补体依赖的细胞毒实验
补体依赖的细胞毒实验原理(一)
补体依赖的细胞毒实验原理(一)补体依赖的细胞毒实验1. 介绍补体依赖的细胞毒实验（complement-dependent cytotoxicity assay，CDC）是一种常用的实验技术，用于评估抗体对细胞的毒杀效应。
该实验可用于研究抗体依赖的细胞毒杀机制、药物研发以及免疫治疗等领域。
2. 实验原理补体系统补体是机体免疫系统的重要组成部分，由多种蛋白质组成。
在免疫应答中，当抗原被抗体结合后，激活的补体系统可以诱导细胞溶解、炎症反应以及免疫调节等生物学效应。
补体的有效结合和活化是补体依赖的细胞毒实验的基础。
实验流程1.准备目标细胞：这里使用靶细胞，如癌细胞，可以通过培养得到。
2.添加待测抗体：将待测抗体添加至与靶细胞共同培养的细胞培养基中，使其与靶细胞形成复合物。
3.洗涤：以洗涤液洗去未结合的抗体。
4.添加补体：添加激活的补体，使其与复合物结合。
5.孵育：在适当的条件下（如体外孵育培养），让复合物和补体相互作用。
6.毒杀效应评估：观察细胞活力、溶解程度或细胞的其他形态学变化，评估抗体的毒杀效应。
3. 应用领域免疫治疗补体依赖的细胞毒实验可用于评估抗体依赖性细胞毒杀（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC）效应，帮助筛选和优化免疫治疗药物，如单克隆抗体。
抗体研究该实验可以评估不同抗体的效应，分析抗原-抗体相互作用、抗体亚类、特异性和亲和力等对细胞毒杀的影响，促进抗体研究和开发。
免疫学研究研究补体依赖细胞毒杀机制有助于深入理解免疫应答过程中的细胞间相互作用、信号传导、炎症过程等免疫学基础问题。
4. 结论补体依赖的细胞毒实验是一种权威且可靠的实验方法，可用于评估抗体对细胞的毒杀效应。
通过该实验，可以深入研究抗体的毒杀机制，从而为免疫治疗和抗体研究提供重要参考。
参考文献： [1] Pandey JP, et al. Complement-dependent cytotoxicity (CDC) assays for anti-HLA antibodies. Methods Mol Biol. 2013;1034:59-67. [2] Chiu ML, et al. Assay development for the detection of antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC) activity of anti-influenza neuraminidase antibodies. J Vis Exp. 2014;(88):e51241.。
改良一步法微量淋巴细胞毒交叉试验
淋巴细胞毒交叉试验也称补体依赖细胞毒试验（cdc）。
它是检查器官移植受者体内有无针对供者，或者供者针对受者的hla抗体，在器官移植前一定要进行cdc检测。
如果受者血清中检出针对供者的hla抗体，一般认为是配合禁忌，移植后受者会发生超急性排异反应，导致移植失败。
由于试验是在施行器官移植术前临时进行匹配的试验，要求在短时间内报告结果，因此我们对该技术作了改良并与传统方法进行比较，收到满意效果。
现报告如下：一、材料和方法1.被检对象：标本来源于我院近10个月住院和门诊280例拟做肾移植待诊病人和其他器官移植待诊病人，采静脉血2 ml不抗凝待测。
2.试剂：免疫磁珠、荧光染液由美国o l公司提供，抗全淋巴细胞抗体试剂购自武汉生物制品研究所。
3.方法：(1)改良一步法：采用免疫磁珠3～5 μl分离出淋巴细胞，在terasaki板上每孔加入无菌矿物油5 μl，每排第1孔加生理盐水1 μl做阴性对照，第2孔加抗全淋巴细胞抗体1 μl做阳性对照，第3～6孔各加受者血清1 μl(即重复4孔试验)，每孔各加供者淋巴细胞1 μl(细胞浓度为2 000个/μl)，每孔各加补体1 μl，置22～25℃室温下反应45 min左右，每孔加荧光染液5 μl，倒置荧光显微镜下观察细胞毒性反应，分析判断结果。
(2)传统常规法见参考文献［1］。
二、结果采用改良一步法进行了400次淋巴细胞毒交叉试验，有9次检出阳性(阳性率为2.25%)。
其中1例患者反复多次cdc阳性，后进行hla抗体检测，特定细胞群反应抗体 (panel reactive antibody， pra) 阳性率为53.5%，提示抗hla-a2抗体增多，故放弃移植。
一步法与传统法试验比较：样本用量一步法1 μl，传统法40 μl；试验全过程一步法1.5 h内完成，传统法需2.5～4 h；补体用量一步法1 μl，传统法40 μl；30例标本用双盲法同时试验，结果一致。
三、讨论改良一步法cdc缩短和简化了试验时间、操作步骤，整个试验过程在1.5 h内完成。
补体依赖的细胞毒实验原理
补体依赖的细胞毒实验原理
补体依赖的细胞毒实验（CDC assay）是一种用于评估抗体对细胞的溶解作用的实验方法。
其原理基于以下步骤：
1. 样品准备：首先需要准备测试物质，包括待测抗体、目标细胞和补体。
目标细胞可以是病原体（如细菌、病毒等）或恶性肿瘤细胞。
2. 加入抗体：将待测抗体加入含有目标细胞的培养基中，使抗体与细胞发生特异性结合。
3. 加入补体：补体是一类血清蛋白质，它们可以通过活化补体途径或替代途径与抗体-抗原结合物相互作用，形成膜攻击复合物，导致细胞溶解。
4. 孵育：将培养基中的抗体、目标细胞和补体混合均匀后，置于恰当的培养条件下孵育一段时间。
5. 细胞溶解检测：通过染色或其他方法（如测定乳酸脱氢酶活性）检测细胞的溶解情况。
如果抗体与目标细胞特异结合，并且补体受到激活，那么补体依赖的细胞溶解会发生，检测方法将显示细胞溶解的程度。
通过上述原理，补体依赖的细胞毒实验可以用来评估抗体的溶解作用和免疫效力，对于研究和发展抗体治疗、疫苗研发等具有重要意义。
细胞毒实验的分类原理性检测方法与应用上课课堂
最大释放均值（Max）=最大释放孔cpm均值-最大释放对照孔cpm均值 自发释放均值（S自发）=自发释放孔cpm均值-培养基对照孔cpm均值
无菌取脾 研磨成单细胞悬液+2ml 1640
（无FBS)
细胞计数 【?/ml】 取20ul细胞+980ul的1640 混匀后取出20ul细胞+20ul台盼蓝
操作流程
行测定。
• 因此多年来人们一直试图寻找可以替代51Cr释放法的 CTL活性测定方法，如采用荧光标记、流式细胞分析 和报告基因等技术的灵敏可靠、简单易行的非同位素 测定法。
MTT（或MTS）还原法
本法根据细胞代谢活动与活细胞数直接成比例的原理，通过测定靶细 胞代谢活性的减少来反映效应细胞所致靶细胞的死亡。氧化型MTT进 入细胞后被线粒体脱氢酶还原生成蓝色formazan颗粒，经溶剂溶解后 比色定量，其颜色深浅直接与活细胞数有关，与靶细胞对照孔比较可 计算效应细胞杀伤靶细胞%。本法简便易行，无需预标靶细胞，与 51Cr释放法比较相关性好，还可测定淋巴细胞增殖活性和NK细胞活性。 MTT类似物MTS在细胞内还原的formazan产物具有水溶性，性质较稳定， 其测定简单快捷，特别适合于大批量测定。微生物污染可导致本法假 阳性结果。
验记录本上。
要对结果进行分析，写出影响结果的因素，及注意事项。
SI
50 40 30 20 10
0 100:1
Excel 作 图
NK杀伤实验
50:1 E：T
25:1
检测方法
1.1.1 alamarBlue一步荧光测定法 alamarBlue为活细胞代谢指示剂，易溶于水，进入细胞后经线粒体
酶促还原产生荧光及颜色变化，可用以定量。本法与51Cr释放法纺织 厂较有以下特点：①特异性相当但灵敏度更高，重复性好，组内及组 间差异很小。②使用方便，无需预先标记靶细胞及离心和洗涤步骤， 适用于大批量样品的高准确性自动测定。③alamarBlue的使用浓度不 影响细胞正常代谢及基因表达，可在无菌条件下测定后继续培养扩增 细胞，有利于对培养细胞的连续监测及深入研究。④还可测定淋巴细 胞增殖或化学物质的细胞毒性及细胞凋亡。⑤多种粘附或非粘附细胞 系、细菌、真菌等可用作靶细胞，所需效应细胞数较少（3×105/孔 即可）。⑥含胎牛血清（FCS）及酚红的培养液也不干扰测定结果
补体的测定及应用
正式试验
分类:小量法、微量法，以小量法常用 实验过程:
稀释和处理后的标本与已知抗原或抗体、补体温育
与指示系统共育
结果判度: 对照管: 阴性对照管:溶血 阳性对照管:不溶血 抗体或抗原对照管:完全溶血 待检血清对照管:完全溶血 绵羊红细胞对照管:不出现自发性溶血
2个单位:全溶 ➢ 补体对照管： 1个单位:全溶或略带少许红细
4、补体的性质不稳定，试验前均应进行滴定
待测标本 1、采血并及时分离血清用于检测或－20℃保存备用。 2、试验前，应先将血清56℃加热30min（或60℃3min）以灭活补体。
血清标本遇有抗补体现象时，可作下列处理： 加热灭活时提高12℃ －20℃冻融后离心去沉淀 以3mmol/L盐酸处理 加入少量补体后再行灭活 以白陶土处理 通入CO2 以小白鼠肝粉处理 用含10％新鲜鸡蛋清的生理盐水稀释血清
补体的活化途径
1、经典途径 以抗原抗体复合物结合C1q启动激活的途径，又称第一途径或传统 途径，是抗体介导的体液免疫应答的主要效应方式
2、MBL途径 MBL结合至细菌启动的途径，激活剂是机体的炎症反应急性期时 产生的MBL和C反应蛋白等
3、旁路途径 通过微生物表面等膜性物质，从C3开始，不依赖特异性抗体的形 成，在感染早期可为机体提供有效的防御。
方法学评价和临床意义
方法简便、快速，但敏感性低，补体的活性除与反应体积成反比 外，还与反应所用的缓冲液、SRBC的数量以及反应温度有关
总补体活性的参考范围为50～100U/ml
CH50增高见于： 急性炎症、组织损伤、恶性肿瘤等
CH50降低见于： 系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎和强直性脊柱炎 、急性肾小球 肾炎等
➢现 状
影响的因素多、各种制剂需要烦琐的稀释和滴定等， 现代化、自动化抗原抗体检测方法的不断涌现，补体结合试验逐 渐被遗弃 补体结合试验作为一种经典的免疫方法类型，其设计和原理仍对 新型免疫方法的建立有着启迪和指导作用
补体依赖的细胞毒实验报告
补体依赖的细胞毒实验报告篇一：补体依赖的细胞毒性创新助手报告——主题分析报告创新助手平台提供北京万方软件股份有限公司2014-06-28报告目录报告核心要素................................................................. ........................................ I一、主题简介................................................................. (1)二、主题相关科研产出总体分析................................................................. . (1)文献总体产出统计............................................................... (1)学术关注趋势分析............................................................... .. (2)三、主题相关科技论文产出分析................................................................. . (2)中文期刊论文............................................................... . (2)近十年中文期刊论文分布列表 (2)中文期刊论文增长趋势 (3)发文较多期刊............................................................... .. (4)发文较多的机构............................................................... . (4)发文较多的人 (4)核心期刊分布数量对比 (4)最近相关中文期刊论文 (7)被引较多的相关期刊论文 (7)学位论文............................................................... (8)近十年学位论文年代分布列表 (8)学位论文增长趋势............................................................... (9)硕博学位论文数量对比...........................................................10发文较多的机 (10)发文较多的人物............................................................... .. (10)最近相关学位论文............................................................... . (11)中文会议论文............................................................... .. (11)近十年中文会议论文年代分布列表 (11)中文会议论文增长趋势...........................................................12中文会议论文主办单位分布 (13)发文较多的机构............................................................... .. (13)发文较多的人 (13)最近相关中文会议论文............................................................13外文期刊论文............................................................... .. (14)近十年外文期刊论文年代分布列表 (14)外文期刊论文增长趋势...........................................................14最近相关外文期刊论文...........................................................15外文会议论文................................................................. ...................... 15 I篇二：CDC ADCC细胞毒性1 Antibody-dependent cellular cytotoxicity 抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用In antibody-dependent cellular cytotoxicity , Fc gammareceptors on the surface of immune effector cells bind the Fc region of an antibody, itself specifically bound to a target cell. The cells that can mediate ADCC are nonspecific cytotoxic cells such as natural killer cells, macrophages, monocytes and eosinophils. UponFCGR binding to the antibody, the FCGR ITAM is phosphorylated, which triggers the activation of the effector cell and the secretion of various substances that mediate the destruction of the target cell.The level of ADCC effector function is high for human IgG1 and IgG3, low for IgG2 and IgG4, and for these last two subclasses, the level of binding depends on the FCGR isotype and on the cell type.2 Complement-dependentcytotoxicity 补体依赖的细胞毒性作用In complement-dependent cytotoxicity , the C1q binds theantibody and this binding triggers the complement cascade which leads to the formation of the membrane attack complex at the surface of the target cell, as a result of the classical pathway complement activation.The level of CDC effector function is high for human IgG1 and IgG3, low for IgG2, and null for IgG4.篇三：医学免疫学实验第一章免疫学概要1.2.机制。
cdc试验原理
cdc试验原理
CDC试验（Complement Dependent Cytotoxicity Test）是一种利用补体依赖的细胞毒性试验原理来检测抗体或补体介导的细胞毒性的方法。
该试验常用于检测针对细胞表面抗原的IgG或IgM抗体，这些抗体与相应的抗原特异性结合后，可以通过经典途径激活补体，导致细胞膜穿孔，从而使细胞死亡。
CDC试验的基本原理是利用延迟线将时钟信号延时再进行比较，由此实现同步信号的延时与比较。
在该试验中，细胞表面抗原与相应的抗体特异性结合后，通过补体的作用导致细胞死亡。
通过比较处理前后的细胞存活率，可以检测出抗体的细胞毒性。
总之，CDC试验是一种常用的检测抗体或补体介导的细胞毒性的方法，在免疫学、病理学等领域有广泛的应用。
2023年检验类之临床医学检验技术(中级)押题练习试卷A卷附答案
2023年检验类之临床医学检验技术（中级)押题练习试卷A卷附答案单选题（共100题）1、患者男，脑髓液常规结果：WBC：30×106/L。
分类：单个核细胞90%，多个核细胞10%。
最可能为（）。
A.结核性脑膜炎B.化脓性脑膜炎C.病毒性脑膜炎D.脑出血或蛛网膜下腔出血E.结果无特异性，无法判断【答案】 C2、原始粒细胞的免疫标志是（）。
A.CD33B.CD3C.CD19D.CD41E.CD56【答案】 A3、下列哪项属于特异型糖尿病A.自身免疫性糖尿病B.2型糖尿病C.胰岛素生物学作用有关基因缺陷所致糖尿病D.特发性糖尿病E.GDM【答案】 C4、下列关于血肌酐和尿素的叙述，错误的是（）。
A.血肌酐和尿素的浓度取决于机体含氮化合物的分解代谢和肾脏的排泄能力B.肌酐清除率和尿素浓度可反映肾小球滤过功能C.血肌酐比Ccr测定更能准确灵敏地反映肾小球滤过功能D.酶法测定尿素特异性强E.肌酐苦味酸动力学法测定受VitC.黄疸、乳糜等物质的影响【答案】 C5、抗球蛋白试验可用于检测A.总补体活性B.溶血性疾病的不完全抗体C.红细胞的脆性D.待测抗原或抗体E.溶血素滴度【答案】 B6、关于辅酶的叙述，正确的是A.与酶蛋白结合紧密的金属离子B.与酶蛋白结合紧密的非金属离子C.在催化反应中不与酶的活性中心结合D.在反应中作为底物传递质子、电子E.与酶蛋白共价结合成多酶体系【答案】 D7、女，40岁，有贫血临床表现，MCV86fl，MCH29pg，MCHC320g／L，其贫血属于A.小细胞低色素性贫血B.正常细胞性贫血C.大细胞性贫血D.单纯小细胞性贫血E.巨幼红细胞性贫血【答案】 B8、患者女，22岁。
近期因流鼻涕、不断打喷嚏、有时候感觉呼吸困难就诊。
诊断为过敏性鼻炎，主要表现为哪种免疫球蛋白升高？（）A.IgGB.IgAC.IgD.IgE.IgM【答案】 D9、下丘脑一腺垂体激素分泌的反馈调节中，属于正反馈调节的是A.甲状腺激素对下丘脑TRH的反馈调节B.甲状腺激素对下丘脑TSH的反馈调节C.甲状腺激素对腺垂体TSH的反馈调节D.月经周期中排卵期前雌激素水平达高峰时，对GnRH及LH释放的反馈调节E.皮质醇对腺垂体ACTH的反馈调节【答案】 D10、关于试带法测尿糖的叙述，正确的是A.用葡萄糖氧化酶法原理B.试剂中主要成分是葡萄糖醛化酶C.试剂中色原是溴酚蓝D.尿中所有的糖均起反应E.服用大剂量的维生素C可致假阳性【答案】 A11、反映肾小管排泌功能的指标A.尿钠与滤过钠排泄分数(FeNa)测定B.酚红排泄试验(PSP)C.自由水清除率D.内生肌酐清除率E.氯化铵负荷试验【答案】 B12、下列不属于血小板的细胞器是A.高尔基复合体和线粒体B.α颗粒和糖原颗粒C.致密颗粒和溶酶体颗粒D.微管和微丝E.α颗粒和δ-颗粒【答案】 D13、尿17-羟皮质类固醇主要是何种激素的代谢产物？（）A.醛固酮B.脱氢雄酮C.皮质醇D.雌二醇E.孕酮【答案】 C14、合成糖原时，葡萄糖的直接供体是A.1-磷酸葡萄糖B.6-磷酸葡萄糖C.CDP葡萄糖D.UDP葡萄糖E.GDP葡萄糖【答案】 D15、标记蛋白质巯基的活化生物素是（）。
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注意事项： 台盼蓝染色后放置时间不能太长，5min之内观察结果，否则出 现假阳性，需要重新染色。 LOGO
补体依赖细胞毒实验的应用
检查细胞膜抗原
鉴定抗体的特异性
微量淋巴细胞毒试验 检测人体的组织相容性 选择性地去除某一细胞亚群
需要收回的
剪刀、镊子、铜网 玻璃培养皿。
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操作步骤
一、小鼠胸腺细胞悬 液的制备
4~6周龄小鼠断颈 处死，取出胸腺放至含 有3 mL RPMI 1640培养 液的平皿中，以剪刀和 镊子将组织处理成单细 胞悬液，利用移液器取 出后放入试管内备用。
胸腺
注意事项： 小鼠断颈要迅速、彻底，以防小鼠挣扎过程中出血过多，也可事 先摘眼球放血。
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操作步骤
二、细胞毒实验：
按下表加样
PBS
振荡混匀，置37C水浴箱，10min
Ag+Ab
振荡混匀，置37C水浴箱，20min 各加100 ul 0.4%台盼蓝，混匀，室温2min
complement
振荡混匀，滴片加盖玻片，镜检
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结果观察
台盼蓝染色：如果细 胞膜不完整、破裂，台盼 蓝染料进入细胞，细胞变 蓝。 如果细胞膜完整，细 胞不为台盼蓝染色，则为 正常细胞或凋亡细胞。此 方法对反映细胞膜的完整 性，区别坏死细胞有意义。 计算杀伤率： 在高倍镜下计数200个细胞中死细胞的 百分率
A A. 对照组
B B. 实验组
补体依赖的细胞毒实验
Complement-dependent cytotoxicity
补体的作用和激活途径
补体的作用 溶菌和溶细胞 促进中和溶解病毒 调理吞噬 炎症介质 补体的激活途径 经典途径 旁路途径 MBL途径
本次实验目的
1
掌握细胞毒实验 的原理
2
补体依赖细胞毒实 验基本操作步骤
3
了解补体依赖细胞 毒实验的应用
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Байду номын сангаас
实验原理
抗原与抗体结合
+ 补体
台盼蓝染液
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实验主要材料
实验材料
1. 小鼠 2. 抗血清（Ab） 3. 补体 新鲜豚 鼠血（补） 4. PBS缓冲液， 载玻片、盖玻 片、一次性试 管 5. 台盼蓝染色液