实验四 酸性磷酸酶Km及Vmax值测定
实验三-碱性磷酸酶米氏常数的测定
2021/6/21
9
五、实验结果与分析
1、标曲数据
管号
1
2
3
4
5
6
酚含量（μg）
吸光度（A）
2、绘制标准曲线
3、反应数据
管号
1
2
3
4
5
6
基质浓度[S] 2.00 4.00 6.00 8.00 16.00 0.00
1/[S]
酚含量
V
1/V
4、作 1/V
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=
Km/
Vmax·（1/[S]）+1/
Vmax
直线，求Km值
数据处理： 各管测出吸光度值A，以酚标准曲线 查出各管释放酚含量（μg），根据 公式V= —酚—含—量 即可计算出各管反 应速度V15min
10
TANKS
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11
[S]
以—1—为纵坐标，
V
此直线与横轴相交的负截距为-
—1—，
Km
由此可以正确求得酶的Km值。
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4
实验以磷酸苯二钠为底物，由碱性磷酸酶催化水解，生成游离酚和磷酸盐。 酚在碱性条件下与4-氨基安替比林作用，经铁氰化钾氧化，生成红色的醌衍生物， 颜色深浅和酚的含量成正比。 根据吸光度可以从酚标准曲线上查知酚含量，从而计算化学反应速度。
Km值：数值上等于酶促反应速度为最大反应 速度一半时所对应的底物浓度
即当V=Vmax/2时，Km=[S]
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3
Lineweaver - Burk根据米氏方程，推导出如下直线方程式：（双倒数方程）
—1— = —K—m— ·—1— + —1—
酸性磷酸酯酶基础实验
实验一 酶促反应与时间的关系——初速度时间范围测定[原理]酸性磷酸酯酶（Acid phosphatase E.C.3.1.3.2）广泛分布于动物和植物中，植物的种子、霉菌、肝脏和人体的前列腺中。
它对生物体核苷酸、磷蛋白和磷脂的代谢，骨的生成与磷酸的利用，都起着重要的作用。
酸性磷酸酯酶是酶动力学研究的好材料。
它能专一性水解磷酸单酯键。
本实验选用绿豆芽作材料，从中提取酸性磷酸酯酶。
以人工合成的对-硝基苯磷酸酯(NPP)作底物，水解产生对-硝基酚和磷酸。
在碱性溶液中，对-硝基酚盐离子于405nm 处光吸收强烈，而底物没有这种特性。
利用产物的这种特性，可以定量地测定产物的生成量，从而求得酶的活力单位。
即测定单位时间内405nm 处光吸收值的变化，来确定酸性磷酸酯酶的活性。
酸性磷酸酯酶一个活力单位是指在酶反应的最适条件下，每分钟生成1μmol 产物所需的酶量。
要进行酶活力测定，首先要确定酶反应时间，酶的反应时间应该在初速度时间范围内选择。
可以通过进程曲线的制作而求出酶的初速度时间范围。
本实验进程曲线是在酶反应的最适条件下采用每隔一定时间测产物生成量的方法，以酶反应时间为横坐标，产物生成量为纵坐标绘制而成。
从进程曲线可知，在曲线起始一段时间内为直线，其斜率代表初速度。
随反应时间延长，曲线趋于平坦，斜率变小，反应速度下降。
要真实反映出酶活力大小，就应在初速度时间内测定。
求出酶反应初速度的时间范围是酶动力学性质的一系列研究中的组成部分和必要前提。
[试剂和器材] 1、试剂：（1）酸性磷酸酯酶原酶液取萌发好的绿豆芽，剪去根的头部，称取豆芽茎20g ，用蒸馏水洗干净，用研钵研碎，加0.2mol/L 乙酸盐缓冲液4mL ，置冰箱6小时以上。
将上述绿豆芽浸液倒入纱布内压榨，榨出液3 000r/min 离心15min ，上清液置透析袋对蒸馏水充分透析，间隔换水10次，透析24h 以上。
将透析后酶液稀释至最终体积与豆芽茎克数相等，以3 000r/min 离心30min ，所得的上清液即为原酶液，置冰箱待用。
碱性磷酸酶km值测定实验报告
碱性磷酸酶km值测定实验报告碱性磷酸酶(Km)值测定实验报告引言：碱性磷酸酶是一种重要的酶，在生物体内起着多种功能。
它参与了细胞信号传导、骨骼形成和矿物质代谢等生理过程。
了解碱性磷酸酶的性质和特点对于研究其功能和应用具有重要意义。
本实验旨在测定碱性磷酸酶的Km值，以揭示其底物浓度与酶反应速率之间的关系。
材料与方法：1. 实验仪器：分光光度计、离心机、比色皿等。
2. 实验试剂：碱性磷酸酶提取液、磷酸盐缓冲液、对硝基酚磷酸盐、NaOH溶液等。
3. 实验操作：首先，将适量的碱性磷酸酶提取液加入磷酸盐缓冲液中制备酶溶液。
然后，分别取一系列浓度的对硝基酚磷酸盐溶液，并加入相同体积的酶溶液，混合均匀后放置于37℃恒温水浴中反应一定时间。
最后，利用分光光度计测定反应体系中产生的黄色产物的吸光度。
结果与讨论：通过测定不同浓度对硝基酚磷酸盐溶液的吸光度，我们得到了一系列实验数据。
将吸光度与对硝基酚磷酸盐浓度绘制成图表，我们可以得到一条标准曲线。
根据标准曲线，我们可以计算出不同底物浓度下的酶反应速率。
在实验过程中，我们发现酶的反应速率随着底物浓度的增加而增加，但随着底物浓度的进一步增加，酶反应速率逐渐趋于饱和。
这是因为酶与底物结合形成酶底物复合物，底物浓度的增加会增加酶底物复合物的形成速率。
然而，当底物浓度达到一定水平时，酶底物复合物的形成速率已经接近最大值，因此酶反应速率不再随底物浓度的增加而增加。
根据酶反应速率与底物浓度的关系，我们可以计算出碱性磷酸酶的Km值。
Km 值是指在半饱和状态下，底物浓度等于酶的反应速率的一半。
通过计算标准曲线上反应速率等于一半最大反应速率时的底物浓度，我们可以得到Km值。
Km值的大小反映了底物与酶之间的亲和力。
Km值越小，底物与酶之间的结合越紧密，亲和力越强。
反之，Km值越大，底物与酶之间的结合越松散，亲和力越弱。
通过测定Km值，我们可以了解碱性磷酸酶对底物的亲和力，进而推测其在生物体内的功能和作用。
生化试验
实验十六酸性磷酸酶K M及Vmax值测定一、实验目的（1）掌握米氏常数K M值和Vmax值的测定原理（2）掌握分光光度计的使用方法二、实验基本原理（1）酸性磷酸酶存在于人体的肝脏、前列腺等组织中，也存在于某些细菌及处于发芽阶段的植物种子中。
（2）本实验所采用的酸性磷酸酶一般是由绿豆芽或小麦胚芽等制备的，并以酸性苯二钠为底物，进行酶反应动力学的实验分析。
本实验的反应方程式：（3）酸性磷酸酶一个活性单位等于在反应的最适条件下，每分钟生成1µmol 产物所需的酶量。
（4）本实验首先通过实验绘制酶反应时间与产物生成量之间的关系曲线，从中确定酶活性测定所需的最合适时间范围，然后在pH=5.6，反应温度35℃的条件下，将不同浓度的底物与固定量的酶进行反应，通过实验测得反应初速度（V0），最后通过1/[S]与1/V0作图，即Lineweaver-Burk双倒数作图法，求得酸性磷酸酶的K M值和Vmax值。
三、实验试剂与器材1、试剂（1）0.2mol/L，pH=5.6醋酸缓冲溶液（2）酶液（3）5mmol/L磷磷酸苯二钠溶液（4）1mol/L碳酸钠溶液（5）Folin-酚试剂2、器材（1）恒温水浴槽（2）可见光分光光度计四、实验操作步骤（1）取7支试管，分别做上记号，依次标上0、1、2、3、4、5、6（2）按下表向7支试管加入不同体积5mmol/L磷酸苯二钠溶液，再用0.2mol/L，pH=5.6醋酸缓冲溶液将试管加至0.5mL管号 1 2 3 4 5 6 05mmol/L磷酸苯二钠/mL 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.50 0.50 0.2mmol/L，pH=5.6醋酸缓冲溶液/mL 0.40 0.35 0.30 0.25 0.20 -- -- 酶液/mL 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 -- 1mol/LNaCO2溶液/mL 2 2 2 2 2 2 2 Folin-酚稀溶液/mL 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 酶液/mL -- -- -- -- -- -- 0.5(3)将7支试管至于35恒温水浴箱，再加入酸性磷酸酶液（稀释液）0.5mol,摇匀，再逐管加入Folin-酚稀溶液0.5mL。
碱性磷酸酶km值测定实验报告
竭诚为您提供优质文档/双击可除碱性磷酸酶km值测定实验报告篇一：酶促反应动力学实验报告酶促反应动力学实验报告14301050154杨恩原实验目的：1.观察底物浓度对酶促反应速度的影响2.观察抑制剂对酶促反应速度的影响3.掌握用双倒数作图法测定碱性磷酸酶的Km值实验原理：一、底物浓度对酶促反应速度的影响在温度、ph及酶浓度恒定的条件下，底物浓度对酶的催化作用有很大的影响。
在一般情况下，当底物浓度很低时，酶促反应的速度(v)随底物浓度[s]的增加而迅速增加，但当底物浓度继续增加时，反应速度的增加率就比较小，当底物浓度增加到某种程度时反应速度达到一个极限值(即最大速度Vmax)。
底物浓度和反应速度的这种关系可用米氏方程式来表示(michaelis-menten方程)即：式中Vmax为最大反应速度，Km为米氏常数，[s]为底物浓度当v=Vmax/2时，则Km=[s]，Km是酶的特征性常数，测定Km是研究酶的一种重要方法。
但是在一般情况下，根据实验结果绘制成的是直角双曲线，难以准确求得Km和Vmax。
若将米氏方程变形为双倒数方程(Lineweaver-burk方程)，则此方程为直角方程，即:以1/V和1/[s]分别为横坐标和纵坐标。
将各点连线，在横轴截距为-1/Km，据此可算出Km值。
本实验以碱性磷酸酶为例，测定不同浓度底物时的酶活性，再根据1/v和1/[s]的倒数作图，计算出其Km值。
二、抑制剂对酶促反映的影响凡能降低酶的活性，甚至使酶完全丧失活性的物质，成为酶的抑制剂。
酶的特异性抑制剂大致上分为可逆性和不可逆性两类。
可逆性抑制又可分为竞争性抑制和非竞争性抑制等。
竞争性抑制剂的作用特点是使该酶的Km值增大，但对酶促反映的最大速度Vmax值无影响。
非竞争性抑制剂的作用特点是不影响[s]与酶的结合，故其Km值不变，然而却能降低其最大速度Vmax。
本实验选取na2hpo4作为碱性磷酸酶的抑制物，确定其抑制作用属于哪种类型。
实验四 酸性磷酸酶Km及Vmax值测定
• 2、制作酶反应时间与产物生成量的关系曲线 • （目的：选取合适的反应时间）
管号
1
磷酸苯二钠
0.5
酶液
0.5
精确反应时间 3
碳酸钠溶液 2
酶液
－
Folin－酚溶液 0.5
加液程序表
2
3
4
5
6
0
0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
Certain Time
Stop the reaction
Color developed
• 生化实验课老师：于晓虹 • 实验报告请交到讲台上来 • 酶液稀释 取上清液３００微升，稀释
３０倍，用大试管装
• 科代表 李博恒
1、磷酸酶原液的制备：
称取5g绿豆芽茎（去头去根），加入pH5.6的 HAC缓冲液2ml研磨成浆并静置30分钟。纱布过滤， 取1.8ml滤液,以6000rpm，离心20min，取上清。
Folin-phenol reagent
加液程序表
01 2 3 4 5 6 7 8 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 22 2 2 2 2 2 2 2 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
实验四 酸性磷酸酶Km及 Vmax值测定
一、概述
酸性磷酸酶：
催化磷酸单酯的水解反应 存在于人的肝脏，前列腺等处 植物中以发芽的种子中含量最为丰富。
是生物体中重要的一种酶类，为某些疾病的检测 指标。
二、实验原理
磷酸苯二钠
酶液
苯酚 ＋ 磷酸氢二钠
实验九：酸性磷酸酯酶米氏常数、最大反应速度测定
07:04:46
结果与计算
4
HHU Hunan PRC | 吴黎明
1、通过A680求出对应的酚标准液体积（V,mL），则产物的 浓度[P]=0.5×V（mmol/L）； 2、各底浓度下的反应速率v=0.5×V÷10（mmol/L/min）； 3、以1/v为纵坐标，1/[S]为横坐标作图，得到双倒数方程 ，根据方程求出Km和vmax。
A680
以A680为纵坐标，酚标准应用液体积（mL）为横坐标作标准曲线
07:04:46
实验步骤
3
HHU Hunan PRC | 吴黎明
3、测定Km、Vmax 取试管7支，0～6编号，空白管为0号。各管按下表加入不 同体积5mmol/L磷酸苯二钠溶液，并分别补充0.2M pH5.6乙 酸盐缓冲液至0.5mL。35℃预热2min后，逐管记时加入酸性
1～5号管分别加入0.1-1.0mL酚标准应用液，并用蒸馏水将 各管体积补充至1.0mL，0号管中加入1.0mL蒸馏水。 各管各加1mol/L碳酸钠溶液5.0mL和Folin-酚稀溶液0.5mL ，摇匀后，35℃保温显色10分钟。
以0号管作空白，在可见光分光光度计680nm波长处读取各
管的吸光度A680。
实验原理
2
HHU Hunan PRC | 吴黎明
在温度、pH及酶浓度恒定的条件下，底物浓度对酶促反应
的速度有很大的影响。在底物浓度很低时，酶促反应的速度（ v）随底物浓度的增加而迅速增加； 随着底物浓度的继续增加，反应速度的增加开始减慢；当 底物浓度增加到某种程度时，反应速度达到一个极限值（Vmax ）。
6 2.5 0.4
0.5 2.0
注意事项
5
HHU Hunan PRC | 吴黎明
km测定实验报告
km测定实验报告KM测定实验报告引言：KM测定是一种常用的酶动力学实验方法，用于测定酶的催化活性。
本实验旨在通过对酶催化反应速率的测定，探索KM值对酶活性的影响，并深入理解酶催化过程的基本原理。
实验材料与方法：1. 实验材料：- 酶溶液：选择一种适合的酶作为实验对象，如过氧化氢酶。
- 底物溶液：选择一种合适的底物，如过氧化氢。
- 缓冲液：根据实验需要选择适当的缓冲液，如磷酸盐缓冲液。
- 辅助试剂：如辅酶、金属离子等。
- 试剂盒：包括所需的试管、移液管、离心管等。
2. 实验方法：- 步骤一：制备酶溶液。
按照实验要求，将酶粉末溶解于适量的缓冲液中，制备所需浓度的酶溶液。
- 步骤二：制备底物溶液。
按照实验要求，将底物溶解于适量的缓冲液中，制备所需浓度的底物溶液。
- 步骤三：实验组设置。
根据实验要求，设置不同浓度的底物溶液，配制不同的实验组。
- 步骤四：开始实验。
将实验组中的底物溶液分别加入试管中，并在恒温条件下加入相应浓度的酶溶液，开始反应。
- 步骤五：反应停止。
根据实验要求，选择适当方法停止反应，如加入某种试剂或调整pH值。
- 步骤六：测定反应产物。
使用合适的测定方法，如分光光度法或比色法，测定反应产物的浓度。
- 步骤七：数据处理。
根据实验结果，计算不同实验组的反应速率，并绘制相关曲线。
实验结果与讨论：通过实验，我们得到了不同浓度底物溶液在酶催化下的反应速率数据，并绘制了相关的酶动力学曲线。
根据实验结果，我们可以得出以下结论：1. KM值的影响：- KM值是酶底物结合的亲和力指标，表示酶与底物结合的紧密程度。
KM值越小，表示酶与底物结合越紧密，酶对底物的亲和力越高。
- 实验结果显示，随着底物浓度的增加，反应速率逐渐增加，但增速逐渐减缓。
当底物浓度接近KM值时，反应速率趋于饱和，增速几乎为零。
- 这表明KM值对酶催化速率有重要影响，较小的KM值意味着酶对底物的亲和力更高，反应速率更快。
2. 酶活性与酶浓度的关系：- 实验结果还显示，随着酶浓度的增加，反应速率也随之增加。
碱性磷酸酶Km值的测定-毕业论文-
12
mmol/L
78
16
0
1/[S] 1 0.333 0.200 0.167 0.125 0.083 0.063 1/OD
2、作图
■ 以 [s ]为横轴，OD510为纵横作图，观 察曲线形状；查Km值
■ 以1／［s]为横轴，1／OD510为纵轴作图 观察曲线形状；查Km值
■ 比较两个值的差异.
OD510
管号 1 2 3 4 5 6 7 8 底物液 0.05 0.15 0.25 0.30 0.40 0.60 0.80 0
(0.04M)
碳酸缓 0.90 0.90 0.90 0.90 0.90 0.90 0.90 0
液(pH=10)
蒸馏水 0.95 0.85 0.75 0.70 0.60 0.40 0.20 1
■ 本实验以碱性磷酸酶为例，用磷酸苯二钠为其 底物，生成酚和磷酸，酚在碱性溶液中与4一氨 基安替比林作用，经铁氰化钾氧化生成红色醌 的衍生物，根据红色的深浅可测出酶活力高低 其反应式如下：
磷酸苯二钠+H2O Fra bibliotekKP OH- 苯酚
苯酚+4-氨基安替比林 K3Fe(CN)6 醌衍生物 （红色）
【实验操作】
碱性磷酸酶Km值 的测定
【实验目的】
■ 1 . 了解酶的Km值测定原理和方法
■ 2．掌握碱性磷酸酶（AKP）活性 测定的原理和方法
【实验原理】
■ 在温度，PH及酶浓度恒定的条件下，酶促 反应的初速度随底物浓度（S）增大而增加 但当底物浓度增大到一定极限时，则反应 速度趋于恒定，此最大反应速度Vmax，反 应速度与底物浓度之间的关系可用米氏方 程来表示，即：
1/OD510
VMAX
磷酸酶实验报告
一、实验目的1. 了解磷酸酶的基本性质和作用；2. 掌握磷酸酶活性测定的原理和方法；3. 学会使用分光光度计进行酶活性测定；4. 熟悉磷酸酶的动力学分析。
二、实验原理磷酸酶是一类催化磷酸酯键水解的酶，具有广泛的生物学功能。
磷酸酶活性测定通常采用分光光度法，通过检测底物或产物浓度的变化来反映酶的活性。
本实验采用磷酸苯二钠为底物，在碱性条件下，磷酸酶将磷酸苯二钠水解生成苯酚和磷酸盐。
苯酚在碱性溶液中与4-氨基安替比林作用，经铁氰化钾氧化生成红色醌的衍生物，根据红色深浅可测出酶活力高低。
三、实验器材与试剂1. 器材：试管架、试管、移液管、移液枪、恒温水浴箱、721型分光光度计、移液器、磁力搅拌器、电子天平、滴定管等。
2. 试剂：0.02mol/L底物液、pH10碳酸缓冲液、蒸馏水、酶液、碱性溶液、4-氨基安替比林、铁氰化钾、磷酸苯二钠等。
四、实验步骤1. 准备实验试剂，配制底物溶液、缓冲液、酶液等。
2. 设置实验组：分别取不同浓度的底物溶液（0.05、0.10、0.20、0.50、1.00、2.00、5.00、10.00、20.00mmol/L）和酶液，在恒温水浴箱中保温至实验温度。
3. 每个实验组分别取3支试管，编号为1、2、3。
4. 在1号试管中加入底物溶液、缓冲液和酶液，混合均匀后立即加入碱性溶液，启动反应。
5. 在2号和3号试管中分别加入底物溶液、缓冲液和酶液，混合均匀后立即加入4-氨基安替比林和铁氰化钾，启动反应。
6. 将1、2、3号试管分别置于分光光度计中，于特定波长下测定吸光度。
7. 根据吸光度计算酶活性，绘制酶活性-底物浓度曲线。
8. 根据曲线计算米氏常数（Km）和最大反应速度（Vmax）。
五、实验结果与分析1. 酶活性-底物浓度曲线呈典型的米氏曲线，说明实验成功。
2. 根据曲线计算得到Km值为X mmol/L，Vmax为Y mmol/L·min。
3. 分析Km值和Vmax值，了解酶的催化特性。
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• 2、制作酶反应时间与产物生成量的关系曲线 制作酶反应时间 反应时间与产物生成量的关系曲线 • （目的：选取合适的反应时间） 目的：选取合适的反应时间）
加 液 程 序 表
管号 磷酸苯二钠 酶液 1 0.5 0.5 2 0.5 0.5 3 0.5 0.5 4 0.5 0.5 5 0.5 0.5 6 0.5 0.5 0 0.5
结果： 结果： 0 酚含量/µmol 酚含量 吸光度 0 1 0.04 2 0.08 3 0.12 4 0.16 5 6 7 0.28 8 0.32
0.20 0.24
以酚含量（ 为纵坐标， 以酚含量（µmol）为横坐标，A680nm为纵坐标，绘制标准曲线 ）为横坐标， 为纵坐标 绘制标准曲线。
• 4、[S]与V0关系实验 [S]与
6 0.6 0.4 2 0.5
7 0.7 0.3 2 0.5
8 0.8 0.2 2 0.5
0.5 0.5
35℃保温10分钟 ℃保温 分钟
号管作空白， 以0号管作空白，在可见光分光光度计 号管作空白 在可见光分光光度计680 nm波长处读取各管的吸光度 波长处读取各管的吸光度 （A680nm）。 ）。
结果： 结果：
0 反应时间 吸光度 0
1 3
2 5
3 10
4 15
5 20
6 25
以反应时间为横坐标， 为纵坐标， 以反应时间为横坐标，A680nm为纵坐标，绘制反 为纵坐标 应进程曲线， 应进程曲线，并从该曲线上求出酸性磷酸酶反应初 速率的时间范围。 速率的时间范围。
• 3、制作酚标准曲线 • （目的：可从酚标准曲线上查出A680nm所相 目的：可从酚标准曲线上查出A nm所相 当的酚含量,并计算出反应速度（ 当的酚含量,并计算出反应速度（用每分钟 产物生成量来表示） 产物生成量来表示）
酸性磷酸酶Km及Vmax值测定 酸性磷酸酶Km及Vmax值测定 Km 清洗试管24支 清洗试管24支 24
存在于人的肝脏， 存在于人的肝脏，前列腺等处 植物中以发芽的种子中含量最为丰富。 植物中以发芽的种子中含量最为丰富。
是生物体中重要的一种酶类， 是生物体中重要的一种酶类，为某些疾病的检测 指标。 指标。
加液程序表
0 0.4mM phenol standard solution H2 O 1M Na2CO3 Folin-phenol reagent 0 1 2
1 0.1 0.9 2
2 0.2 0.8 2 0.5
3 0.3 0.7 2 0.5
4 0.4 0.6 2 0.5
5 0.5 0.5 2 0.5
• • • • •
1、豆芽中的酸性磷酸酶的粗提取 2、制作酶反应时间与产物生成量的关系曲线 3、制作酚标准曲线 [S]与 4、[S]与V0关系实验 双倒数作图法计算Vmax Vmax和 5、双倒数作图法计算Vmax和Km
blank
buffer substrate enzyme Color developed Certain Time Stop the reaction
碳酸钠溶液 Folin－ Folin－酚溶液 酶液 2 0.5 － 2 0.5 － 2 0.5 － 2 0.5 － 2 0.5 － 2 0.5 － 2 0.5 0.5
35℃保温10分钟 35℃保温10分钟 保温10 680nm处吸光度 测680nm处吸光度 进行酶促反应时，注意预热， 注： 进行酶促反应时，注意预热，使所有的反应在同等条件下开始
精确反应时间 3
碳酸钠溶液 酶液 2 －
5
2 － 0.5
10
2 － 0.5
15
2 － 0.5
20
2 － 0.5
25
2 － 0.5 2 0.5 0.5
Folin－ Folin－酚溶液 0.5 35℃保温10分钟 ℃保温 分钟
Folin－酚溶液已稀释好！ Folin－酚溶液已稀释好！
进行酶促反应时，注意预热， 注： 进行酶促反应时，注意预热，使所有的反应在同等条件下开始
二、实验原理
酶液 磷酸苯二钠 苯酚 ＋ 磷酸氢二钠
folin-酚测定酚的浓度 酚测定酚的浓度
计算出反应速度（用产物生成量/min来表示） 计算出反应速度（用产物生成量 来表示） 来表示
根据双倒数法计算出Km及Vmax 及 根据双倒数法计算出
V=
Vmax [S] Km + [S]
三、实验步骤： 实验步骤：
实 验 加 液 程 序 表
管号 磷酸苯二钠 醋酸缓冲液 酶液 1 0.10 0.40 0.50 2 0.15 0.35 0.50 3 0.20 0.30 0.50 4 0.25 0.25 0.50 5 0.30 0.20 0.50 6 0.50 0.50 0 0.50 -
35度 精 确 反 应 15 分 钟 35度
反应初速率（μmol/min）为酚含量除以酶反应时间（15分钟 分钟）。 2、V0 反应初速率（μmol/min）为酚含量除以酶反应时间（15分钟）。 双倒数作图法计算Vmax Vmax和 3、双倒数作图法计算Vmax和Km
• 生化实验课老师：于晓虹 • 实验报告请交到讲台上来 • 酶液稀释 取上清液３００微升，稀释 ３０倍，用大试管装 • 科代表
李博恒
1、磷酸酶原液的制备： 磷酸酶原液的制备：
称取5g绿豆芽茎（去头去根），加入pH5.6 ），加入pH5.6的 称取5g绿豆芽茎（去头去根），加入pH5.6的 5g绿豆芽茎 HAC缓冲液2ml研磨成浆并静置30分钟 纱布过滤， 缓冲液2ml研磨成浆并静置30分钟。 HAC缓冲液2ml研磨成浆并静置30分钟。纱布过滤， 1.8ml滤液 滤液, 6000rpm，离心20min 取上清。 20min， 取1.8ml滤液,以6000rpm，离心20min，取上清。 上清液用pH 5.6的HAC缓冲液稀释30倍 缓冲液稀释30 上清液用pH 5.6的HAC缓冲液稀释30倍，用于实 验。
实验中需注意事项： 实验中需注意事项：
酶反应作用时间精确控制
实验结果
Tube number [S] (mM) 1/[S] A680 phenol content（酚含量） V0 (µmole phenol per min) 1/ V0
1 0.5
2 0.75
3 1
4 1.25
5 1.5
6 2.5
1、酚含量从酚标准曲线上查得