微生物实验操作基础——灭菌及无菌操作
微生物的基本操作方法
微生物的基本操作方法
微生物的基本操作方法包括以下几个方面：
1. 无菌操作：在进行微生物实验或培养时，需要保持操作环境的无菌。
操作者应注意洗手、穿戴实验服、戴手套，并在无菌工作台或无菌室内进行操作。
可用酒精灯或紫外线灯消毒操作区域，以杀灭空气中的微生物。
2. 培养基的制备：根据所需的微生物类型选择适当的培养基，并按照配方制备。
培养基通常包括基础培养基、食物源、pH调节剂和琼脂等成分。
制备时需要称取和溶解成分，并用高压蒸汽或高温灭菌来杀灭培养基中的微生物。
3. 培养器具的消毒：使用前要对培养器具进行消毒处理，常用的方法有高压蒸汽灭菌、高温灭菌、紫外线消毒等。
确保培养器具的表面和内部都不带有致病菌。
4. 菌种的接种：将所需的菌种接种到培养基上。
通常使用接种环、接种针或接种环针进行接种。
在接种时要注意无菌操作，以避免外来细菌的污染。
5. 培养条件：对于每一种微生物，根据其生长特性和要求，设置适当的培养条件。
例如，合适的温度、湿度、pH值和氧气浓度等都会影响微生物的生长。
6. 培养观察：在培养过程中，定期观察微生物的生长情况。
可以使用显微镜观察细菌或酵母菌的形态，或者通过目测观察细菌悬浊液的浑浊度和沉淀情况来判
断微生物是否生长良好。
7. 分离纯化：将培养基上生长的微生物单克隆分离纯化，得到纯系菌株。
通常可以使用藻糖水平板或琼脂斜面触点法进行分离，将不同的菌落孤立开来。
8. 培养维持：根据微生物的生长要求，每隔一段时间更换培养基、条件，以保持微生物的生长和繁殖。
同时，也需要妥善保存纯化的菌株，以备后续实验使用。
无菌技术操作流程简写
无菌技术操作流程简写一、介绍无菌技术是一种控制和预防微生物污染的方法。
在医疗、食品、制药等领域广泛应用。
本文将简要介绍无菌技术的操作流程。
二、准备工作在进行任何无菌实验前，必须确保工作区域及工具均处于无菌状态。
准备工作如下：1.清洁工作区：彻底清洁工作台，并用消毒剂擦拭。
2.穿戴无菌操作衣：穿戴无菌手套、衣服、帽子和口罩。
3.消毒操作工具：用高温高压灭菌器对操作工具进行灭菌处理。
三、操作流程1.打开无菌工作台：先进行手消毒，戴上无菌手套，然后打开无菌工作台的超净台面。
2.取出试验物品：将需要的无菌试验物品从包装中取出。
3.开启燃烧盖：打开无菌工作台的燃烧盖，并点燃蜡烛。
4.操作物品处理：将试验物品经过消毒的工具夹子夹取，置于燃烧盖上方进行燃烧处理。
5.灭菌试剂处理：将需要使用的灭菌试剂按照要求使用。
6.移液操作：使用无菌的移液器对液体进行移液操作。
7.杀菌操作：将操作好的液体或物品放入高温高压灭菌器进行杀菌。
8.清理工作区：实验结束后，对工作区进行彻底清洁。
四、注意事项1.不要触摸无菌操作区域以外的物品。
2.所有操作都必须在无菌条件下进行。
3.移液器在使用前需进行严格的清洁和消毒。
4.使用灭菌器时，遵守使用说明。
5.工作完成后，正确处理无菌试验物品及废弃物。
五、总结无菌技术框架下的操作流程可以帮助我们有效控制和预防微生物污染。
在操作过程中，我们需要按照一定的步骤和要求进行，严格遵守消毒和无菌处理的相关操作规范。
这样可以确保实验结果的准确性与可靠性，保护实验人员和被试物品的安全和健康。
希望本文对于理解无菌技术操作流程有所帮助！。
微生物实验
①标 本
③ 孔径 光栏
⑤ 光轴中心调节 螺钉
③ 视场 光栏
N.A聚=(0.6-0.8)N.A物
操作步骤如下: (1）可变光栏的中心对准聚光镜的中心。如果可变光栏的水
平是固定的，则装配时已保证它与聚光镜合轴，不必调整;如果可 变光栏的水平位置可以移动，则应把可变光栏关到最小，使它的 中心孔对准聚光镜下方的透镜中心。
实验一培养基的配置、灭菌与无菌操 作技术
1、明确培养基的配制原则，掌握配制培养基的一般方法 和步骤； 2、掌握玻璃器皿的洗涤和包扎方法，了解玻璃器皿的灭 菌方法和原理； 3、了解几种常用灭菌方法的基本原理及应用范围； 4、掌握高压蒸汽灭菌技术，。
微生物学实验所用的器皿，大多要进行消毒、灭 菌和用来培养微生物，因此对其质量、洗涤和包 装方法均有一定的要求。清洁的玻璃器皿是实验 得到正确结果的先决条件，包扎方法要能保证防 止污染杂菌。空的玻璃器皿一般用干热灭菌，若 用湿热灭菌，则要多用几层报纸包扎。
为什么要将培养基倒置培养？
显微镜概述 微生物的个体微小，必须借助显微镜才能观察到。因
此，显微镜就成为微生物学研究工作者不可缺少的基本工 具。所以，了解显微镜的种类、结构、功能和正确地掌握 不同显微镜的使用方法是很有必要的。
显微镜可分为光学显微镜和电子显微镜两大类。光学 显微镜有普通光学显微镜、相差显微镜、微分干涉差显微 镜、暗视野显微镜、紫外光显微镜、偏光显微镜和荧光显 微镜。下面主要介绍普通光学显微镜。
一、目的要求 1.学习显微镜的结构、功能和使用方法。 2.学习并掌握油镜的原理和使用方法。 3.学习微生物涂片、染色的操作技术；
4.掌握细菌单染色和革兰氏染色的方法；
5.掌握革兰氏染色反应原理、操作步骤和意义。
微生物培养及实验基本操作技术
微生物培养及实验基本操作技术一、培养基配制培养基是指人工配制的、适合于微生物生长繁殖或累积代谢产物所需的各种营养物的混合基质。
配制培养基是进行微生物检验工作的基础,甚至是任何与微生物有关工作的基础。
注意事項–灭菌锅的使用①加水盖过底部铁板—②放入东西—③关门—④調整溫度時間—⑤关紧泄压阀灭菌結束後，等压力降回零時才可打開門進入灭菌锅之物品，蓋子不可關太緊或太鬆拿滅菌後物品請記得帶耐熱手套培养基中的主要成分及其作用：营养物质：N源、C源、无机盐、生长因子、水常用的N源：蛋白胨、牛肉膏、肉浸汁、酵母膏常用的C源：糖、醇类物质（单糖：葡萄糖、果糖、半乳糖、甘露糖双糖：蔗糖、麦芽糖、乳糖；多糖：淀粉、纤维素、菊糖；醇类：甘露醇、卫茅醇、甘油）水：用蒸馏水，不能用自来水凝固剂：琼脂、明胶、血清等抑制剂：1、作用：鉴定细菌、抑制杂菌的生长繁殖，增加待检菌的检出率2、种类：盐类：氯化钠、氯化锂、氰化钾、亚碲酸钾（钠）、亚硒酸钠等染色剂类：煌绿、蔷薇酸、结晶紫、孔雀绿、孟加拉红、玫瑰红胆盐类：猪（牛、羊）胆盐、混合胆盐、三号胆盐、去氧胆酸盐、胆石酸盐抗菌素：青霉素、链霉素、杆菌肽、多粘菌素指示剂1、作用：用于指示鉴别细菌可否利用分解糖醇类物质和含氮化合物，产酸产碱的能力。
2、常用的指示剂：酚红、溴甲酚紫、中性红、中国蓝、甲基红、复红、伊红、美蓝、孔雀绿等。
培养基的类型：●根据培养基的物理状态来区分：1、液体培养基：主要用于增菌培养、鉴别性培养2、固体培养基：用作微生物的分离、鉴定、检验杂菌、计数、保藏、生物测定3、半固体培养基：观察微生物的动力，有时用来保藏菌种4、脱水(商品)培荞基：脱水培养基也称为商品培养基、预制干燥培养基。
●将各种营养成分按比例配制完全,制成脱水的干粉状,装瓶出售;使用时只需按比例加人定量的水溶化、灭菌便可。
●根据培养基的用途来区分：➢增殖培养基选择培养基鉴别培养基1、增殖培养基：在普通培养基中加入一些某种微生物特别喜欢的营养物质，以增加这种微生物的繁殖速度，逐渐淘汰其它微生物，这种培养基称为增殖培养基。
微生物基础知识-灭菌及无菌基本概念
注： 若存在伤口，在化脓部位存在金黄色葡萄球菌几率极高。
二、无菌概述
1、高压蒸汽灭菌
• 利用饱和蒸汽的湿热在一定压力下所释放的潜热杀灭病原 微生物、细菌繁殖体、芽胞和病毒的方法。 • 适用于耐高温、耐高湿的器械和物品的灭菌，如金属器皿 、玻璃器皿、基础培养基等。 • 常用灭菌条件： 134℃、3min 126℃、10min 121℃、15-20min 115℃、25min
为什么在无菌室里无菌环境下无菌操作了，产品还是会染菌 ？？？——相对无菌
3.1操作环境——洁净室
洁净室的常用消毒方式：
• 紫外杀菌: • 空气熏蒸： 乳酸熏蒸: 纯乳酸12ml+等量水/100m3, 30～120 min 甲醛熏蒸：40％甲醛10ml+高锰酸钾5g/1m3, 6～12h • 喷洒及擦拭： 0.1%的新洁尔灭 ：用于擦拭实验台面、墙面、地面、物品表面等。 75%酒精：用于擦拭实验台面、墙面、地面，还用于擦拭实验人员手及工器 皿表面等。
– 最佳杀菌波长：260nm – 有效距离：物品：25～60cm, 空气：＜2m – 照射时间：灯亮 5～7min后开始计算，＞30min – 适用：室内空气、物体表面 – 特点：简单、方便、无损物品 – 类型：悬吊式、移动式、屏幕式
4、电离辐射灭菌法
• 定义：利用ｒ射线或高能电子束进行灭菌，又称 “冷灭菌”，具有广谱杀菌作用。 • 特点：不使物品升温、穿透力强、操作简便、成本 低。 • 适用：忌热物品，如一次性医疗物品、包材、精密 器械、生物制品、药品、食品。
3.3人员无菌操作
避免人为污染方法： • 做好个人防护 • 手部消毒
原则： 发网、帽子——避免头发掉落或头 皮附带物飘落。 工作服——衣服按时清洗，进入无 菌室需更换专用工作服。 鞋子——进入无菌室需更换专用工 作鞋 洗手——按照标准洗手程序认真进 行。 手套——操作是必须戴专用手套。
微生物检验基本技术—无菌技术
（2）灭菌和消毒
消毒：用较温和的物理或化学方法杀死物体上绝大 多数微生物的措施，实际上是部分灭菌。例如，酒 精擦拭。
灭菌：采用强烈的理化因素使任何物体内外所有微 生物永远丧失其生长繁殖能力的措施。
干热灭 菌 湿热灭菌
灭 菌
过滤除菌
紫外线杀菌
化学药剂杀菌
其中高压蒸汽灭菌是微生物学研究和教学中应用最广泛、 效果最好的湿热灭菌方法。
桶内消毒； ⑧操作时禁止再培养物上方移动手臂；
（2）接种 1、接种的一般流程 接种工具灭菌 防止污染标本 接种工具冷却
沾取标本
接种
接种工具灭菌 防止污染环境
2、到平板
3、斜面接种技术
斜面接种是从已生长好的菌种斜面上挑取少量菌种移植至另一新鲜斜面培养基上的接种方法。
用于好气性微生物的接种。
具体操作： ①贴标签：接种前在试管上贴上标签，注明菌名、接种日期、接种人姓名等，贴在距试管口 约2到3厘米处，也可使用记号笔标记。 ②点燃酒精灯。 ③接种： 1）手持试管 将菌种管和待接斜面的两支试管用大姆指和其他四指握在左手中，使中指位于两试管之间部 位。斜面面向操作者，并使它们位于水平位置。
斜面接种示意图
4、液体接种 具体操作： 与斜面接种基本一致，只是在将接种环送入液体培养基时使环在液体与 管壁接触的地方轻轻磨擦，使菌体分散，塞上试管塞再轻轻摇匀。 如果菌种是培养在液体培养基中时，一般用移液管或滴管接种。
5、划线接种 目的：使混合的细菌呈单个分散生长，形成单个菌落，以便获得纯菌、 活菌计数。 方法： ①分区划线法：适用于含菌量较多的标本 ②连沾有菌种的接种环伸入另一支待接斜面试管。从斜面培 养基底部向上作“Z”形来回密集划线，勿划破培养基。有时也可用接 种针仅在斜面培养基的中央拉一条直线作斜面接种，直线接种可观察不 同菌种的生长特点。
灭菌方法与无菌操作
4.影响湿热灭菌的因素
药物与介质的性质 饱和蒸气 湿饱和蒸气 过热蒸气 不饱和蒸气 蒸气的性质 湿热灭菌 灭菌时间 微生物的种类和数量
第三节 灭菌方法与无菌操作
二、物理灭菌法
（三）紫外线灭菌法
紫外线的穿透能力弱，但能穿透清洁的空气和纯净的水，因而广泛
用于空气灭菌与表面灭菌。
F值：是为了比较不同灭菌温度的灭菌效果而
设计的一个指标。在一定灭菌温度T，给定Z
值所产生的灭菌效果，与设计的参比温度To 给定Z值所产生的灭菌效果相同时所相当的时 间，单位为min。 F 0 值：是将被灭菌物品在灭菌过程中不同的 受热温度与时间折算到与热压121℃灭菌时热 效力相当的灭菌时间。
蒸气灭菌
六、无菌检查法（自学）
1.无菌检查法 2.中成药的微生物学检查与活螨检查
二、物理灭菌法
（五）辐射灭菌法
辐射灭菌法的原理 射线可直接破坏细菌
DNA，导致微生物死亡。 辐射灭菌法的特点 不升高灭菌产品的温度，穿透性强，适合于维生素、抗
生素、激素、医疗器械、高分子材料等的灭菌。 辐射灭菌法的缺点 设备费用高，有些药物灭菌后疗效可能降低，对液体药
剂的稳定性也有影响，同时还要注意安全防护问题。
灭菌指示剂
第三节 灭菌方法与无菌操作
四、化学灭菌法
理想的化学灭菌剂应具备下列条件：
①杀菌谱广；
②有效杀菌浓度低；
③作用速度快； ④性质稳定，不易受有机物、酸、碱及其他物理、化学因素的影响；
第三节 灭菌方法与无菌操作
四、化学灭菌法
理想的化学灭菌剂应具备下列条件：
⑤易溶于水，可在低温下使用； ⑥毒性低，对物品无腐蚀性，不易燃烧爆炸； ⑦无色，无味，无臭，灭菌后易于从被灭菌物品上除去，无残留； ⑧价格低廉，来源丰富，便于运输。
微生物检验的基本操作技术
微生物检验的基本操作技术一、无菌操作技术1、定义是指在执行实验过程中，防止一切微生物侵入机体和保持无菌物品及无菌区域不被污染的操作技术和管理方法；无菌操作技术是微生物实验的基本技术，是保证微生物实验准确和顺利完成的重要环节。
2、内容无菌操作技术主要包括两方面：1）创造无菌的培养环境。
包括提供密闭的培养容器、培养容器的灭菌、培养基的灭菌等；2）在操作和培养过程中防止一切其它微生物的侵入的措施。
包括紫外线杀菌、甲醛熏蒸、超净台的消毒与检测、操作工具、器皿灭菌、操作方法等。
3、无菌操作原则1）在执行无菌操作时，必须明确物品的无菌区和非无菌区，接种时必须穿工作服、戴工作帽，应在进无菌室前用肥皂洗手，然后用75%酒精棉球将手擦干净；2）在操作前20〜30分钟要先启动超净台和紫外灯，进行接种所用的吸管、平皿及培养基等必须经消毒灭菌，打开包装未使用完的器皿，不能放置后再使用，金属用具应高压灭菌或用95%酒精点燃烧灼3次后使用。
严禁用手直接拿无菌物品，如瓶塞等，而必须用消毒的钳、镊子等；3）从包装中取出吸管时，吸管尖部不能触及外露部位，使用吸管接种于试管或平皿时，吸管尖不能触及试管或平皿边；4）接种样品、转种细菌必须在酒精灯前操作，接种细菌或样品时，吸管从包装中取出后及打开试管塞都要通过火焰消毒；5）接种环或接种针在接种细菌前应经火焰烧灼全部金属丝，必须时还要烧到环和针与杆的连接处；6）吸管吸取菌液或样品时，应用相应的橡皮头吸取，不得直接用口吸。
倾倒平板应在超净台内操作，并且在开启和加盖瓶塞时需反复用酒精灯烧。
二、无菌操作的环境要求1、无菌室（1）无菌室的结构：更衣间、缓冲间、操作间；(2)无菌室的消毒和防污染■每日(使用前)紫外线照射(0.5~1小时)；•每月用新洁尔灭擦拭地面和墙壁一次的方式进行消毒；•每季度用甲醛、乳酸、过氧乙酸熏蒸(2小时)，特殊情况下可增加熏蒸频次。
(3)无菌室使用要求①无菌室内应保持清洁，工作后用2%-3%煤酚皂溶液消毒，拭擦工作台面，不得存放与实验无关的物品；②无菌室使用前后应将门关紧，打开紫外线，如采用室内悬吊紫外灯消毒时，需30W紫外灯，距离在1.0m处，照射时间不少于30min，使用紫外灯，应注意不得直接在紫外线下操作，以免引起损伤，灯管每隔两周需用酒精棉球轻轻拭擦，除去上面灰尘和油垢，以减少紫外线穿透的影响；③处理和接种食品标本时，进入无菌室操作，不得随意出入，如需要传递物品，可通过小窗传递。
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实验十二微生物实验操作基础——灭菌及无菌操作
一、目的要求
学习灭菌的方式方法，区别几种灭菌方式的相同点和不同点。
掌握实验室无菌操作的操作方法和注意事项，体会无菌操作技术在微生物研究中的重要性。
二、知识介绍
灭菌技术sterilization
为什么要灭菌？（杂菌污染的后果）
1.营养基质或产物被消耗损失；
2.抑制生产菌的生长；
3.抑制产物的生物合成；
4.杂菌繁殖导致培养液性质（如pH）改变，造成生物反应异常。
灭菌原理与方法
灭菌(sterilization）是指利用物理或化学方法，杀灭或去除物料或设备中所有微生物的技术或工艺过程。
灭菌方法有化学物质灭菌、辐射灭菌、过滤介质除菌和热灭菌等。
（一）、化学物质灭菌
通过改变微生物细胞膜的渗透性，或者损伤细胞膜，影响微生物细胞的正常代谢。
不适合于培养基的灭菌，只适合于局部空间或某些器械的消毒。
1.无机酸、碱及盐类
酸碱的杀菌能力主要由其电离度而定，电离出得氢离子或氢氧根离子浓度越高，杀菌力越强。
盐溶液的杀菌力与其浓度成正比。
（腌咸菜可以保藏很长时间而不染菌）
2.重金属盐
杀菌原理是重金属盐使细胞中蛋白质失活。
比如升汞。
服食牛奶、
鸡蛋等高蛋白含量食物可解毒。
3.氧化剂
高锰酸钾
4.有机化合物
乙醇：脱水、使蛋白质变性和沉淀，70~75%最有效。
(二)、辐射灭菌
1.紫外线：诱导胸腺嘧啶二聚体的形成，从而抑制了DNA的复制；空气在紫外线照射下产生臭氧，臭氧也具有一定的杀菌作用。
2.X射线、γ射线：能量极高，被菌体吸收后，菌体内的水和有机物产生强烈的离子化反应，形成OH-、过氧化氢和有机过氧化物，这些过氧化物阻碍微生物的代谢活动而导致菌体迅速死亡。
（三）、过滤介质除菌
工业上利用过滤的方法制备大量的无菌空气，供好氧微生物的深层培养使用。
（四）、干热灭菌
1.火焰灼烧法
2.干热空气灭菌法：140~160℃维持2~3h。
（五）、湿热灭菌
湿热灭菌条件为121℃维持20~30min。
巴氏杀菌（Pasteurization）低温消毒法，主要应用于生产酸奶乳制品。
目前国际上通用的巴氏高温消毒法主要有两种：
1.一种是将牛奶加热到62~65℃，保持30分钟。
采用这一方法，可杀死牛奶中各种生长型致病菌，灭菌效率可达97.3%~99.9%，经消毒后残留的只是部分嗜热菌及耐热性菌以及芽孢等，但这些细菌多数是乳酸菌，乳酸菌不但对人无害反而有益健康。
第二种方法将牛奶加热到75~90℃，保温15~16秒，其杀菌时间更短，工作效率更高。
但杀菌
的基本原则是，能将病原菌杀死即可，温度太高反而会有较多的营养损失。
无菌操作
(一）基本原理
高温对微生物具有致死效应，在微生物接种时，一般在酒精灯旁进行，用火焰直接灼烧接种环，
以达到灭菌的目的。
自然界中各种微生物混杂生活在一起，即使取很少量的样品也是许多微生物共存的群体，要研究某种微生物的特性，首先须使该微生物处于纯培养状态。
从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。
平板分离法常用的有：稀释涂布平板法、稀释混合平板法与平板划线法。
不同的微生物在固体、半固体和液体培养基中能表现出各自特有的培养
特征，这些特征可以作为不同种类微生物的鉴别特征之一。
(二）、讲授重点
1.倒平板：灭菌的培养基冷却到55℃左右，摇匀。
解开麻绳，去掉三角瓶口上盖，右手持装培养基的三角瓶在酒灯旁，瓶口对着火焰。
左手持9cm无菌培养皿并将皿盖在火焰旁打开一条缝，迅速倒入培养基约15ml，加盖后轻轻摇动培养皿，平置于桌面上，使培养基均匀分布于皿底，待冷凝后即为平板。
2.平板稀释法和涂布平板法
三、实验操作步骤
灭菌：高温蒸汽灭菌锅20 MIN，120 ℃
标记：用记号笔对待接试管斜面培养基进行标记，写上待接菌种名称、接种日期、组别。
稀释菌：酒精灯附近进行
混合菌液和熔化冷却至培养50-60 ℃（手触可接受温度）以下的培养基倒平板
培养：平板倒置培养基面在上放37℃培养箱中培养24-36小时。
四、实验过程中的注意事项
1.无菌接种技术
无菌操作需在火焰旁进行，手不可触摸试管口端，以防烫伤；接种时接种环不要碰触试管口边，
防止污染；塞盖不可放在桌面上，应该用右手手缘或右手指间夹住，或玻璃盖放后火焰灭菌盖上。
操作台及不可高温蒸汽灭菌物品使用前和使用后用75%酒精消毒。
2平板分离技术
倒平板时，培养皿边缘不要沾染培养基，摇匀培养基时要轻，以防培养液溅到皿盖或溢出培养皿；平板培养微生物时一定要倒置培养。
七、实验结果
1
．记录液体培养基和固体斜面培养基上，细菌的生长状况。
2
．记录菌种分离培养的结果。
八、实验操作考核点
1
．无菌操作
2
．平板划线方法是否正确。