒
各管1ml
35-37℃
培养24±2h
[板书]五、实验结果与分析（报告）(第五天下午)
根据证实为大肠菌群阳性的管数，查MPN检索表，报告每100ml（g）大肠菌群的MPN值。
实验报告记录模板
检品名称：批号：规格：
检验日期：报告日期：
凡乳糖发酵管产气、革兰氏染色为阴性的无芽孢杆菌可报告大肠菌群阳性。
（2）干燥
涂片最好在室温下自然干燥。也可以将涂面朝上在酒精灯上方利用热气烘干,也可用吹风机吹干。
（3）固定
让菌膜面朝上，将载玻片在酒精灯火焰外焰来回通过三次，即为固定。
（4）初染
滴加草酸铵结晶紫(以刚好将菌膜覆盖为宜)于涂面上，染色50s，倾去染色液，细水冲洗至洗出液为无色，将载玻片上的积水甩干。
（5）媒染
一、检验程序
二、检验镜检结果记录及报告
1、乳糖发酵试验
阳性管数
10-1×3
10-2×3
10-3×3
2、革兰氏染色
项目
菌落1
菌落2
菌落3
形状
颜色
结果判断
3、MPN结果报告
检验项目
单位
标准值
实测值
判定
大肠菌群MPN
MPN/100ml
注
意
事
项
1.整个检验过程要注意无菌操作。
2.注意及时记录实验结果和现象。
a)用25ml吸量管吸取25ml黄酒（考试用水样）放到装有225ml的生理盐水的锥瓶中混匀，制成10-1的稀释级；
b)用1ml灭菌吸管吸取10-1稀释液1ml，沿管臂慢慢注入含有9ml的生理盐水的试管里，振摇混匀即得10-2的稀释级，注意每递增稀释一次，必须另换1支1mL灭菌吸管；
c)选择三个稀释度(10-1、10-2、10-3)，接种乳糖胆盐发酵管（考试时是水），每个稀释度接种三管。每管接种量1ml（乳糖胆盐发酵管10ml+1ml稀释液）；
2.革兰染色镜检：
从老师已经培养好的EMB平板培养物中挑取2-3个菌落进行镜检（做2-3张片）
革兰氏染色法：涂片→干燥→固定→结晶紫初染（50s）→水洗→卢戈碘液媒染(1min)→水洗→95%乙醇脱色(20-30s)→水洗→番红复染(2-3min)→水洗→干燥→镜检(油镜观察)。在油镜头下观察到的结果要让考官看并打分。
接种量
管号
发酵反应结果
有无典型菌落
革兰染色结果
复发酵反应结果
阳性管数统计
1
1
2
3
2
1
2
3
3
1
2
3
根据证实实验结果，查MPN表，结果报告<每100ml（g）>大肠菌群最可能数
注：+表示阳性；-表示阴性
[板书]六、检验工考证简解(第一天上午或第四天上午)
1.准备、检测
注：实验前要注意填写好考官给的评分表，接着开始做实验前要先消毒手和桌面，用消毒棉球。（注意考试做到10-2稀释级）
3.结果报告：（用表格来填写）
根据老师提供的已培养好的乳糖胆盐发酵管的情况进行记录，报告。
凡乳糖发酵管产气、革兰氏染色为阴性的无芽孢杆菌可报告大肠菌群阳性。
4.评分标准
考核要素
评分要素
配分
评分标准
取样量
9管3个浓度的选取稀释与样品中和
8分
浓度稀释与中和正确（7-8分）
稀释基本正确（4-6分）
不正确（3分以下）
6分
结果正确、报告清楚（5-6分）
结果不正确（4分以下）
5.注意事项：大家可以看检验标准，要熟悉整个检验程序，记住操作步骤，注意无菌操作的要求，熟悉吸量管的使用，注意每递增稀释一次，必须另换1支1mL灭菌吸管。
6.考核结束后
每个同学要把用过的器具洗干净（平板培养物不能洗），同时在大锥瓶装约225ml自来水放回原位；桌面收拾干净。
2人一组
实验实训中心签字
实训目的
1．了解黄酒中大肠菌群的测定原理。
2．学习并掌握黄酒中大肠菌群的检测方法。
3．巩固微生物接种与分离技术，细菌染色技术。
教学内容与要求
1．培养基的配制及实验材料准备。
2．供试液的制备。
3．发酵管的接种。
4．分离培养。
5．染色试验等
重点难点
1．供试液的稀配。
2．大肠菌群计数方法。
[板书]七、单项技能操作训练(第一天上午或第四天上午)
学生根据的实际情况自由练习显微镜的使用、革兰染色、样品稀释。
考试实验结果记录表
学校（单位）：姓名：准考证号：
食品（黄酒）中大肠菌群测定
检品名称：批号：规格：
检验日期：报告日期：
根据证实为大肠菌群阳性的管数，查MPN检索表，报告每100ml（g）大肠菌群的MPN值。
[板书]四、实训步骤及操作讲解
（一）稀释液配制：（每组用量）(第一天上午)
称取氯化钠2.7克蒸馏水300ml
配制生理盐水300ml，分装到500ml锥形瓶一个，内装量225ml，大试管3支（9ml），加塞包扎，灭菌,备用。
（二）培养基的配制（每2组用量）(第一天上午)
1．制备乳糖胆盐培养基(200ml)：取乳糖胆盐培养基6克，加入蒸馏水200ml搅拌加热煮沸至完全溶解，分装18支大试管，10ml/支，每支并加入一支倒置的杜氏小管，加塞包扎，灭菌备用。
广东食品药品职业学院教学教案
（2012～2013学年第二学期）
课程名称
食品检验员职业资格考证
实训项目
黄酒中大肠菌群测定
检验工考证简解、单项技能训练
课时
16
教学对象
11食品检测
授课日期
2013.05
教材
GB/T 4789.3-2003食品卫生微生物学检验大肠菌群测定
教师姓名
陈琼
教学方法
演示法、练习法
实验形式
仪器
天平、称量纸、药匙、精密pH试纸、量筒、试管、锥瓶、玻璃棒、烧杯、10ml、1ml吸量管、试管架、棉花、线绳、报纸、灭菌锅等、擦镜纸、吸水纸等。
试
剂
乳糖胆盐培养基、乳糖发酵培养基、伊红美兰培养基、1mol/LNaOH溶液、1mol/LHCl溶液、蒸馏水、革兰氏染色试剂、香柏油、二甲苯。
菌种：大肠杆菌斜面培养物
涂片染色流程：挑取可疑菌落涂片→干燥→固定→初染（草酸铵结晶紫、50s）→水洗→媒染（卢戈氏碘液、lmin）→水洗→脱色（95%的乙醇、20～30s）→水洗→复染（番红液2min）→水洗→晾干→镜检。
（1）涂片
取洁净无油的载玻片，将接种环在酒精灯火焰上灼烧灭菌，冷却后,用接种环挑取2～3环直接涂于载玻片上，并涂抹成直径1.5cm左右的菌膜
课后记
3.革兰染色要严格控制各试剂的作用时间，尤其是酒精脱色，时间过短，G-可染成紫色造成假阳性；反之，G+也可染成红色造成假阴性。染色过程勿使染料干凅。水洗时，水流不要直接冲洗涂面，水流不宜过急、过大，以免涂片薄膜脱落，一般以冲洗下来的水基本无色为度。
材料：乳糖胆盐发酵培养基，乳糖发酵培养基，伊红美蓝琼脂培养基,革兰氏染色试剂，液体石蜡，黄酒等
器具：显微镜1台，酒精灯1只，接种环1根，载波片2-3片，大试管23支，短杜氏小管18支，刻度吸管1ml 8支，10ml 1支，25ml 1支，500锥形瓶1个，250锥形瓶1个，培养皿10套，300ml烧杯1个，玻璃棒1支。
用卢戈氏碘液媒染约lmin，水洗。
（6）脱色
用滤纸吸去玻片上的残水，将玻片倾斜，在白色背景下，用滴管连续滴加95%的乙醇通过涂面脱色20～30s，至玻片下端流出的乙醇无色时，立即水洗，将载玻片上的积水甩干。革兰氏染色结果是否正确，乙醇脱色是操作的关键环节。
（7）复染
在涂片上滴加番红液复染约2～3min，水洗，然后用吸水纸吸干。在染色的过程中，不可使染液干涸。
3．分离培养(第二天下午)
将产气管接种伊红美蓝琼脂培养基36±1℃培养18-24小时。然后观察菌落形态，并做革兰氏染色和证实实验。
大肠菌群可疑菌落的特点是：
①．深紫黑色，具有金属光泽的茵落；
②．紫黑色，不带或略带金属光泽的菌落；
③．淡紫黑色，中心色较深的菌落。
4．证实实验：(第四天下午)
在上述平板上，挑取可疑大肠菌落1-2个进行革兰氏染色。镜检为革兰氏阴性无芽孢杆菌时，挑取该菌落片的—部分，接种乳糖复发酵管，置(36±1)℃恒温箱内，培养(24±2)h，观察产气情况。凡乳糖发酵管产酸产气，证实有大肠菌群存在，即可报告为大肠菌群阳性。
（三）仪器包扎：（每组用量）(第一天上午)
培养皿6套，刻度吸管1ml 6支，25ml 1支，灭菌备用。
（四）测定
1．样品稀释处理：(第一天下午)
用25ml灭菌吸管吸取25ml黄酒，加入225ml灭菌生理盐水制成1：10稀释液。再用1ml灭菌吸管取制备好的1：10稀释液1ml，加入9ml灭菌盐水制成1：100稀释液，依次作10倍递增稀释液，每递增稀释一次，换用一支1ml灭菌吸管。
2．乳糖发酵试验：(第一天下午)
根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计，选择三个稀释度(10-1、10-2、10-3)，接种乳糖胆盐发酵管，每个稀释度接种三管。每管接种量1ml（乳糖胆盐发酵管10ml+1ml稀释液）置36±1℃培养24±2小时，如果所有发酵管都不产气，记录大肠菌群阴性，如有产气按下列程序进行。
2.哪些环节会影响革兰色染色结果的正确性？其中最关键的环节是什么？
主要有两点：A、革兰染色G+菌培养12～18h为宜,菌龄太老，因菌体死亡或自溶常使阳性菌呈阴性反应。B、革兰染色要严格控制各试剂的作用时间，尤其是酒精脱色，时间过短，G-可染成紫色造成假阳性；反之，G+也可染成红色造成假阴性。
其中最关键的环节是酒精脱色的时间要控制好
25ml黄酒
各管1ml
35-37℃
培养24±2h
[板书]五、实验结果与分析（报告）(第五天下午)
根据证实为大肠菌群阳性的管数，查MPN检索表，报告每100ml（g）大肠菌群的MPN值。
实验报告记录模板
检品名称：批号：规格：
检验日期：报告日期：
凡乳糖发酵管产气、革兰氏染色为阴性的无芽孢杆菌可报告大肠菌群阳性。
（2）干燥
涂片最好在室温下自然干燥。也可以将涂面朝上在酒精灯上方利用热气烘干,也可用吹风机吹干。
（3）固定
让菌膜面朝上，将载玻片在酒精灯火焰外焰来回通过三次，即为固定。
（4）初染
滴加草酸铵结晶紫(以刚好将菌膜覆盖为宜)于涂面上，染色50s，倾去染色液，细水冲洗至洗出液为无色，将载玻片上的积水甩干。
（5）媒染
一、检验程序
二、检验镜检结果记录及报告
1、乳糖发酵试验
阳性管数
10-1×3
10-2×3
10-3×3
2、革兰氏染色
项目
菌落1
菌落2
菌落3
形状
颜色
结果判断
3、MPN结果报告
检验项目
单位
标准值
实测值
判定
大肠菌群MPN
MPN/100ml
注
意
事
项
1.整个检验过程要注意无菌操作。
2.注意及时记录实验结果和现象。
a)用25ml吸量管吸取25ml黄酒（考试用水样）放到装有225ml的生理盐水的锥瓶中混匀，制成10-1的稀释级；
b)用1ml灭菌吸管吸取10-1稀释液1ml，沿管臂慢慢注入含有9ml的生理盐水的试管里，振摇混匀即得10-2的稀释级，注意每递增稀释一次，必须另换1支1mL灭菌吸管；
c)选择三个稀释度(10-1、10-2、10-3)，接种乳糖胆盐发酵管（考试时是水），每个稀释度接种三管。每管接种量1ml（乳糖胆盐发酵管10ml+1ml稀释液）；
2.革兰染色镜检：
从老师已经培养好的EMB平板培养物中挑取2-3个菌落进行镜检（做2-3张片）
革兰氏染色法：涂片→干燥→固定→结晶紫初染（50s）→水洗→卢戈碘液媒染(1min)→水洗→95%乙醇脱色(20-30s)→水洗→番红复染(2-3min)→水洗→干燥→镜检(油镜观察)。在油镜头下观察到的结果要让考官看并打分。
接种量
管号
发酵反应结果
有无典型菌落
革兰染色结果
复发酵反应结果
阳性管数统计
1
1
2
3
2
1
2
3
3
1
2
3
根据证实实验结果，查MPN表，结果报告<每100ml（g）>大肠菌群最可能数
注：+表示阳性；-表示阴性
[板书]六、检验工考证简解(第一天上午或第四天上午)
1.准备、检测
注：实验前要注意填写好考官给的评分表，接着开始做实验前要先消毒手和桌面，用消毒棉球。（注意考试做到10-2稀释级）
3.结果报告：（用表格来填写）
根据老师提供的已培养好的乳糖胆盐发酵管的情况进行记录，报告。
凡乳糖发酵管产气、革兰氏染色为阴性的无芽孢杆菌可报告大肠菌群阳性。
4.评分标准
考核要素
评分要素
配分
评分标准
取样量
9管3个浓度的选取稀释与样品中和
8分
浓度稀释与中和正确（7-8分）
稀释基本正确（4-6分）
不正确（3分以下）
6分
结果正确、报告清楚（5-6分）
结果不正确（4分以下）
5.注意事项：大家可以看检验标准，要熟悉整个检验程序，记住操作步骤，注意无菌操作的要求，熟悉吸量管的使用，注意每递增稀释一次，必须另换1支1mL灭菌吸管。
6.考核结束后
每个同学要把用过的器具洗干净（平板培养物不能洗），同时在大锥瓶装约225ml自来水放回原位；桌面收拾干净。
2人一组
实验实训中心签字
实训目的
1．了解黄酒中大肠菌群的测定原理。
2．学习并掌握黄酒中大肠菌群的检测方法。
3．巩固微生物接种与分离技术，细菌染色技术。
教学内容与要求
1．培养基的配制及实验材料准备。
2．供试液的制备。
3．发酵管的接种。
4．分离培养。
5．染色试验等
重点难点
1．供试液的稀配。
2．大肠菌群计数方法。
[板书]七、单项技能操作训练(第一天上午或第四天上午)
学生根据的实际情况自由练习显微镜的使用、革兰染色、样品稀释。
考试实验结果记录表
学校（单位）：姓名：准考证号：
食品（黄酒）中大肠菌群测定
检品名称：批号：规格：
检验日期：报告日期：
根据证实为大肠菌群阳性的管数，查MPN检索表，报告每100ml（g）大肠菌群的MPN值。
[板书]四、实训步骤及操作讲解
（一）稀释液配制：（每组用量）(第一天上午)
称取氯化钠2.7克蒸馏水300ml
配制生理盐水300ml，分装到500ml锥形瓶一个，内装量225ml，大试管3支（9ml），加塞包扎，灭菌,备用。
（二）培养基的配制（每2组用量）(第一天上午)
1．制备乳糖胆盐培养基(200ml)：取乳糖胆盐培养基6克，加入蒸馏水200ml搅拌加热煮沸至完全溶解，分装18支大试管，10ml/支，每支并加入一支倒置的杜氏小管，加塞包扎，灭菌备用。
广东食品药品职业学院教学教案
（2012～2013学年第二学期）
课程名称
食品检验员职业资格考证
实训项目
黄酒中大肠菌群测定
检验工考证简解、单项技能训练
课时
16
教学对象
11食品检测
授课日期
2013.05
教材
GB/T 4789.3-2003食品卫生微生物学检验大肠菌群测定
教师姓名
陈琼
教学方法
演示法、练习法
实验形式
仪器
天平、称量纸、药匙、精密pH试纸、量筒、试管、锥瓶、玻璃棒、烧杯、10ml、1ml吸量管、试管架、棉花、线绳、报纸、灭菌锅等、擦镜纸、吸水纸等。
试
剂
乳糖胆盐培养基、乳糖发酵培养基、伊红美兰培养基、1mol/LNaOH溶液、1mol/LHCl溶液、蒸馏水、革兰氏染色试剂、香柏油、二甲苯。
菌种：大肠杆菌斜面培养物
涂片染色流程：挑取可疑菌落涂片→干燥→固定→初染（草酸铵结晶紫、50s）→水洗→媒染（卢戈氏碘液、lmin）→水洗→脱色（95%的乙醇、20～30s）→水洗→复染（番红液2min）→水洗→晾干→镜检。
（1）涂片
取洁净无油的载玻片，将接种环在酒精灯火焰上灼烧灭菌，冷却后,用接种环挑取2～3环直接涂于载玻片上，并涂抹成直径1.5cm左右的菌膜
课后记
3.革兰染色要严格控制各试剂的作用时间，尤其是酒精脱色，时间过短，G-可染成紫色造成假阳性；反之，G+也可染成红色造成假阴性。染色过程勿使染料干凅。水洗时，水流不要直接冲洗涂面，水流不宜过急、过大，以免涂片薄膜脱落，一般以冲洗下来的水基本无色为度。