肠道干细胞分离方法
肠道干细胞分离方法
肠道干细胞分离方法肠道干细胞是指存在于肠道上皮层基底膜下的一类具有自我更新与多向分化能力的干细胞。
研究肠道干细胞对于了解肠道组织发育、修复和肿瘤发生具有重要的意义。
在肠道干细胞研究领域，分离肠道干细胞是一项关键的技术，本文将介绍几种常用的肠道干细胞分离方法。
1.组织消化法：该方法是通过消化肠道组织来分离肠道干细胞。
首先，将小鼠或人体肠道组织进行分离，并去除粘液和腺体组织。
然后，将组织切片并加入消化酶，比如胰蛋白酶和DNA酶等，将组织分解成单个细胞。
最后，通过离心将消化后的细胞分离成上清液和沉淀，上清液中含有肠道干细胞。
2.磁珠分离法：该方法是利用特定的磁珠和抗体对肠道干细胞进行分离。
首先，将肠道组织分离并加入酶，消化组织为单个细胞。
然后，在单个细胞中加入特定的抗体-磁珠复合物，抗体能够结合肠道干细胞特定的表面标志物，如Lgr5、接着，将细胞溶液通过磁场，磁珠结合的肠道干细胞会被吸附在磁力架上。
最后，通过移除磁力架，可以将肠道干细胞从磁珠中分离出来。
3.流式细胞术：该方法是通过细胞在流式细胞术仪中的特定性质进行分离。
首先，将肠道组织消化为单个细胞。
然后，使用特定的抗体标记肠道干细胞的表面标志物，如CD44、CD24和Epcam。
接着，将单个细胞溶液注入流式细胞术仪中，通过激光激发标记抗体，识别并分离出标记阳性的肠道干细胞。
4.聚集体培养法：该方法是通过培养肠道组织形成三维聚集体，并从中分离出肠道干细胞。
首先，将肠道组织分离并切割成小块，然后进行体外培养。
在培养条件下，肠道干细胞会自发地形成三维聚集体，称为小肠体外培养聚集体（intestinal organoids）。
最后，通过物理或酶解去除上清液中的肠道干细胞。
这些是目前常用的几种肠道干细胞分离方法。
每种方法都有其优缺点，研究人员可以根据具体实验需求选择适合的方法。
肠道干细胞的分离方法的进一步改进将有助于更好地研究肠道生物学和相关疾病的治疗。
小鼠小肠类器官炎症模型的构建
专题研究·类器官与器官芯片小鼠小肠类器官炎症模型的构建陈浩1，2，李蕊1，易菲1，周丽3，陈嘉琪4，朱璠4，管城艳4，吴娜4，5△摘要：目的建立体外小肠类器官培养体系，探讨脂多糖（LPS）对小肠类器官生长和炎性因子分泌的影响。
方法体外无菌分离并收集C57BL/6小鼠小肠隐窝细胞团，使用类器官基质胶进行包埋，并在完全培养基的支撑下，培养形成具有小肠上皮样结构的立体多叶结构的小肠类器官。
小肠类器官培养5～7d或类器官中央区域变黑时传代，传代后3d将小肠类器官随机分为不同质量浓度LPS组（0、150、175、200、225、250、275、300mg/L）。
在LPS诱导24h和48h后观察小肠类器官生长和形态特征变化；用CCK-8法检测不同时间和质量浓度LPS对小肠类器官诱导炎症后增殖活力的影响；采用酶联免疫吸附试验检测4种不同质量浓度LPS（0、175、200、225mg/L）在不同时间对类器官培养上清液中粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）、白细胞介素（IL）-1α、IL-6、IL-10水平的影响。
结果初步构建了小鼠小肠类器官培养体系。
不同时间和质量浓度LPS作用小肠类器官诱导炎症后，通过形态学观察到小肠类器官会有不同程度的膨胀和内腔凋亡现象的发生，受损的肠上皮中隐窝或肠干细胞的增殖分化和出芽数量也受到不同程度的抑制。
小肠类器官在175~225mg/L的LPS诱导24h和48h后，其增殖活力呈现不同程度的降低（P＜0.05），但细胞活力仍大于50%。
200mg/L和225mg/L的LPS诱导24h和48h后，IL-1α、IL-6和GM-CSF水平部分升高（P＜0.05）；200mg/L的LPS诱导24h和48h后，IL-10水平降低（P＜0.05）。
结论本研究初步构建了不同质量浓度和时间的LPS诱导小肠类器官体外肠道炎症损伤模型，为今后肠道疾病的机制研究和有效药物的筛选提供了更为可靠的研究平台。
人原代肥大细胞体外诱导和组织分离方法的建立
人原代肥大细胞体外诱导和组织分离方法的建立翟荣荣;蒋金凤;张济;丁永斌;王建华;魏继福【摘要】目的:建立获取和培养人原代肥大细胞的方法,为探讨肥大细胞的免疫调节作用及其机制奠定基础.方法:用重组人源干细胞因子、IL-6和IL-3刺激CD34+造血干细胞使之分化成肥大细胞；Percoll密度梯度离心结合免疫磁珠分选法,分离肠道黏膜肥大细胞.应用免疫荧光染色技术分析所获得的原代肥大细胞表面分子CD117和FcεRⅠ,甲苯胺蓝染色或间接免疫荧光染色检测胞内类胰蛋白酶含量.结果:黏膜肥大细胞及CD34+造血干细胞刺激分化而来的肥大细胞均表达CD117和FcεRⅠ,胞内均含有类胰蛋白酶.结论:这两种方法均可以有效地获得大量纯化的原代肥大细胞,且各有优势,所得细胞适用于肥大细胞在机体免疫调节和病原防御等生理功能的后续研究.%Objective:To establish the technique for generation or isolation of human primary mast cells,and for further studying their roles in regulating host immunity and elucidatingimmunopathogenesis.Methods:CD34 + hemopoietic stem cells were cultured in presence of stem cell factor,IL-6,and IL-3 to generate primary mast cells.Mast cells allocated in human intestinal tissues were isolated through digestion,density gradient centrifugation and purification with specific antibodies-coated magnetic beads.Cell phenotype was monitored by immuostaining of surface markers of CD117 and FcεRⅠ and intracellular tryptase,or cells were identified with Toluidine blue staining.Results:Both of the CD34 + cell-derived and intestinal mast cells expressed CD117 and FcεRⅠ,the specific markers for mast cells,and contained intracellular tryptase.Conclusion:Both methods could providesufficient and purified primary mast cells for further study in regulating host immune response and defence against pathogenic microorganism.【期刊名称】《江苏大学学报（医学版）》【年(卷),期】2013(023)003【总页数】5页(P224-228)【关键词】肥大细胞;肠道黏膜;类胰蛋白酶;诱导【作者】翟荣荣;蒋金凤;张济;丁永斌;王建华;魏继福【作者单位】南京医科大学第一附属医院药学部研究室,江苏南京210029;中国科学院上海巴斯德研究所病毒免疫学实验室,上海200025;中国科学院上海巴斯德研究所病毒免疫学实验室,上海200025;南京医科大学第一附属医院普外科,江苏南京210029;南京医科大学第一附属医院普外科,江苏南京210029;中国科学院上海巴斯德研究所病毒免疫学实验室,上海200025;南京医科大学第一附属医院药学部研究室,江苏南京210029【正文语种】中文【中图分类】R329.2肥大细胞是定位于组织的一类胞质内富含嗜碱性颗粒的细胞［1］，与哮喘、变态反应等疾病的发生密切相关。
2024年生物高考真题分类汇编—专题07 细胞的分化、衰老、凋亡及癌变
专题07 细胞的分化、衰老、凋亡及癌变考点1 细胞的凋亡1.（2024.甘肃. 4）某研究团队发现，小鼠在禁食一定时间后，细胞自噬相关蛋白被募集到脂质小滴上形成自噬体，随后与溶酶体融合形成自噬溶酶体，最终脂质小滴在溶酶体内被降解。
关于细胞自噬，下列叙述错误的是（）A. 饥饿状态下自噬参与了细胞内的脂质代谢，使细胞获得所需的物质和能量B. 当细胞长时间处在饥饿状态时，过度活跃的细胞自噬可能会引起细胞凋亡C. 溶酶体内合成的多种水解酶参与了细胞自噬过程D. 细胞自噬是细胞受环境因素刺激后的应激性反应【答案】C【解析】【分析】细胞自噬是指在一定条件下，细胞会将受损或功能退化的细胞结构等，通过溶酶体降解后再利用，这就是细胞自噬。
处于营养缺乏条件下的细胞，通过细胞自噬可以获得维持生存所需的物质和能量；在细胞受到损伤、微生物入侵或细胞衰老时，通过细胞自噬，可以清除受损或衰老的细胞器，以及感染的微生物和毒素，从而维持细胞内部环境的稳定。
有些激烈的细胞自噬，可能诱导细胞凋亡。
【详解】A、由题干信息可知，小鼠在禁食一定时间后，细胞自噬相关蛋白被募集到脂质小滴上形成自噬体，随后与溶酶体融合形成自噬溶酶体，最终脂质小滴在溶酶体内被降解，所以在饥饿状态下自噬参与了细胞内的脂质代谢，使细胞获得所需的物质和能量，来支持基本的生命活动，A正确；B、细胞长时间处在饥饿状态时，细胞可能无法获得足够的能量和营养素，细胞自噬会过度活跃，导致细胞功能紊乱，可能会引起细胞凋亡，B正确；C、溶酶体内水解酶的化学本质是蛋白质，其合成场所是核糖体，在溶酶体内发挥作用，参与了细胞自噬过程，C错误；D、细胞自噬是细胞感应外部环境刺激后表现出的应激性与适应性行为，来支持基本的生命活动，从而维持细胞内部环境的稳定，D正确。
故选C。
2.（2024.吉林. 2）手术切除大鼠部分肝脏后，残留肝细胞可重新进入细胞周期进行增殖；肝脏中的卵圆细胞发生分化也可形成新的肝细胞，使肝脏恢复到原来体积。
干细胞移植中的消化系统并发症问题解答
干细胞移植中的消化系统并发症问题解答干细胞移植作为一种新兴的治疗方法，在医学领域引起了广泛的关注。
然而，与任何治疗方法一样，干细胞移植也存在着一些潜在的风险和并发症。
在干细胞移植过程中，患者的消化系统可能会面临一些问题。
本文将针对干细胞移植中的消化系统并发症问题进行解答，帮助读者更好地了解这一治疗方法。
首先，我们需要知道，干细胞移植是一种通过将干细胞注入患者体内来修复和替代受损细胞的治疗方法。
消化系统是人体重要的器官系统之一，参与食物的消化、吸收和排泄。
因此，在干细胞移植过程中，与消化系统相关的并发症是不能忽视的。
1. 恶心和呕吐一些患者在干细胞移植后可能出现恶心和呕吐的症状。
这主要是由于干细胞移植过程中使用的化疗药物或放疗导致的副作用。
这些药物会破坏患者的正常细胞，包括胃黏膜细胞，从而引发恶心和呕吐。
医生通常会在移植前给予患者相应的预防性治疗，例如抗恶心药物，以减轻这些不适症状。
2. 消化不良干细胞移植后，一些患者可能会出现消化不良的问题，如胃灼热、胃胀气和腹泻等。
造成这些问题的原因可能是干细胞移植过程中的放疗损伤了消化道黏膜细胞，或者由于抗排异反应药物的副作用所致。
提供适当的营养支持和调整饮食习惯，如小而频繁的饮食，避免辛辣食物和油腻食物等，可以帮助缓解这些症状。
3. 肠道感染干细胞移植后，患者的免疫系统可能暂时受到抑制，使他们容易感染细菌、病毒和真菌等病原体。
肠道感染是一种常见的并发症，会导致腹泻、腹痛和发热等症状。
预防肠道感染的关键是维持适当的个人卫生，定期进行手部卫生，避免接触可能的传染源，并根据医生的建议接受相应的抗感染药物治疗。
4. 脓毒血症脓毒血症是一种严重的细菌感染，可能在干细胞移植后发生。
这种情况通常是由于干细胞移植过程中使用非特异性抗生素导致的，因为这些抗生素可能会破坏肠道菌群平衡，使致病菌有机会感染全身。
预防和控制脓毒血症的策略包括使用适当的抗生素，定期监测血液及体温，及时处理感染的灶点。
肠道干细胞与肠道损伤修复的研究进展
肠道干细胞与肠道损伤修复的研究进展耿艳霞【摘要】The intestinal mucosa epithelial cells are constantly self-renewing for a life time, this is realized by the stem cells through their continuous proliferation, differentiation and ultimate replacement of the lost epithelial cells. This dynamic balance plays an important role in normal intestine integrity maintenance, as well as intestinal restoration after injury. Right now, there is a lack of effective treatment after mucosal damage. In the natural wound repair process, intestinal stem cells (ISC) divide faster, and promote the restoration procedure. Understanding the biological characteristics of ISC such as its location, molecular marker, and mechanism of proliferation and differentiation, is meaningful in promoting the intestine structure and function regaining after injury.%肠黏膜上皮细胞终身不断自我更新,这一过程须凭借肠道隐窝干细胞(intestinal stem cell,ISC)持续增殖、分化,取代终末分化细胞来完成.这种动态平衡在正常肠道结构和功能的维持以及肠道损伤后的修复过程中起着重要作用.目前肠道黏膜损伤尚缺乏有效的治疗手段,ISC在肠道损伤后分裂加快,促进了损伤修复.了解ISC的相关生物学特性,例如定位、标记、分裂分化机制等对于促进肠道损伤后结构与功能的完全修复有着重大意义.【期刊名称】《医学研究生学报》【年(卷),期】2013(026)002【总页数】5页(P181-185)【关键词】肠道干细胞;定位;分裂;分化;损伤修复;信号通路【作者】耿艳霞【作者单位】210002,南京,南京大学医学院临床学院(南京军区南京总医院)解放军普通外科研究所【正文语种】中文【中图分类】R730.530 引言肠道上皮是成年哺乳动物机体代谢最活跃的场所，也是自我更新最快的组织之一。
肠道L细胞的研究进展
（４）瘦素：研究显示，瘦素可显著刺激胎大鼠小 肠细胞、小鼠ＧＬＵＴａｇ及人ＮＣＩ—Ｈ７１６细胞系分泌 ＧＬＰ－１旧３｜。啮齿类动物和人的肠道Ｌ细胞也表达瘦 素受体，注射瘦素（１ ｍｇ／ｋｇ）可显著刺激大鼠和ｏｂ／ ｏｂ小鼠分泌ＧＬＰ－１旧３｜。高脂喂养Ｃ５７ＢＬ／６小鼠８ 周，出现肥胖、糖耐量异常、高胰岛素血症和高瘦素 血症，ＧＬＰ－１分泌的基础量和葡萄糖刺激后的分泌 量均明显减少，提示肥胖患者中瘦素抵抗可能是导
胰酶肽（ＣＣＫ）及肠促胰液素等∽１。目前，ＳＴＣ一１细
亡。此外，ＧＬＰ．１既可抑制胃泌素诱导的酸分泌又 可抑制食物诱导的胃排空和胰腺分泌。ＧＬＰ一１还有 调节食欲和食物吸收的功能，以控制体重。 ２．ＧＬＰ．２、ＰＹＹ、胃泌酸调节素：Ｌ细胞还可分泌
ＧＬＰ－２、ＰＹＹ、胃泌酸调节素等重要的肽类激素。
胞系已被用作研究这些激素分泌的模型。 （３）ＮＣＩ—Ｈ７１６：是一种来源于人的ＧＬＰ．１分泌 细胞系，来源于低分化的盲肠腺癌，具有内分泌特 性，包括嗜铬粒蛋白和胰高血糖素原的表达。它还 表达多种神经激素（包括胃泌素、５一羟色胺、生长抑 素）的受体。ＮＣＩ．Ｈ７１６在脂肪酸、糖调节蛋白 （ＧＲＰ）、胆碱能激动剂、ＰＫＡ和ＰＫＣ活化剂的刺激 下分泌ＧＬＰ．１。但不同的是，在ＮＣＩ—Ｈ７１６中，刺激 ＧＬＰ—１分泌的活化剂不能调节胰高血糖素原基因的 表达。如ＰＫＡ能上调动物模型中胰高血糖素原基 因的表达，却不能改变其在ＮＣＩ．Ｈ７１６中的水平归Ｊ。 这种胰高血糖素原基因表达调控的异常使得ＮＣＩ—
局部的Ｌ细胞分泌ＧＬＰ．１ｕ ５ｌ。此外，回肠切除或直
肠与结肠切除术的患者ＧＬＰ一１的早期分泌仍然保
留Ｍ Ｊ，提示局部肠腔内的营养物质感受通路仍是
离体灌注实验还显示，多种神经介质参与ＧＬＰ一１分 泌调节，包括速激肽、促生长激素神经肽、ＶＩＰ、降钙 素基因相关肽、神经肽ＮＣ等ⅢＪ。
单细胞测序技术
单细胞测序：单细胞测序是指DNA研究中涉及测序单细胞微生物相对简单的基因组，更大更复杂的人类细胞基因组。
单细胞测序技术：单细胞测序技术自2009年问世，2013年被Nature Methods 评为年度技术以来，越来越多地被应用在科研领域。
2015年以来，10X Genomics、Drop-seq、Micro-well、Split-seq等技术的出现，彻底降低了单细胞测序的成本门槛。
自此，单细胞测序技术被广泛应用于基础科研和临床研究。
单细胞在许多领域都占有一席之地，对于癌症早期的诊断、追踪以及个体化治疗具有重要意义。
1为什么要做单细胞测序？初次听说单细胞测序技术，单细胞测序又是什么噱头？如果单细胞测序就能测一个细胞或几个细胞的话，这有什么意义？特别是对异质性高的肿瘤组织来讲，测一个细胞能代表什么？无论是蠕虫，蓝鲸，还是人类，自然界所有的多细胞生命都是从单个细胞发育而来开始。
这样一个单细胞，鬼斧神工地构建出有机生命体所需的各种组织、器官、系统。
每个新细胞在正确的时间，在正确的地方分裂、分化，并与相邻细胞协调精准发挥功能。
多细胞生命的发育过程，是自然界中最引人注目的壮举之一。
尽管经过数十年的研究，生物学家仍然无法完全理解这一过程。
2018年4月26日，Science杂志发表三篇超重磅研究，来自哈佛医学院和哈佛大学的研究人员使用多种技术组合，包括对发育中斑马鱼和青蛙胚胎数千个单细胞的基因测序，以精确的方式跟踪和描绘了组织和整个机体从单细胞发育的完整历程。
哈佛大学分子和细胞生物学教授Alexander Schier表示，“这几乎就像通过几颗星星看到了整个宇宙。
”使用单细胞测序技术，研究团队在胚胎发育的最初24小时内追踪单个细胞的命运，揭示出单个细胞基因开启或关闭的综合景观，以及胚胎细胞何时何地转变为新的细胞状态和类型。
这些发现就好比是勾勒出胚胎发育过程中产生不同细胞类型的遗传“配方”目录，为发育生物学的深入研究和疾病的认识，提供了前所未有的资源。
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肠道干细胞分离方法
肠道干细胞是肠道上皮细胞的一种特殊类型，具有自我更新和分化为不同细胞类型的能力。
分离肠道干细胞对于研究肠道发育、维护和再生等过程非常重要。
目前，常用的肠道干细胞分离方法主要包括以下几种：
1. 贴壁法：将肠道组织切碎后，将细胞悬浮液加入到含有适当营养物质的培养皿中，让细胞附着在培养皿底部，再通过培养皿内的培养基和适当激素的刺激，筛选出具有干细胞特征的细胞。
2. 磁珠分选法：将肠道组织切碎后，使用特定的干细胞表面标记，将干细胞与其他细胞分离，并使用磁珠分选仪将标记的细胞分离出来。
3. 免疫细胞磁珠分选法：将肠道组织切碎后，使用针对干细胞特异表面标记的抗体，将干细胞与其他细胞分离，并使用磁珠分选仪将标记的细胞分离出来。
4. 细胞流式分选法：将肠道组织分散成细胞悬液后，使用特定的干细胞表面标记，将干细胞与其他细胞分离，并利用流式细胞术将标记的细胞分离出来。
以上是常用的肠道干细胞分离方法，每种方法都有其优缺点，研究者可以根据自己的需要选择适合的方法。
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