间接elisa实验流程
ELISA实验步骤一览表
同左
包被抗原：
同左
2
洗涤：移去包被液，凹孔用洗涤缓冲液（含0.05%吐温-20）洗3次，每次5分钟
同左
同左
同左
3
加被检标本：每凹孔加入用含有0.05%吐温-20的稀释缓冲液稀释的被检血清各0.2ml，37℃，作用1～2小时
每凹孔加入0.2ml用稀释缓冲液稀释的含抗原的被检标本，37℃作用1～2小时。
同左
同左
同左
8
加终止剂：每凹孔加2M H2SO4或2M柠檬酸0.05ml。
同左
同左
同左
9
观察记录结果：目测或用酶标比色计测定（O.P.D用492nm）O.D值。
同左
用酶标比色计测定a、b两组O.D值，并求出a、b、O.D值的差数。
同左
分2组,a组加酶标记抗原和被检抗原混合液0.2ml，另一组只加酶标记抗原液0.2ml，37℃作用1～2小时。（混合液可作成不同稀释度）。
a组加参考抗体和被检抗原混合液0.2ml，另一组加参考抗体与等量稀释剂0.2ml，37℃作用1～2小时。
4
洗涤：重复2
同左
洗涤：同左
洗涤
5
加入酶结合物：每凹孔加入稀释缓冲液稀释的酶结合物0.2ml。37℃作用1～2小时
ELISA实验步骤一览表
间接法（测抗体）
双抗体夹心法（测抗原）
竞争法（测抗原）
抑制性测定法
1
包被抗原：用包被缓冲液稀释抗原至最适浓度（5～20μg/ml）各0.3ml加于微反应板每个凹孔中,4℃过夜或37℃水浴2～3小时,贮存冰箱
包被抗体：用包被缓冲液稀释特异性抗体球蛋白至最适浓度（1～10μg /ml），每凹孔加0.3ml，4℃过夜，或37℃水浴3小时，贮存冰箱
间接法酶联免疫吸附检测操作流程
间接法酶联免疫吸附检测操作流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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间接elisa原理
间接elisa原理一、引言酶联免疫吸附法（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，简称ELISA）是一种广泛应用于生物学、医学等领域的分析方法。
其中，间接ELISA是其中一种常用的方法。
它通过特定的抗体与抗原相互作用，利用酶做标记来检测样品中是否存在目标物质。
本文将详细介绍间接ELISA的原理。
二、实验步骤1.涂布：将待测物质（如蛋白质）溶液加入到微孔板中，使其在孔壁上均匀地吸附。
2.阻断：在孔壁上添加非特异性蛋白（如牛血清白蛋白），以避免后续步骤中非特异性结合。
3.加入第一层抗体：加入与待测物质相对应的第一层抗体，并与待测物质结合形成复合物。
4.加入第二层抗体：加入与第一层抗体相对应的酶标记二抗，并与第一层抗体结合形成复合物。
5.加入底物：加入底物，使酶催化反应产生可检测的信号。
6.测定：利用光密度计等设备测定底物反应产生的吸光度，从而判断待测物质是否存在。
三、原理解析1.抗原-抗体反应间接ELISA是基于抗原-抗体反应的原理。
在实验中，待测物质（如蛋白质）被吸附到微孔板上，并与第一层特异性抗体结合形成复合物。
此时，如果样品中存在与待测物质相对应的第二层抗体，则第二层抗体会与复合物结合形成更大的复合物。
这种特异性的结合反应是ELISA检测方法的核心。
2.酶标记在间接ELISA中，酶标记是检测结果可视化的关键。
在实验中，第二层抗体被标记上酶（如辣根过氧化物酶），当底物被加入时，酶催化底物产生可检测的信号（如荧光、发光、颜色变化等）。
这种信号可以通过吸光度计等仪器来检测和量化。
3.非特异性结合在实验中，非特异性结合是需要避免的。
为了避免非特异性结合，实验中会加入一定量的阻断剂（如牛血清白蛋白），以防止非特异性蛋白质与抗体结合。
4.优缺点间接ELISA具有以下优点：（1）灵敏度高：ELISA可以检测极低浓度的物质，通常可以检测到纳克/毫升级别的物质。
（2）特异性强：ELISA可以区分不同种类的物质，因为它是基于抗原-抗体反应的原理。
间接法测抗体的原理
间接法测抗体的原理
间接法测抗体的原理
间接法测抗体是一种常用的免疫学实验技术，其原理是利用已知抗原与待测样品中的抗体结合，再通过添加标记二抗来检测待测样品中是否存在特定的抗体。
具体步骤如下：
1.将已知的抗原分别涂在固相载体（如ELISA板）上。
2.加入待测样品，使其与涂有抗原的固相载体发生反应。
如果待测样品中存在特定的抗体，则会与抗原结合。
3.洗去未结合的物质，保留结合了特定抗体的复合物。
4.加入标记二抗（如HRP标记的兔抗鼠IgG），该二抗能够与待测样品中特定的抗体结合形成复合物。
5.洗去未结合的标记二抗，在适当条件下加入底物（如TMB），使其发生显色反应。
6.根据显色反应强度可以判断待测样品中是否存在特定的抗体。
优点：
1. 间接法可同时检测多个不同种类、来源和亚型等不同性质的蛋白质分子，具有高灵敏度和高特异性。
2. 二抗标记可用多种方法进行标记，如HRP、酶联荧光等，可根据需要选择不同的标记方法。
3. 间接法操作简单，适用于大规模筛查。
缺点：
1. 间接法需要较长的检测时间。
2. 检测结果受到非特异性因素影响较大，如污染、交叉反应等。
综上所述，间接法测抗体是一种常用的免疫学实验技术，其原理是利用已知抗原与待测样品中的抗体结合，并通过添加标记二抗来检测待测样品中是否存在特定的抗体。
该方法具有高灵敏度和高特异性等优点，但也存在一定的缺点。
酶联免疫吸附试验(ELISA)的程序精选全文完整版
精选全文完整版酶联免疫吸附试验（ELISA）的程序第一节间接ELISA试验一用可溶性抗原的ELISA：1、纯化抗原：用包被液稀释至1—20ug/ml；2、以50—100ul/孔量加入酶标板孔中；3、置4（度）过夜或37（度）吸附3h；4、PBST洗三次；5、每孔200ulPBS/NCS 4（度）过夜封闭或37（度）封闭3h；6、PBST洗5次，每次1min（包被板可—20（度）或许（度）保存备用）7、每孔加50—100ul第一抗体，同时设阳性、阴性对照。
若杂交瘤筛选，每孔加杂交瘤培养上清；8、37（度）孵育2h9、PBST洗5次，每次5min10、每孔加50—100ul酶标第二抗体；若杂交瘤筛选，每孔加HRP 标记的抗小鼠（IgG+IgM）抗体；11、37（度）孵育2h12、PBST洗5次，每次数5分钟；13、每孔加OPD 或TMBS底物100ul14、37（度）避光作用；（OPD为10—20）分钟，TMBS为40分钟）；15以50ul2MH2SO4终止反应，在酶联免疫阅读仪上读取OD值（OPD底物选用490nm滤光片，TMBS底物选用450nm滤:光片）；16结果判定：（1）P/N≥2.1 为阳性(2) P≥N+3SD 为阳性成功范例:NDV单抗检测，粘附素单抗检测，H单抗检测亚类鉴定和鸡白痢检疫等。
二、用全菌抗原的ELISA法（一）GA法1、新鲜培养的细菌用蒸馏水悬浮，光密度法或比浊法调整细菌浓度至1X10（6）个/ml。
注意：沙门氏菌等人畜共患病原体，使用前必须灭活或采用市售的灭活诊断菌液；2、酶标板中加200ul/孔，5%戊二醛（GA）溶液（0.1M NaHCO4 95ml+25%DNY戊二醛溶液5ml）;37(度);2小时3、蒸馏水洗5次;4、加细菌悬浮液,50ul/孔;5、37(度)温箱内过液,干燥吸附(20—24h)6、加PBS/NCS 220ul/孔37（度）封闭3小时或4（度）过夜封闭；7、PBST洗5次（—20（度）或4（度））存放备用；8、以下步骤同一。
(完整版)间接ELISA法检测抗体
间接ELISA法检测血清抗体1. 仪器耗材（1）仪器：洗板机，酶标仪，恒温箱（2）耗材：96孔酶标板（NUNC或海门），加样槽2. 试剂及配制（1）包被缓冲液：A. PBS (500ml，pH=7.2±0.1)：NaCl 4.25g，NaH2PO4·2H2O 0.178g，Na2HPO4·12H2O 1.386g，溶解定容至500ml，测量pH在7.1-7.3（若超出此范围则不能使用）。
常温可保存一周。
B. 1×碳酸盐缓冲液（100ml，pH=9.6）：Na2CO3 0.2756g，NaHCO3 0.6216g，溶解定容至100ml水，测量pH在9.5-9.7之间（若超出此范围则不能使用）。
4℃可保存一个月。
（2）洗液：0.5%PBS’T（1L）：每1L PBS（pH=7.2±0.1）加入Tween-20 5ml，充分混匀。
（3）封闭液：A. 2.5%drymilk/PBS’T（100ml）：将2.5g drymilk溶解于100ml PBS’T中，短期保存于4℃，长期保存于-20℃。
B. 10%FBS/PBS’T（100ml）：10ml FBS于90ml PBS’T混合，短期保存与4℃。
（4）稀释缓冲液：A. 2.5%drymilk/PBS’T：配方同上。
B. 10%FBS/PBS’T：配方同上。
C. 2.5% dry milk EDTA/EGTA PBS’T：C-1：EDTA/EGTA PBS’T：1.117g EDTA加入至100ml PBS’T中，搅拌至溶解（大约15min）；1.141g EGTA加入至100ml PBS’T中，搅拌（大约15min），待部分溶解后，用10N 的NaOH调节pH至7.0；上述两种溶液以1：1的比例混合，测量其pH值在6.3±0.5之间，在上述溶液中按照2.5%的比例加入脱脂奶粉。
D. 10%FBS EDTA/EGTA PBS’T：D-1：EDTA/EGTA PBS’T：配方同上，在上述溶液中按照10%的比例加入FBS。
间接法Elisa
间接法ELISA SOP一、包被1．抗原包被量为20µg/板。
2．例如：抗原浓度为0.8mg/ml。
3．取25µl抗原与20mlCBS（抗原包被液）混匀，100µl/孔。
4．包被完毕后，4℃过夜。
二、封闭1．从4℃冰箱中取出酶标板，甩干包被液，拍板。
2．加封闭液，200µl/孔。
3．37℃孵育2h。
4．甩干，洗板（3次）。
5．用干燥的自封袋4℃保存。
【注】：洗板，将孔内液体甩出，每孔加200µl -300µl洗板液，静置2min，甩出，将板拍在干的纱布上，将孔内液体拍干为佳。
三、一抗1．可洗板一次。
2．阳性对照：1µl阳性血清加入1ml抗原稀释液中，做1：1000稀释（第一孔）。
3．阴性对照：做1：2万稀释。
用1µl阴性血清加入100µl抗原稀释液中，先做1：100稀释。
再从此液取出5µl加入995µl的抗原稀释液中，最终稀释为1：2万。
4．空白对照：只加抗原稀释液。
5．除第一孔和阴性对照孔外，每孔加100µl抗原稀释液。
6．第一孔加100µl（1：1000）的阳性对照。
7．第二孔加100µl（1：1000）的阳性对照，吹打混匀，再从二号孔中吸取100µl加到3号孔中，做倍比稀释，最后两孔为阴性对照或空白对照。
1：10001：20001：40001：80001：160001：32000阴性对照（1：2万）空白对照8．将酶标板37℃孵育1h，洗板3次。
【注】：①通常在第一次做Elisa时，应该做阴性对照的梯度稀释，从中选择最佳的稀释倍数(一般认为吸光值小于0.1的阴性稀释倍数为易)。
②更为严格的操作是，阳性，阴性，空白的对照空均为双复孔或三复孔。
③在稀释一抗，或者二抗的时候，要算好每次的用量。
四、二抗本次检测采用二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG1．用0.01MPBS做1：5000稀释（现用现配）。
间接elisa的原理及应用
间接ELISA的原理及应用1. 什么是间接ELISA间接ELISA全称为酶联免疫吸附法（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay），是一种常用的免疫学检测方法。
它依靠特定抗原和抗体之间的高度专一性反应，通过酶标记抗体或抗原的相互作用来检测目标物质的存在和浓度。
2. 间接ELISA的原理间接ELISA的原理是将待测物与特定抗原偶联到固定在微孔板上的抗原表面上。
然后引入与待测物特异性结合的酶标记抗体，使其与待测物结合。
接下来，通过添加底物，酶标记抗体催化底物的变色反应，从而间接检测出待测物的存在。
间接ELISA的步骤如下：1.固相涂布：将抗原溶液均匀涂布在微孔板上，使其在孔壁上固定。
2.阻断：加入一定浓度的非特异性抗体，使其与未吸附的表面结合，防止非特异性的结合。
3.加入待测物：将待测物标本加入到微孔板中与固相抗原发生特异结合。
4.加入检测抗体：加入配有酶标记的抗体，该抗体有望与待测物结合形成夹心免疫复合物。
5.洗涤：洗涤微孔板以去除未结合的物质。
6.加入底物：加入含有底物的试剂，底物受到酶催化产生变色反应。
7.阅读测量：使用酶标仪对底物反应产生的颜色进行定量检测。
3. 间接ELISA的应用间接ELISA广泛用于医学、生命科学研究、生物制药和农业领域。
以下是间接ELISA在不同领域的应用：3.1 医学领域间接ELISA在医学领域的应用非常广泛，主要用于以下几个方面：•临床诊断：可以用于检测疾病的早期诊断，如艾滋病、肝炎、结核病等。
•药物监测：可以测定药物的浓度，监测药物治疗的疗效和剂量。
•免疫学研究：可用于研究免疫系统的功能和疾病发生机制。
3.2 生命科学研究间接ELISA在生命科学研究中也有广泛的应用，主要用于以下方面：•蛋白质检测：可以用于检测目标蛋白质在细胞或生物体中的表达量。
•抗体研究：可以用于检测抗体在细胞或液体中的浓度，了解免疫应答和抗体产生的情况。
•基因表达：可以用于检测转基因植物或动物中目标基因的表达水平。
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间接elisa实验流程
间接ELISA实验流程
ELISA（酶联免疫吸附实验）是一种常用的免疫学实验方法，用于检测抗体或抗原的存在。
其中，间接ELISA是一种常用的抗体检测方法，其流程如下：
1.涂层：将待检测的抗原溶液加入96孔板中，使其在孔底形成一层涂层。
通常使用1%的牛血清白蛋白（BSA）或羊血清白蛋白（GSA）作为涂层缓冲液，以防止非特异性结合。
2.阻断：将孔中的涂层缓冲液倒掉，加入5%的牛血清或羊血清，使其在孔底形成一层阻断液。
阻断液可以防止非特异性结合，提高检测的灵敏度。
3.加入一抗：将待检测的样品加入孔中，与涂层中的抗原结合。
一般情况下，使用稀释后的血清或纯化的抗体作为一抗。
孵育时间一般为1-2小时。
4.加入二抗：加入与一抗特异性结合的辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗，孵育时间一般为1小时。
二抗可以与一抗结合形成复合物，
从而增强信号。
5.加入底物：加入HRP底物，如TMB（3,3',5,5'-四甲基联苯胺），孵育时间一般为10-30分钟。
HRP底物在酶的作用下会发生颜色变化，从而形成信号。
6.停止反应：加入停止液，如2M的硫酸，停止底物的反应。
停止液可以防止底物的继续反应，从而保证结果的准确性。
7.测量：使用酶标仪测量吸光度值，计算样品中抗体或抗原的浓度。
总结：间接ELISA是一种常用的抗体检测方法，其流程包括涂层、阻断、加入一抗、加入二抗、加入底物、停止反应和测量。
通过这种方法可以检测样品中抗体或抗原的存在，具有灵敏度高、特异性强、操作简便等优点。