葡萄酒中苹果酸的测定
葡萄酒的检测—葡萄酒的感官检测
3
小结
1、感官检验需要的条件 2、葡萄酒感官检验的步骤
葡萄酒的品评实验
葡萄酒的品评实验
葡萄酒的品评实验
葡萄酒的品评实验
葡萄酒的品评实验
实验目的 • 掌握对葡萄酒产品的感官鉴评方法
实验原理
• 利用口、眼、鼻等感觉器官检查产 品的感官特性，即对葡萄酒产品的 色泽、香气、滋味及典型性等感官 特性进行检查与分析评定。
葡萄酒的品评实验
准备
调温与排序
品评4S
葡萄酒的品评实验
葡萄酒的品评实验
调温、排序与编号
品酒最佳温度
品酒顺序
在品尝多种葡萄酒时，顺序上应遵循以下基本原则： 1.先白后红 2.先淡后浓 3.先干后甜 4.先普通后高档 5.先浅龄酒再陈年酒 6.先起泡酒再静止酒
按顺序给样品编号，并在酒杯下部注明同样编号。
• 舌根感觉到苦味，这是多酚 类物质
10~12秒
• 舌头上能分辨出由于单宁呈 现的收缩涩感，好的葡萄酒 在口中味道的变化非常缓慢， 口感较厚，而质量较差的酒 则变化速度较快
葡萄酒的品评实验
四得评论
葡萄酒评分标准用语
葡萄酒的品评实验
四得评论
葡萄酒评分细则
二 葡萄酒感官检验的步骤 1.选用不同要求的合适的品酒杯
二 葡萄酒感官检验的步骤
2.调节葡萄酒的温度
起泡葡萄酒
9-10度
普通白葡萄酒
10-11度
优质白葡萄酒
13-15度
干、半干、半甜葡萄酒 16-18度
甜红葡萄酒
18-20度
二 葡萄酒感官检验的步骤
3.顺序和编号
一次品尝检查多种类型样品时，其品尝顺序为:
葡萄酒的品评实验
倒酒
果酒有机酸含量的测定方法
果酒有机酸含量的测定方法
果酒是一种含有很高有机酸的饮品，例如苹果酒、草莓酒、葡萄
酒等，因此测定果酒的有机酸含量对于了解饮品的质量和口感有着重
要的作用。
下面就介绍一种测定果酒有机酸含量的方法。
（一）实验原理
使用碱溶液滴定果酒中的有机酸，有机酸和碱反应产生盐和水，
反应速度快，且滴定结束点明显，准确度高。
（二）实验步骤
1.称取10毫升的果酒，加入50毫升蒸馏水稀释至100毫升，混
匀待用。
2.取25毫升这个混合溶液，加入几滴酚酞指示剂，并加入
0.1mol/L的氢氧化钠溶液，搅拌均匀。
3.用0.1mol/L盐酸滴定氢氧化钠至混合液颜色变为粉红色，记
录所需的滴定计数N。
（三）计算结果
（1）计算盐酸的摩尔浓度（C）。
C=0.1mol/L（由于盐酸与氢氧化钠的滴定反应是一对一的反应，因此
盐酸的摩尔浓度与氢氧化钠的摩尔浓度相等）
（2）计算有机酸含量（m/V）。
m/V = N*C*88.01/1000
其中，N为滴定计数，C为盐酸浓度，88.01为分子量，1000为溶液的
体积（单位为毫升）。
以上就是测定果酒有机酸含量的实验步骤，需要注意的是，在实
验过程中应该保证实验器材的干净和精准，以确保实验结果的准确性。
酶法监测苹果酸-乳酸发酵在赤霞珠葡萄酒上的应用
上 的应用
邵丽 ，刘春 生 ，史铭 儡 ，葛斌 ，李小玲 ，段 文佳 （ 岛华 东 葡萄酿 酒有 限公 司 ，山东青 岛 ２ ６ ０ ） 青 ６ １ ２
摘 要 ：苹 果酸一 乳酸 发 酵是优 质 红 葡萄 酒酿造过 程 中重要 的工 艺环 节 ，可 以有效提 高葡 萄酒 的品质和 感 官质量 。 本试验 通过 酶 法对Ｌ苹 果 酸含量 的检 测确 定 红 葡萄酒苹 果 酸一 酸 发酵过程 。 结果 表明 ，该方 法具 有操作 简便 、特 异性 － 乳 好 、灵敏 度 高 、定 量 准确 等优 点 ，适 用于 监控 和 掌握 苹果 酸一 酸发 酵进程 ，有利 于 实现 苹果 酸一 乳 乳酸 发 酵工 艺的 合理
并 增 加风 味 的复 杂性 ，还 可以 提高 葡萄 酒 的生物 稳 定性 ＿ ｊ 因而 ，苹 一 ２。 。 乳发 酵 现 已成 为 酿 造优 质红 葡 萄 酒 必须进 行 的重要 工艺环 节 。 以Ｌ 苹 果 酸 的含 量 作 为 指标 监测 和 控 制 苹 一 一 乳
Ｕ ２ ０ 型 紫外 可 见分 光光 度计 （ Ｖ－８２ 上海 尤 尼柯 仪 器 有 限 公 司 ） ；８ － 电 动 离 心 机 （ 海 梅 香 仪 ０２ 上
快速 、简便 、 灵敏 、特异 性 良好 ，在 国外 已经得到
了广 泛应 用 。本 文拟 采 用Ｌ 苹 果酸 酶法 检 测试 剂盒 一 对苹－ 乳发 酵 过 程 中Ｌ 苹 果 酸 的 含 量 进 行 及时 追 踪 一 检 测 ，以期 实 现 苹 一 发 酵 工 艺 的 合 理控 制 ，有 效 乳
Ｌ，样 品３ ． 的Ｌ 苹果 酸浓 度为 １ ３ ／ ． ８ｇＬ。当Ｌ 苹果 酸 ５ 一 ＜０ １ｇＬ ． ／ 时就 表 明 苹果 酸 一 乳酸 发 酵 过 程结 束 ，因 此 样 品 １ 代 表批 次 的葡萄 酒苹 果 酸一 酸发 酵过 程 Ｎ 乳
高效液相色谱检测葡萄及葡萄酒中7种有机酸方法的建立
高效液相色谱检测葡萄及葡萄酒中7种有机酸方法的建立沈 燕1，张正文1，刘兴凯1，王福成2，邵学东1*（1.君顶酒庄有限公司，山东烟台 265607；2.烟台市蓬莱区葡萄与葡萄酒产业发展服务中心，山东烟台 265699）摘 要：目的：建立了利用高效液相色谱测定葡萄及葡萄酒中7种有机酸的检测方法。
方法：色谱条件为Hi-Plex H色谱柱（300 mm×7.7 mm，8 μm），PL Hi-Plex H保护柱（50 mm×7.7 mm，8 μm）；紫外检测波长210 nm；流动相为0.006 mol·L-1的硫酸；流速0.6 mL·min-1；柱温55 ℃；进样量10 μL。
结果：草酸、柠檬酸、酒石酸、苹果酸、琥珀酸、乳酸和乙酸出峰时间均在20 min以内；标准曲线线性关系良好，相关系数（R2）在0.999 9～1.000 0；检出限在0.031 4～0.722 3 mg·L-1；加标回收率在95.24%～102.04%，其相对标准偏差在0.16%～1.87%。
结论：该方法操作简单，检测时间短，具有较高的准确性和精确性。
关键词：有机酸；葡萄；葡萄酒；高效液相色谱；检测方法Establishment the Method of Seven Kinds of OrganicAcids in Grape and Wine by High Performance LiquidChromatographySHEN Yan1, ZHANG Zhengwen1, LIU Xingkai1, WANG Fucheng2, SHAO Xuedong1*(1.Junding Castle Co., Ltd., Yantai 265607, China; 2.Yantai Penglai District Grape and Wine Industry DevelopmentService Center, Yantai 265699, China)Abstract: Objective: To establish a HPLC method for the determination of 7 organic acids in grape and wine. Method: The chromatographic conditions were Hi-Plex H column (300 mm×7.7 mm, 8 μm) and PL Hi-Plex H protective column (50 mm×7.7 mm, 8 μm). UV detection wavelength 210 nm; sulfuric acid with 0.006 mol·L-1 mobile phase; flow rate 0.6 mL·min-1; column temperature 55 ℃. The sample size was 10 μL. Result: The peak time of oxalic acid, citric acid, tartaric acid, malic acid, succinic acid, lactic acid and acetic acid were all within 20 min. The standard curve has a good linear relationship with the correlation coefficient（R2） ranging from 0.999 9 to 1.000 0. The detection limit was 0.031 4～0.722 3 mg·L-1. The recoveries ranged from 95.24% to 102.04%, and the relative standard deviations ranged from 0.16% to 1.87%. Conclusion: The method is simple to operate, short detection time, and has high accuracy and accuracy.Keywords: organic acid; grape; wine; high performance liquid chromatography; detection method有机酸是葡萄果实及葡萄酒中体现风味的主要物质之一，其含量是衡量葡萄果实成熟度和品质的重要参数，在葡萄酒的酿造中发挥着关键作用，对酒的感官质量有一定的影响，与酒的物理化学以及微生物稳定性有着紧密联系[1-4]。
葡萄酒的稳定性试验
葡萄酒的稳定性试验 The latest revision on November 22, 2020实训十一：葡萄酒的稳定性试验一、实训技能验收标准通过对葡萄酒有关项目的稳定性试验，预测酒的稳定性；学习有关项目的测试方法，分析葡萄酒稳定性。
二、材料与仪器（1）材料与药品：红葡萄酒，白葡萄酒，酒石酸氢钾，氯化钠，饱和氯化钾溶液，酚酞，0.5mol/ＬNaOH，10%单宁，H2O2，K2S2O5，Na2S2O4·2H2O，5%硫氰化钾，浓盐酸，亚硫酸。
（2）仪器及器皿：比色管（25ml或50ml），磁力搅拌器，冰箱，漏斗，水浴锅，电炉，烧杯，玻璃棒，温度计（-20~100℃），高压灭菌锅，恒温培养箱，挥发酸测定装置，有机酸色谱分离装置。
三、步骤与方法（一）酒样的准备用于稳定性试验的酒样必须是澄清，澄清是稳定性试验的前提。
红、白葡萄酒都需要进行的稳定性试验项目：氧化、微生物、铁、酒石只是红葡萄酒需要进行的项目：色素只是白葡萄酒需要进行的项目：蛋白质、铜桃红葡萄酒容易出现与白葡萄酒相同的浑浊；而甜型葡萄酒和开胃酒容易出现红葡萄酒型的浑浊（二）冷冻试验目的：用于检验葡萄酒的酒石稳定性和红葡萄酒的色素稳定性。
1.将葡萄酒装入无色透明的玻璃瓶中，加塞密封，然后放入温度为酒的冰点之上0.5℃的冰箱中，保持7天，每天观察透明度变化情况。
酒样仍然澄清，说明该酒在冷冻的情况下是稳定的。
若有浑浊沉淀，说明该酒在冷冻的情况下是不稳定的，经离心分离，取其沉淀物于显微镜上检查。
若有结晶析出即为酒石结晶；若为絮状沉淀，则多有蛋白质或胶体沉淀；若沉淀物带有色泽，则为单宁色素或单宁蛋白质沉淀物。
2.将酒样在结冰条件下维持8－24hr，冰晶融化之后如果出现盐的结晶则意味着酒液不稳定。
检验酒石稳定性的方法：3.于250ml烧杯中注入50ml待测葡萄酒，准确称取0.125-0.15目的分析纯酒石酸氢钾200mg，加入酒中，烧杯中放入磁力搅拌棒，然后将烧杯置于铜制水浴锅中，烧杯周围堆放冰盐混合物（冰盐比为5：11），使温度保持在0－1℃，水浴锅放在磁力搅拌器上，开动磁力搅拌器，烧杯中的葡萄酒得以匀速搅拌，经2小时的搅拌后，将析出的沉淀物倾至漏斗中的滤纸上，用30ml饱和氯化钾液洗涤，将滤纸及沉淀物移入500ml烧杯中，加入中性蒸馏水50ml，加热待沉淀溶解后，加入酚酞指示剂，用0.5mol/LNaOH溶液滴定，然后计算出酒石酸氢钾值。
葡萄酒中植物乳杆菌苹果酸-乳酸发酵潜能评价
中 农 科学 2017,50(5):959-968 Scientia Agricultura Sinica
doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2017.05.019
葡萄酒中植物乳杆菌苹果酸-乳酸发酵潜能评价
卜潇 ，薛雪 ，程静 ，刘树文
1
1
2
3
2,4,5
西北农林科技大学食品科学 程学院/葡
程学院，陕西杨凌 712100 葡
2
西北农林科技大学葡
4
酒学院，陕西杨凌 712100 酒
3
中
农 大学食品科学
营养
酒研究中心，北京 100083
5
陕西省葡
葡
程技术中心，陕西杨凌 712100
西北农林科技大学合
葡
试验示范站，陕西渭南 715300
摘要： 【目的】 研究植物乳杆菌 Lactobacillus plantarum 对赤霞珠葡萄酒进行苹果酸-乳酸发酵 Malolactic Fermentation，MLF 的过程，评价植物乳杆菌的苹果酸-乳酸发酵潜能，旨在开发潜在的葡萄酒植物乳杆菌商 业苹果酸-乳酸发酵启动剂。 【方法】 以从新疆本土葡萄酒中筛选得到的糖苷酶活性较高的 4 株植物乳杆菌 CS-1、 XJ-14、XJ-25 和 XJA-2 为研究对象，对未经过 MLF 的赤霞珠干红葡萄酒分别进行 MLF，试验设置对照组 未进 行 MLF 。比较 4 株植物乳杆菌在葡萄酒 MLF 过程中菌株的生长情况、苹果酸含量的变化及 MLF 前后葡萄酒香 气成分的差异，全面评价植物乳杆菌的苹果酸-乳酸发酵潜能。 【结果】4 株植物乳杆菌在葡萄酒 MLF 过程进行 前 6 d，菌密度均有较大幅度的下降，而接种 6 d 后，菌密度的下降趋势开始放缓；所有菌株均表现出良好的 降酸能力，XJA-2 的降酸能力略高于其余菌株，15 d 内能够将葡萄酒中苹果酸浓度由 2.3 g·L-1 降至 1.0 g·L-1 左右，但所有菌株均未能完成 MLF；菌株 XJ-25 处理组能够显著降低原酒中的生青味等不愉悦的香气并带来更 加浓郁的花香及果香，XJ-14 处理组同样能够降低葡萄酒的生青味，但花香果香相对 XJ-25 较弱，而菌株 CS-1 处理组和菌株 XJA-2 处理组均略微降低了原酒中的生青味， 但由于化学味和植物味水平的提升， 掩盖了原酒本 身的花香和果香。 【结论】利用植物乳杆菌 XJ-25 启动 MLF 有利于乙醇酯类香气物质的释放，增强了葡萄酒的 果香及花香特征，相对于其余 3 株植物乳杆菌菌株更有利于提高葡萄酒香气质量。因此，植物乳杆菌 XJ-25 具有开发为商业发酵剂的潜能。 关键词：植物乳杆菌；苹果酸-乳酸发酵；葡萄酒；降酸；香气
葡萄酒酸度的测定原理
葡萄酒酸度的测定原理葡萄酒酸度的测定原理可以分为两个方面来讨论：总酸度和挥发酸度。
总酸度：葡萄酒中的总酸度是由多种有机酸所组成的，包括酒石酸、柠檬酸、苹果酸等。
总酸度的测定可以利用酸碱滴定的原理。
基本的步骤如下：1. 样品准备：首先需要将葡萄酒样品进行预处理，通常是通过蒸馏水稀释使样品浓度适合于滴定。
2. 酸碱滴定：将葡萄酒样品倒入酸碱滴定仪器中的烧瓶中，加入适量的指示剂（如菊粉蓝），然后用氢氧化钠溶液缓慢滴定直到指示剂的颜色变化。
在滴定过程中，指示剂会从红色逐渐转变为蓝色，这表示酸碱中和的终点。
滴定过程中记录下滴定液的用量。
3. 计算结果：通过滴定液用量的记录，可以计算出样品中总酸度的含量。
酸度一般以克/升或克酒石酸/升为单位来表示。
挥发酸度：葡萄酒中的挥发酸主要包括乙酸、乳酸等。
挥发酸度的测定基于酒样在酸性条件下挥发的原理。
基本的步骤如下：1. 样品准备：将葡萄酒样品倒入蒸馏瓶中，然后用酸处理溶液进行酸化。
酸处理溶液通常是硫酸，它能够将葡萄酒中的挥发性酸转化为对应的挥发性酯。
2. 加热蒸馏：将蒸馏瓶加热，使葡萄酒样品蒸发，挥发的酸蒸汽通过冷凝器冷凝成液体。
3. 滴定反应：将液体收集至滴定烧瓶中，然后用碱性溶液（如氢氧化钠溶液）滴定反应。
酸的滴定终点可以利用酸碱指示剂（如酚酞指示剂，红色转蓝色）来判断。
4. 计算结果：通过滴定液的用量可以计算出样品中挥发酸度的含量。
酸度一般以克/升或克乙酸/升为单位来表示。
需要注意的是，葡萄酒中的酸度会受到一些因素的影响，例如酿酒品种、发酵过程、保存条件等。
因此，在葡萄酒酸度的测定中，需要控制这些因素的影响，确保测定结果的准确性。
同时，还需要根据葡萄酒的品种和类型来确定酸度的合理范围。
葡萄酒分析检验实验2009年(实验)
葡萄酒分析检验实验葡萄酒学院二OO八年《葡萄酒分析检验》实验教学大纲学时：36学时实验一：葡萄酒分析常用试剂的配制及标定、葡萄酒pH值的测定掌握分析常用试剂的配制和标定的方法，学会使用pH计。
实验二：液相色谱仪的使用及葡萄酒酒度、比重的测定（3学时）了解液相色谱仪原理及基本操作技术，掌握比重瓶测定酒度的方法，掌握酒精计测定酒度技术，能正确使用酒精表及比重计。
实验三：气相色谱仪测定葡萄酒的酒度（3学时）了解气相色谱仪原理及基本操作技术、学会使用气相色谱仪测定葡萄酒酒度的方法，能正确操作气相色谱仪。
实验四：葡萄酒干浸出物、可溶性固形物的测定（3学时）掌握干浸出物测定方法及实际操作技术，学会使用手持糖量计。
实验五：葡萄酒糖的测定（3学时）了解液相色谱仪测定糖的原理及方法，掌握斐林试剂滴定法测定糖的原理、技术方法以及注意事项。
实验六：葡萄酒总酸、挥发酸的测定（3学时）了解电位滴定法测定总酸的原理，掌握总酸的测定方法及各类酒终点的确定方法及掌握挥发酸的测定原理及其实际操作技术。
实验七：葡萄酒二氧化硫的测定（3学时）掌握游离二氧化硫、总二氧化硫的测定原理、技术及终点的确定方法。
实验八：葡萄酒中苹果酸－乳酸层析分析（3学时）熟悉有机酸组分的测定原理。
掌握用纸层析法分离鉴定葡萄酒中主要有机酸的技术与方法。
实验九：葡萄酒中铁的测定（3学时）掌握邻菲啰啉比色法测定铁的原理与操作技术。
实验十：白葡萄酒中蛋白质的测定（3学时）掌握考马斯亮兰法测定白葡萄酒中蛋白含量的方法实验十一：葡萄酒综合分析实验（6学时）掌握葡萄酒分析检验的一般方法及主要指标的检测方法，要求学生能独立完成葡萄酒某项指标的检测。
实验一 葡萄酒分析常用试剂的配制标定及pH 计的使用一、实验目的：学会斐林试剂A 、B 液，氢氧化纳标液的配制及氢氧化纳的标定，熟练掌握pH 计的使用 二、试验试剂NaOH 、苯二甲酸氢钾、酒石酸钾纳、硫酸铜、氢氧化纳、酚酞 三、操作步骤⑴、斐林试剂A 、B 液的配制斐林试剂A 液：称取34.7g 硫酸铜 定溶至500ml 容量瓶中。
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葡萄酒中苹果酸的测定原理:利用MegaQuant TM (专利技术)测定L-苹果酸需要进行三步酶解反应，第一步：在L-苹果酸脱氢酶(L-MDH)的催化作用下，L-苹果酸被烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)氧化生成草酰乙酸：(1) L-苹果酸 + NAD+(L-MDH) oxaloacetate + NADH + H+第二步：加入过剩的L-谷氨酸，在谷草转氨酶的作用下，生成L-天门冬氨酸和2–酮戊二酸(2) Oxaloacetate + L-glutamate (GOT) L-aspartate +2-oxoglutarate第三步：在心肌黄酶的催化作用下，NADH还原碘硝基氯化四氮唑(INT)，生成甲基- INT(3) NADH + INT + H+(diaphorase) NAD+ +甲基-INT生成的甲基- INT的量取决于L-苹果酸的量，甲基- INT的吸光度值可在505nm下测量。
特异性, 灵敏度, 测量围和精确度:该实验方法是专门用于测定L-苹果酸含量的。
最小可调吸光光度为0.01个吸光单位，样品体积为20uL，此时的L-苹果酸浓度为7.7 mg/L。
如果最小可调吸光光度为0.02吸光光度，样品体积为20uL，此时的L-苹果酸检测线为15.4 mg/L。
该实验的测量围为0.15-15ug L-苹果酸(对于20uL样品液中的浓度为0.007-0.75 g/L)，同一样品分别进行两次测定，其吸光度值会有0.01-0.02吸光单位的变化，对于样品体积为20uL，此时的L-苹果酸浓度大约在7.7-15.4 mg/L之间，如果样品是经过稀释的，在计算结果时候需要乘以相应的稀释系数（F）,如果在样品制备阶段，样品的重量是被称量的，如：10g/L,0.02-0.05g/100g的细微差别能够被分辨。
干扰:红酒中的酚醛树脂会对本试验造成干扰，引起INT的“缓慢反应”（图2），因此在对未稀释的红酒进行测定时，必须首先用聚乙烯聚吡咯烷酮（PVPP）净化样品。
“缓慢反应”同样也发生在未稀释的白葡萄酒中，按照提供的方法进行测定，其缓慢反应速率非常的慢。
在用MegaQuant TM测定L-苹果酸的时候，对于存在的两种潜在的次要误差原因的认可是非常有必要的：1.使用PVPP去除了红酒中的大部分酚醛树脂，但是还是存在着“缓慢反应”，由于用PVPP处理过的葡萄酒（导致潜在的高估白葡萄酒中的L-苹果酸0.00-0.01g/L，或红葡萄酒中的浓度0.00-0.03g/L）其中存在的“缓慢反应”非常的慢，因此可以忽略不计（实验方法A），然而，如果想得到精确的结果，可以通过实验方法B精确计算得到。
2.推荐使用PVPP药片的测试方法（如每5 mL葡萄酒用1个药片）中，导致了对样品浓度进行了2 % (v/v)稀释，计算方法中考虑了这一点（请参照用PVPP处理样品方法）还原性物质能够干扰试验，引起“缓慢反应”，如：亚硫酸亚和抗坏血酸盐，但是仅仅能够对浓度不是很高的葡萄酒样品进行测定，如亚硫酸盐浓度在4 g/L，如果样品中的抗坏血酸盐含量非常高(> 400 mg/L)，则不能进行测定。
向已完成反应的试管中添加L-苹果酸（每20uL添加7.5 ug），通过增加的吸光度值进一步验证其他干扰的影响，利用附带的部的标准质控可以对干扰物质进行鉴定。
通过向样品中添加标准质控做定量回收试验，计算样品在处理和提取时的损失。
安全性:L-苹果酸测定所使用的试剂没有有毒物质。
然而浓缩缓冲液中含有作为防腐剂用的叠氮化钠(0.02 % w/v)，需要按照实验室安全操作规程进行试验。
试剂盒:MegaQuant TM L-苹果酸含量测定试剂盒可以进行60次的测定试验，并提供有全部的试验方法：58次测定试剂盒(cat. no. K-LMALR)瓶1: 双甘氨肽缓冲液 (100 mL, 100 mM, pH10.0) +L-谷氨酸(100 mM)+叠氮化钠(0.02 % w/v)稳定性> 2年，4°C保存。
瓶2: 药片（60粒）-含有心肌黄酶, GOT, INT, FAD和NAD+，使用前要先恢复至室温在打开稳定性> 2年，-20°C;干燥保存。
瓶3: L-苹果酸脱氢酶(1.3 mL, 15,000 U/mL)稳定性> 2年，4°C保存。
瓶4: L-苹果酸质控标准液(5 mL, 0.375 mg/mL)稳定性> 2年，4°C保存。
瓶5: 药片（65粒）-含有PVPP稳定性> 5年，室温保存。
试剂制备:1. 备用试剂盒中的瓶1溶液随时使用。
每个试验用量1.5 mL，也可以同等量的蒸馏水稀释，然后每个试验用3 mL。
2. 备用试剂盒中的瓶2随时使用。
保存于-20°C下稳定性> 2年。
3. 准备瓶3中的溶液，第一次打开前，需要充分晃动瓶子，不要让酶吸附在橡皮塞上，然后垂直存放好瓶子。
每次使用前还需要充分混合其中的溶物。
4. 备用试剂盒中的瓶4溶液随时使用。
使用前恢复到室温，每个试验用量20uL5. 准备瓶5溶液随时使用。
注意:当您怀疑分光光度计的准确性或怀疑样品中的物质抑制了试验，再使用L-苹果酸标准质控溶液进行测定，通过提供的公式计算L-苹果酸的浓度。
实验需要的设备:1. 检测仪中提供有特定的测试用试管(平底; 16 x 100 mm)，同时我们也提供提取用试管(cat. no. G-MQTB25)2. 10 mL聚丙烯试管3. 微量移液器(20 uL).4. 连续分配器5. 玻璃刻度移液管及吸球6. MegaQuant TM测定仪7. 定时钟注意:1.此方法是专门用于测定经过苹果乳酸发酵的葡萄酒，如果葡萄酒中的L-苹果酸浓度> 0.75 g /L，需要对样品进行稀释。
2.稀释葡萄酒或葡萄汁必须使用纯净水（蒸馏水或高质量的水），如果使用饮用水，首先需要用D-果糖标准品验证是否适合使用。
3.测试用试管使用前必须清洗干净并烘干。
操作步骤:去除酚醛树脂:(对于红酒通常需要进行处理)1.取5 mL红葡萄酒加入到10 mL的聚丙烯试管中2.加入1片PVPP药片（瓶5），拧紧试管盖，充分混合5分钟，用WhatmanNo. 1 (9 cm)滤纸过滤，收集大约1 mL的滤液，滤液的颜色不能深于浅粉色（一般处理法），然而，具有深颜色的葡萄酒每5 mL需要加入2片PVPP，充分挤压收集滤液1 mL。
3.取20uL滤液进行测定A. 测试方法A. (简单法–参照图1)1.取1.5 mL 溶液1( ~ 23°C或更高)和1.5 mL蒸馏水加入到测试管中，或取3.0 mL用等体积蒸馏水稀释的溶液1（参照试剂配置方法第1点）。
2.用提供的镊子夹取1片药片（瓶2），充分混合1-2分钟至完全溶解。
3.加入20uL葡萄酒样品[经PVPP处理的(未稀释的红/白葡萄酒), 未经PVPP处理的(未稀释的白葡萄酒)或经稀释的葡萄酒或葡萄汁]，充分振荡混合。
4.大约1分钟后，将试管插入到MegaQuant TM测定仪，按下开关直到屏幕上显示‘---’（大约2秒钟）。
5.当屏幕上出现“0.00”松开开关（表示A1）6.取下试管，加入20uL瓶3溶液（L-苹果酸脱氢酶），充分混匀确保全部全部溶解，同时记录时间。
7.再次将试管插入MegaQuant TM测定仪，5分钟后按下开关直到屏幕上显示‘1 second’,记录下数值A2。
8.为了确保试剂完全反应完全，在5分钟每间隔1分钟读取一下数值，直到每间隔1分钟数值不再变化。
（参考图1和图2）注意:1.如果数值A2 > 1.00，10倍以上稀释样品，并再次测定，如果数值A2< 0.10，样品不要进行过分稀释（将100倍稀释改为10倍稀释）。
2.由于INT对光有敏感性（显色剂在药片中），长时间的反应将导致溶液颜色加深，因此必须按照推荐的操作方法进行测定。
3.在进行试验前，瓶1提前从冰箱中取出，并恢复到室温，如果温度<23°C，反应过程将很快结束。
4.添加药片到1.5 mL溶液1和1.52 mL蒸馏水中，确保药片全部溶解后测定的 0 吸光度值作为空白对照，然后加入20uL 的L-苹果酸脱氢酶（瓶3），5分钟后测定增加的吸光度值(A2)，微小的吸光度变化(A2)是没有意义的（如由0.00到0.01）。
计算:ΔA L-苹果酸 = 增加的吸光度值 (A2)按照常规ΔA L-苹果酸的数值至少要在0.10个吸光单位，才能获得满意的试验结果。
L-苹果酸的含量可以依照下列公式计算（参照图3中的标准曲线）:未经PVPP处理过的样品中的L-苹果酸浓度20uL未经稀释的样品c = 0.771 x ΔA L-苹果酸[g/L]20uL经稀释的样品c = 0.771 x 稀释系数 x ΔA L-苹果酸[g/L]经PVPP处理过的样品中的L-苹果酸浓度20uL未经稀释的样品c = 0.771 x ΔA L-苹果酸 x 102/100 [g/L]= 0.786 x ΔA L-苹果酸[g/L]20uL经稀释的样品c = 0.786 x 稀释系数 x ΔA L-苹果酸[g/L]注释:102/100 = 经PVPP处理的葡萄酒的容差图 1. 用分光光度仪测定(25°C,1 cm管径)的MegaQuant TM L-苹果酸随时间的变化。
注意: 用此方法测定的L-苹果酸浓度比图3中测定的浓度要低，是由于此方法中使用的测试管管径为1 cm，而MegaQuant TM测试管大约为1.3 cm.测试方法 B (对“缓慢反应”的处理)1.取1.5 mL 溶液1( ~ 23°C或更高)和1.5 mL蒸馏水加入到测试管中，或取3.0 mL用等体积蒸馏水稀释的溶液1（参照试剂配置方法第1点）。
2.用提供的镊子夹取1片药片（瓶2），充分混合1-2分钟至完全溶解。
3.加入20uL葡萄酒样品经PVPP处理的红葡萄酒，充分振荡混合。
4.大约1分钟后，将试管插入到MegaQuant TM测定仪，按下开关直到屏幕上显示‘---’（大约2秒钟）。
5.当屏幕上出现“0.00”松开开关（表示A0），同时记录时间。
6.取下试管5分钟，再次插入试管按下开关直到屏幕上显示‘1second’，插入试管前不要按压按钮，否则将导致测定仪读取错误 ,记录下数值A1（经过5分钟由于存在缓慢反应将导致颜色增深）。
7.取下试管，立即加入20uL瓶3溶液（L-苹果酸脱氢酶），充分混匀确保全部全部溶解，同时记录时间。
8.再次将试管插入MegaQuant TM测定仪，5分钟后按下开关直到屏幕上显示吸光度,记录下数值A2。
9.为了确保试剂完全反应完全，在5分钟每间隔1分钟读取一下数值，直到每间隔1分钟数值变化不超过0.01个吸光单位。