水质 叶绿素a 的测定 荧光分光光度法
水质叶绿素a的测定分光光度法编制说明
⽔质叶绿素a的测定分光光度法编制说明附件3《⽔质叶绿素a的测定分光光度法》（征求意见稿）编制说明《⽔质叶绿素a的测定分光光度法》标准编制组⼆○⼀五年⼋⽉项⽬名称：⽔质叶绿素a的测定分光光度法项⽬统⼀编号：939承担单位：辽宁省环境监测实验中⼼编制组主要成员：王秋丽、赵丽娟、王琳、丁振军、刘畅、徐天赐、姜永伟、秦⾬、郭杨、朱⼴钦、叶明、贺业菊标准所技术管理负责⼈：周⽻化、雷晶、张虞标准处项⽬负责⼈：张朔⽬录1项⽬背景 (1)1.1任务来源 (1)1.2⼯作过程 (1)2标准制订的必要性分析 (3)2.1叶绿素A的环境危害 (3)2.2相关环保标准和环保⼯作的需要 (4)3国内外相关分析⽅法研究 (5)3.1主要国家、地区及国际组织相关分析⽅法研究 (5)3.2国内相关分析⽅法研究 (8)4标准制订的基本原则和技术路线 (10)4.1标准制订的基本原则 (10)4.2标准制订的技术路线 (10)5⽅法研究报告 (12)5.1⽅法研究的⽬标 (12)5.2⽅法原理 (13)5.3试剂和材料 (13)5.4仪器和设备 (16)5.5样品的采集和保存 (17)5.6分析步骤 (21)5.7结果计算 (31)5.8质量保证和质量控制 (34)5.9注意事项 (34)6⽅法验证 (35)6.1⽅法验证⽅案 (35)6.2⽅法验证过程 (36)7与开题报告的差异说明 (38)8本标准实施的建议 (39)9参考⽂献 (39)《⽔质叶绿素a的测定分光光度法》编制说明1项⽬背景1.1任务来源（1）2006年6⽉，根据《关于下达2006年度国家环境保护标准制订项⽬计划的通知》（环办函[2006]371号），原国家环保总局办公厅下达了制订《⽔质叶绿素a的测定分光光度法》国家环保标准制修订计划，项⽬统⼀编号为：939。
（2）《⽔质叶绿素a的测定分光光度法》项⽬承担单位为：辽宁省环境监测实验中⼼。
1.2 ⼯作过程1.2.1 前期调研⼯作（1）成⽴标准编制组2006年7⽉，辽宁省环境监测中⼼承接了《⽔质叶绿素a的测定分光光度法》制修订任务以后，成⽴了标准编制组。
叶绿素-a测定
叶绿素-a的测定方法原理（荧光分光光度法）用丙酮溶液提取浮游植物色素进行荧光测定，根据提取液酸化前后的荧光值，可分别计算叶绿素-a及脱镁色素的含量。
试剂及其配置1、丙酮溶液（9+1）：量取900ml丙酮与100ml水混合，保存在棕色试剂瓶中。
2、碳酸镁悬浮液（10g/L）:称取1g碳酸镁，加水至100ml，搅匀，盛试剂瓶中待用，用时需要再摇匀。
3、盐酸：=1.18g/ml4、盐酸溶液（5+95）：在搅拌下，将5ml盐酸缓慢的加到95ml水中，混匀，保存于滴定瓶中。
5、硅胶仪器及设备1、荧光计2、冰箱3、离心机4、电动吸引器5、过滤装置6、玻璃纤维滤膜：直径为25mm的WhatmanGF/C或孔径为0.45um的纤维素脂微孔滤膜7、具塞离心管：容量10ml8、干燥器9、棕色试剂瓶：容量100ml，1000ml10、量筒：容量100ml、200ml、1000ml11、定量加液器：容量10ml12、镊子一般实验室常用设备分析步骤1、样品制备量取一定体积海水（通常大洋水250ml-500ml，近岸或港湾水50-100ml），加2ml 碳酸镁悬浮液，混匀，用玻璃纤维滤膜或孔径为0.45um的纤维素脂微孔滤膜过滤，过滤负压不得2超过50KPa.2、样品提取将过滤了的样品的滤膜放入具塞离心管，加入10ml丙酮溶液，摇荡，放置冰箱冷藏室14-24h，提取叶绿素-a。
若虑得的样品不能及时提取，应该将滤膜抽干、对折，再套上一张滤纸置于含硅胶的干燥器内，贮存在低于1摄氏度的冰箱中。
3、样品离心离心速度：（3000-4000）r/min离心时间:10min4、样品测定荧光计激发波长为436nm,发射波长670nm零点调节：用丙酮溶液调节，使荧光计指针指零。
将提取的上层提取液注入测定池。
选择相应量程，测定样品的荧光值R b。
加2滴盐酸溶液至测定池，摇匀，经30s后再测其荧光值Ra。
5、仪器校正用标准叶绿素-a校正。
用分光光度计校正：取一定体积正处于指数增长期的单细胞藻类培养液，依上述方法提取其叶绿素-a，用分光光度法测定，计算该提取液的叶绿素-a浓度。
水中叶绿素a检测方法-丙酮萃取／萤光分析法
水中葉綠素a 檢測方法－丙酮萃取／螢光分析法NIEA E509.01C一、方法概要水樣經玻璃纖維濾紙過濾後，濾紙以組織研磨器於90%丙酮溶液中研磨萃取葉綠素a，萃取液再以藍光光源的螢光儀測得螢光值，最後依製備之螢光值檢量線求得葉綠素a 濃度。
因使用之標準溶液葉綠素a 濃度，會受各種因子影響而衰減，每批次檢測時應以分光光度計再確認標準溶液之濃度。
二、適用範圍本方法適用於地面水體、飲用水水源水質及海域地面水體之檢測。
單一檢驗室之方法偵測極限估值為0.11 μg/L。
三、干擾(一) 萃取後的萃取液與標準溶液易受溫度、光、酸及濁度所影響，應避免強光照射或接觸酸性物質。
萃取液及標準溶液上機測試時，均須回溫至室溫。
(二) 萃取物如產生紅色光區的螢光，會干擾葉綠素a 的量測。
(三) 樣品中，其他種類葉綠素或胡蘿蔔素濃度過高會有螢光熄滅效應，可將萃取液稀釋以克服之。
四、設備及材料(一) 量筒：100、500 mL或1 L之量筒。
(二) 玻璃纖維濾紙：直徑47 mm或25 mm，平均孔徑約0.7 μm（使用Whatman GF/F或同等級產品）。
(三) 過濾裝置：薄膜過濾裝置。
(四) 真空抽氣裝置：水壓式、吸氣式或手動式，壓力差低於0.2kg/cm2（20 kPa）者。
(五) 鑷子。
(六) 鋁箔紙。
(七) 濾紙存放容器：能遮光，在運送過程及儲存時，可以存放含過濾樣本之濾紙，不受環境污染者。
(八) 運送儲存器：運送過程在4小時以內可使用如旅行冰桶，內放冰塊可維持在0～4℃；若超過4小時，需存放在低於20℃的儲存器內，如液態氮桶、乾冰桶或冰箱之冷凍櫃。
(九) 冷凍櫃：可長期維持在20℃以下。
(十) 組織研磨器：具組織研磨效果者。
(十一) 離心管：錐形底、15 mL，具螺紋蓋。
(十二) 離心機：懸臂式、可容納15 mL錐底離心管、離心力可達675 g以上（g為離心力，註1）。
(十三) 定量瓶：10、25、50或100 mL褐色定量瓶。
叶绿素测定方法
叶绿素测定方法一、方法选择1、分光光度计法>荧光光度法>SPAD速测法，浸提比色法>萃取比色法，常温浸提比色测定>高温速浸提比色法，如果时间条件允许，建议选择常温浸提比色法。
2、药品的选择，常用有机浸提叶绿素的试剂由甲醇、乙醇、丙酮，乙醇对身体的伤害最小，丙酮最厉害，如果通风条件不是太好，建议选择乙醇;有机试剂混合液提取具有协同优势，乙醇与丙酮的混合液比甲醇与丙酮的混合液(甲醇乙醇混合很少)浸提的要完全，而且稳定，乙醇、丙酮、水的浸提效果次之，差异不显著;综上，如果能买到丙酮的话，乙醇、丙酮以1:3的比例混合液提取最好，其次是乙醇、丙酮、水以4.5:4.5:1的比例混合液，如果不想用丙酮，可以用95%的乙醇代替，但是与混合液比，提取效率不高。
3、称样量，0.2g样品，选用20ml浸提液浸提，0.5g样品，选用50ml浸提液浸提。
二、实验原理分光光度法测定叶绿素(包括a\b\类胡萝卜素\总量) 含量的原理是，以有机溶剂在常温暗室直接提取样品中的叶绿素，测定其吸光度，根据叶绿素(包括a\b\类胡萝卜素\总量)在特定波长的吸收，用公式计算其含量。
三、器材棕色容量瓶、721型分光光度计(751型分光光度计更好，越精确越好) 四、步骤1、将叶片洗净，选取中间部分，称0.200克左右，并剪成2mm左右碎条2、将样品放入容量瓶中，加入浸提液，定容，放在暗处26h左右3、比色，如果仅仅测定叶绿素A\B总量，测定波长在665nm、649nm、652nm 处吸光度即可，如果还测定类胡萝卜素含量，再测定处波长在470nm处的吸光度即可。
目前，不同的浸提液提取方法都是在这些波长下测定的。
4、每个实验样品重复三次，空白两次重复即可(本实验中空白意义不大)五、计算Ca=13.95*A665-6.88*A649Cb= 24.96* A649-7.32* A665C类胡萝卜素= (1000*A470-2.05* Ca -114.8* Cb)/245C总= A652*50/(34.5*m)Ca 为叶绿素a的浓度M 为称样量。
水质叶绿素a的测定分光光度法
HJ897-2017水质叶绿素a的测定分光光度法Water quality—Determination of chlorophyll a—Spectrophotometric method（发布稿）本电子版为发布稿。
请以中国环境出版社出版的正式标准文本为准。
2017-12-21发布2018-02-01实施环境保护部发布目次前言 (ii)1适用范围 (1)2规范性引用文件 (1)3方法原理 (1)4试剂和材料 (1)5仪器和设备 (2)6样品 (2)7分析步骤 (3)8结果计算与表示 (4)9精密度和准确度 (4)10质量保证和质量控制 (5)11废物处理 (5)i前言为贯彻《中华人民共和国环境保护法》和《中华人民共和国水污染防治法》，保护环境，保障人体健康，规范水中叶绿素a的测定方法，制定本标准。
本标准规定了测定地表水中叶绿素a的分光光度法。
本标准为首次发布。
本标准由环境保护部环境监测司和科技标准司组织制订。
本标准起草单位：辽宁省环境监测实验中心。
本标准验证单位：上海市环境监测中心、大连市环境监测中心、丹东市环境监测中心站、辽阳市环境监测站、朝阳市环境监测中心站和辽宁北方环境检测技术有限公司。
本标准环境保护部2017年12月21日批准。
本标准自2018年2月1日起实施。
本标准由环境保护部解释。
ii水质叶绿素a的测定分光光度法警告：丙酮对人体健康有一定危害，操作时应在通风橱中进行，佩戴防护器具，避免接触皮肤和衣物。
1适用范围本标准规定了测定水中叶绿素a的分光光度法。
本标准适用于地表水中叶绿素a的测定。
本标准测定丙酮提取液中叶绿素a的检出限为0.04mg/L。
当取样体积为200ml，丙酮提取液体积为10ml时，本方法的检出限为2μg/L，测定下限为8μg/L。
2规范性引用文件本标准引用了下列文件或其中的条款。
凡是不注日期的引用文件，其有效版本适用于本标准。
GB/T14581水质湖泊和水库采样技术指导HJ494水质采样技术指导HJ/T91地表水和污水监测技术规范3方法原理将一定量样品用滤膜过滤截留藻类，研磨破碎藻类细胞，用丙酮溶液提取叶绿素，离心分离后分别于750nm、664nm、647nm和630nm波长处测定提取液吸光度，根据公式计算水中叶绿素a的浓度。
叶绿素a的测定原理
叶绿素a的测定原理叶绿素a是一种存在于植物和藻类细胞叶绿体中的绿色色素，它起到了光合作用中接受和传递光能的关键作用。
测定叶绿素a的浓度对于研究光合作用的机制以及评估植物和藻类的生长状态具有重要意义。
在实验室中，存在多种方法来测定叶绿素a的浓度，其中包括光度法、荧光法和高效液相色谱法。
下面将重点介绍常用的光度法测定叶绿素a的原理和步骤。
光度法是一种通过测量溶液对特定波长的光的吸收来确定溶液中某种组分浓度的方法。
对于叶绿素a的测定，通常使用的波长为650nm或663nm。
叶绿素a在这两个波长的光下有很强的吸收能力，而溶液中的其他组分对该波长的光吸收较小。
因此，测定叶绿素a的浓度可以通过测量溶液对650nm或663nm光的吸光度来间接确定。
下面是光度法测定叶绿素a浓度的一般步骤：1. 样品制备：将待测样品中的叶绿素a提取到有机溶剂中，一般使用甲醇、乙醇或二氯甲烷等极性较强的有机溶剂作为提取剂。
提取的方法可以根据需求选择，包括搅拌法、超声波法或研磨法等。
提取过程需要避光，以防叶绿素a被光降解。
2. 溶液制备：将提取出的叶绿素a溶解在适当的溶剂中，一般使用甲醇或乙醇等有机溶剂。
溶液中的叶绿素a浓度可以通过分光光度计测定吸光度来确定。
3. 吸光度测定：使用分光光度计，在650nm或663nm的波长下测量样品吸光度。
为了获得准确的测量结果，一般需要对比测量待测样品和纯溶剂的吸光度，以消除对溶剂的吸光干扰。
4. 计算叶绿素a浓度：根据比色法或校正曲线法，将测得的吸光度转换为叶绿素a的浓度。
比色法是通过比较待测样品吸光度与已知浓度叶绿素a标准溶液吸光度的关系，进行定量测定。
校正曲线法是首先制备不同浓度的叶绿素a标准溶液，然后测定它们的吸光度并绘制出吸光度与浓度的标准曲线，通过待测样品的吸光度在标准曲线上插值得到其浓度。
需要强调的是，在测定叶绿素a浓度时，有几个实验注意事项需要注意。
首先，提取过程需要避光，以免叶绿素a被光降解，影响测量结果。
分光光度法测定叶绿素a方法比较
分光光度法测定叶绿素a方法比较王康1，凌彦群2（1.四川省乐山井研县环境监测站，四川乐山613100；2.四川省乐山市环境监测站，四川乐山616400）摘要：叶绿素a作为评价水体富营养化程度的重要指标之一，探讨其监测分析方法的实用性具有重要的现实意义。
本文通过实验分析比较了叶绿素a测定中的两种样品处理方法——研磨萃取法和反复冻融-浸提法的优缺点；采用分析实验数据统计处理方法评价叶绿素a的测定值。
结果表明：用反复冻融-浸提法处理水样具有安全、高效特性，750nm处吸光度值容易达到0.005；两种分析方法得到的结果无显著性差异；由此两法在室内所获得的分析结果具有可比性。
关键词：分光光度法；叶绿素a；研磨萃取法；反复冻融-浸提法Comparison of the Analysis Methods for Chlorophyll-a bySpectrophotometryWANG Kang1，LING Y anqun2（1.Environmental monitoring station of Jingyan, Leshan, 613100, China；2.Environmental monitoringstation of Leshan, Leshan, 614000, China）Abstract:Chlorophyll-a is one of index in eutrophication for water. Grinding extraction method and repeated freeze-thaw extraction method is the two methods for sample pretreatment in Determination of chlorophyll-a by spectrophotometry. The experiment showed that repeated freeze-thaw extraction method is increase efficiency and safer. The absorbance is less than 0.005 in 750nm. There was no difference of Two computing formulae results.Keywords:spectrophotometry, chlorophyll-a, grinding extraction method, repeated freeze-thaw extraction method叶绿素a是衡量湖泊、水库、河流等水体富营养化程度的重要指标之一。
分光光度法测定水中的叶绿素a
分光光度法测定水中的叶绿素a分光光度法测定水中的叶绿素a1 检出限水样体积300 mL、使用1 cm比色皿时，叶绿素a的检出限为0.11 μg/L，测定下限为0.5 μg/L；叶绿素b的检出限为0.25 μg/L，测定下限为1.0 μg/L；叶绿素c的检出限为0.25 μg/L，测定下限为1.0 μg/L。
2 方法原理将一定量水样用玻璃纤维膜过滤，收集藻类，使用反复冻融法对藻类细胞进行破碎，用90%丙酮溶液提取叶绿素，根据叶绿素光谱依次测定750 nm、664 nm、647 nm、630 nm波长下的吸光度，计算叶绿素含量。
3 试剂和材料3.1 碳酸镁悬浊液：ω（MgCO3）= 1%，1.0 gMgCO3 100 mL纯水3.2 丙酮溶液：ψ（C3H6O）= 90%，900 mL丙酮加100 mL纯水3.3 盐酸溶液：c（HCl）=0.1 mol/L。
8.5 mL浓盐酸加入500 mL纯水，冷却后稀释至1000 mL。
4 仪器和设备4.1 抽滤装置4.2 滤膜4.3 具塞玻璃离心管4.4 水浴锅4.5 离心机：转速3000 ~ 4000 r/min4.6 分光光度计4.7 比色杯：3 cm5 水样采集5.1 水样采集采集500 ~ 1000 mL 水样于棕色玻璃瓶或深色塑料瓶中。
5.2 保存避光保存，低温运输，在-20℃以下的冰箱内保存，在25 d 内分析测试。
6 分析步骤6.1 清洗玻璃仪器所有玻璃仪器应该清洗干净，尤其避免酸性条件下引起的叶绿素a 的分解。
6.2 滤膜过滤每种测定水样取300 mL ，加入0.6 mLMgCO 3悬浊液，用滤膜过滤。
6.3 提取将滤膜转移至具塞试管，加少量碳酸镁粉末和10 mL 已水浴加热至50℃的90%丙酮溶液。
塞紧塞子并在管子外部罩上遮光物，充分震荡，避光提取4 h 。
6.4 离心提取完毕后，离心管置于离心机上4000 r/min 离心20 min ，取出离心管，用移液管将上清液移入刻度离心管中，塞紧塞子，4000 r/min 再离心10 min 。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
标题：水质中叶绿素a的测定——荧光分光光度法
一、概述
水是生命之源，保持水质清洁对人类健康和生态环境至关重要。
叶
绿素a是植物和浮游生物体内的主要叶绿素成分，它对于水体中的生
物和化学过程具有重要影响。
对水体中叶绿素a的测定具有重要意义。
在众多叶绿素测定方法中，荧光分光光度法以其快速、灵敏、准确的
特点而受到广泛关注。
二、荧光分光光度法原理及优势
1. 荧光分光光度法原理
荧光分光光度法是通过叶绿素a在特定激发光波长下产生荧光信号，并测定荧光光谱的强度来间接测定叶绿素a的浓度的一种方法。
其原
理是叶绿素a在特定波长范围内吸收光线后发生激发态转变为基态过
程中发射荧光。
通过检测叶绿素a的荧光强度，可以推断水体中叶绿
素a的浓度。
2. 荧光分光光度法优势
a. 灵敏度高：荧光分光光度法对叶绿素a含量的检测具有高灵敏度，能够在较低浓度范围内进行准确测定。
b. 非破坏性：该方法无需对样品进行破坏性处理，不影响样品原有
特性，适用于连续监测和长期调查。
c. 快速准确：荧光分光光度法测定简单快速，结果准确可靠。
三、荧光分光光度法测定叶绿素a的步骤
1. 样品采集
样品来源于自然水体或实验室模拟水体。
应在样品收集后尽快进行实验分析，或进行样品的冷冻保存。
2. 仪器调试
根据仪器操作手册调试荧光分光光度仪，确定最佳激发波长和检测波长。
3. 样品处理
将样品进行预处理，如滤过滤膜去除颗粒物，或使用溶解剂提取叶绿素a。
4. 校准仪器
利用标准叶绿素a溶液校准荧光分光光度仪，确定荧光强度和叶绿素a浓度的线性关系。
5. 测定样品
放置校准后的仪器测定样品荧光强度，根据标准曲线计算叶绿素a 的浓度。
四、荧光分光光度法在水质监测中的应用
荧光分光光度法在水质监测中具有广泛的应用价值，主要体现在以下几个方面：
1. 监测水体富营养化程度：叶绿素a是水体富营养化的重要指标之一，荧光分光光度法可以快速准确地测定水体中叶绿素a的含量，从而评估水体富营养化程度。
2. 生态环境评估：荧光分光光度法可对水体中微生物的活性和生态环境进行评估，对水体生物多样性和生态平衡的研究具有重要意义。
3. 水质治理及监控：水体中叶绿素a含量的变化可以反映污染物输入、水体循环和植物生长等情况，荧光分光光度法可作为水质监控和治理的重要手段之一。
五、结论
荧光分光光度法作为测定水体中叶绿素a含量的有效方法，具有灵敏度高、准确快速等优点，适用于水质监测、环境评估等领域。
在未来的研究中，可以进一步提高荧光分光光度法的应用范围和精确度，推动其在水环境科学中的更广泛应用。
六、参考文献
1. 徐勇, 许晨. 叶绿素荧光及其应用[J]. 海洋学报, 2005, 27(2): 94-100.
2. 俞秀英, 林增耀, 陈启华,等. 水中叶绿素的快速荧光光谱检测方法[J]. 光电技术应用, 2007, 14(4): 263-265.
3. Lorenzen, C. J. Determination of chlorophyll and pheo-pigments: spectrophotometric equations[J]. Limnology and Oceanography, 1967, 12(2):343-346.
以上是本文关于水质中叶绿素a的测定，介绍了荧光分光光度法的原
理及优势，并详细描述了测定步骤和在水质监测中的应用，希望对相关技术研究和应用提供一定的参考。