细胞骨架的观察教程教案
实验细胞骨架的观察共17页
3%戊二醛用PBS配制
[实验步骤]
1、撕取洋葱鳞茎内表皮(约1平方厘米)置于3~5ml pH6.8 磷酸缓冲液中待其下沉(烧杯1) ；对照无 PBS处理；
2、用3~5ml 1%Triton X-100处理20 min(烧杯2) ； 对照无1%Triton X-100的M缓冲液处理20min;
3、吸去Triton X-100，用M缓冲液3~5ml洗2次，每 次5 min (烧杯3) ；对照无M缓冲液处理;
4、 3~5ml 3%戊二醛固定20 min(烧杯4) ； 5、pH6.8磷酸缓冲液3~5ml洗2次，每次5 min，滤
纸吸去残液(烧杯1) ； 6、 3~5ml 0.2%考马斯亮蓝R250染色15和30分钟，
然后用蒸馏水小心冲洗1～2次(烧杯5) ；做染色时 间的影响； 7、将表皮铺放在载玻片上，加盖玻片，在高倍显 微镜或者油镜下进行观察。
细胞骨架
洋葱表皮细胞骨架
46、我们若已接受最坏的，就再没有什么损失。——卡耐基 47、书到用时方恨少、事非经过不知难。——陆游 48、书籍把我们引入最美好的社会，使我们认识各个时代的伟大智者。——史美尔斯 49、熟读唐诗三百首，不会作诗也会吟。——孙洙 50、谁和我一样用功，谁就会和我一样成功。——莫扎特
实验细胞骨架的观察
服从真理，就能征服一切事物
实验六 细胞骨架的观察
Triton X-100 SDS
[实验器材、材料和试剂]
➢ 光学显微镜；烧杯、吸管、镊子、玻片染 色缸、载玻片、盖玻片；
➢ 新鲜洋葱;
➢ 6mM磷酸盐缓冲液 （pH6.8）、M缓冲液、 1%Triton X-100、 0.2%考马斯亮蓝R250、 3%戊二醛。
细胞实验课件植物细胞骨架的显示与观察
根据细胞骨架成份的蛋白质性质及其抗去垢 剂抽提的特点，用戊二醛在室温下固定细胞后， 经非离子型去垢剂TritonX-100处理除去膜结构 和可溶性蛋白质，留下抗抽提的细胞骨架成份， 用考马斯亮兰R250染色显示。
植物细胞骨架的显示与观察
实验目的 １．加深了解细胞骨架成份的化学性质、形态
分布与功能。 ２．掌握用考马斯亮兰显示细胞骨架系统的原
理与方法。
植物细胞骨架的显示与观察
１．仪器、用具 显微镜、载玻片、盖玻片、剪刀、镊子
２．材料 新鲜的洋葱鳞茎பைடு நூலகம்表皮
３．试剂 （１）3%戊二醛固定液 （２）1%TritonX-100抽提剂 （３）0.2%考马斯亮兰R250染色液
植物细胞骨架的显示与观察
植物细胞骨架的显示与观察
１．洋葱鳞茎内表皮要选取新鲜的。 ２．材料在载玻片上要确保展平，并且
是单层细胞。 ３．要保证材料充分和药品接触。
植物细胞骨架的显示与观察
作业：实验报告，观察到的图像要画图。
植物细胞骨架的显示与观察
观察时，先用低倍镜观察，可以看见细胞的核 区及细胞质中的细胞骨架成份被染成兰色，成束 的细胞骨架成份从核周围呈现放射状地向细胞质 中延伸，找到典型的图像后，转用油镜细心观察 ，注意调节显微镜的工作状态，尽可能达到最佳 分辨效果和清晰度，并仔细地调节细调旋钮，在 立体细胞的不同水平面进行观察。这时候，可以 看到细胞骨架结构的立体情况，并在细胞膜下见 到由很细的纤维构成的网格结构，此外，还可以 明显观察到横穿细胞壁的胞间连丝存在的部位。
1 取材：新鲜内表皮。 2 固定：3%戊二醛固定液，15min。水洗干净，
吸干水分。 3 抽提：1%TritonX-100抽提剂，20min。水洗
2 实验五 细胞骨架的显微观察
Triton X-100 (聚乙二醇辛基苯基醚)作用：
• Triton X-100是常用的非离子去垢剂－ 温和型
• 适当浓度的Triton X-100可使膜蛋白溶 解下来并保持活性，胞质中可溶性成分 随之流失，而主要存留细胞骨架系统。
• 注意缓冲液？？
戊二醛（glutaualdehyde, GA）作用：
中间纤维(intermediate filament, IF) 实心线状，粗细居中(直径10nm), 角蛋白 等多种蛋白组成，无极性
微管的体外组装和解聚条件
tubulin<临界浓度, Ca2+, 0°C低温 （解聚）
MT
(-tubulin)
tubulin>临界浓度, pH6.9, Mg2+, 37°C, GTP
微丝的体外组装和解聚条件
体外
ATP, Ca2+, 低浓度的Na+.K+(解聚)
MF/F-actin
G-actin
Mg2+, 高浓度的Na+.K+溶液诱导(装配)
取材
注意事项：
• 在指管中用缓冲液漂洗时每隔1分钟用滴管 吹打一次 ，用滴管吸取缓冲液漂洗时不要 洗掉样品
• 染色时间不宜过长 • 染色、水洗均在表面皿上操作 • 显微镜观察时先用低倍镜找，找到后转高
撕取洋葱近中轴鳞片内表皮0.5-1cm2约4-5片 ↓
玻璃指管中3% 戊二醛 固定15min
磷酸缓冲液洗三次,每次2min，期间轻轻震荡
↓ 2% Triton X-100, 室温20min
↓ M-缓冲液洗三次，每次2min，期间轻轻震荡
↓ 置于表面皿中 0.2% 考马斯亮蓝染色 10min
实验五植物细胞骨架观察课程护理课件
结果分析
分析一
通过对比实验结果与理论 预期，验证了实验方法的 可靠性和有效性
分析二
对实验结果进行统计分析 ，得出细胞骨架在不同生 长阶段的功能差异
分析三
结合文献资料，对实验结 果进行深入探讨，提出可 能的机制解释
结果讨论
讨论一
讨论实验结果对理解植物细胞生 长和发育过程的意义
讨论二
探讨实验结果对植物细胞生物学 研究的贡献和影响
04
05
抗体（可选）
03
实验步骤与操作
实验前的准备
实验材料准备
准备好实验所需的植物细胞样本 、显微镜、染色剂、实验器材等
。
实验知识准备
了解植物细胞骨架的基本概念、组 成和功能，以及实验原理和注意事 项。
实验环境准备
确保实验室干净整洁，准备好实验 所需的所有设备和试剂，并确保安 全。
实验操作步骤
实验意义
促进生物学知识整合
本实验涉及植物学、细胞生物学、生物化学等多个学科的 知识，通过本实验，学生可以将所学知识进行整合，形成 更加完整的生物学知识体系。
培养综合能力
本实验不仅培养学生的实验操作能力，还培养学生的观察 力、分析问题和解决问题的能力，有助于提升学生的综合 素质。
服务农业科学研究
植物细胞骨架的研究对于改良作物、提高产量具有重要意 义。本实验的结果可以为农业科学研究提供一定的参考。
理解细胞骨架在植物生长中的作 用
通过观察不同生长阶段的植物细胞骨架， 学生应能理解细胞骨架在植物生长、发育 过程中的重要作用。
培养实验操作技能
培养科学探究精神
本实验涉及一系列复杂的实验操作，通过 实践这些操作，学生可以提升自己的实验 技能和实验素养。
实验三细胞骨架的光学显微镜观察（5篇）
实验三细胞骨架的光学显微镜观察（5篇）第一篇：实验三细胞骨架的光学显微镜观察实验三细胞骨架的光学显微镜观察一、实验目的掌握植物细胞骨架的光镜标本制作方法。
细胞骨架是指细胞质中纵横交错的纤维网络结构，按组成成分和形态结构的不同可分为微管、微丝和中间纤维。
它们对细胞形态的维持、细胞的生长、运动、分裂、分化和物质运输等起重要作用。
光学显微镜下细胞骨架的形态学观察多用1% Triton X-100处理细胞，可使细胞膜溶解，而细胞骨架系统的蛋白质被保存，再用考马斯亮兰R250染色，使得胞质中细胞骨架得以清晰显现。
二、材料、试剂和仪器1．材料新鲜洋葱鳞茎、人口腔上皮细胞2．试剂1）M缓冲液（pH 7.2）各成分终浓度为：50mmol/L咪唑(MW:68.08)，50mmol/L KCl(MW:74.55)，0.5mmol/L MgCl2?6H2O(MW:203.30)，1mmol/L EGTA(MW:380.36)，0.1mmol/L EDTA-Na2(MW:372.24)，1mmol/L DTT(MW:154.3)2）6mmol/L PBS磷酸缓冲液（pH 6.5）:KH2PO4 : Na2HPO4?2H2O = 7:3(见附录3 查磷酸缓冲液的配置)3）0.7% NaCl生理盐水4）1% Triton X-100(聚乙二醇辛基苯基醚)溶于 M-缓冲液5）3% 戊二醛100mL: 25% 戊二醛取12mL ,PBS 88mL6）0.2% 考马斯亮蓝R250染液 200mL:考马斯亮蓝R250 0.2g，甲醇46.5mL，冰乙酸7mL，蒸馏水46.5 mL3．仪器光学显微镜，镊子，剪刀，试管，表面皿，滴管，载玻片，盖玻片,灭菌牙签，1.5mL离心管，1mL吸头，1mL取液器，酒精灯，染色缸细胞骨架动画三、实验程序四、结果与分析洋葱鳞茎外层与内层的表皮细胞比较（放大倍数10×20）五、思考题1．光镜下观察到的细胞骨架有何形态特征？2．对实验成功或失败的原因进行讨论。
实验6 植物细胞骨架观察
实验6 植物细胞骨架观察〔目的要求〕了解动植物的细胞骨架的基本形态〔实验原理〕1%Triton X-100处理细胞，使95%以上的可溶性蛋白及全部脂质被抽提，而细胞骨架中的蛋白质却不被破坏，经固定和考马斯亮兰（非特异性蛋白质染料）染色后，胞质背景着色弱，有利微丝的显示，可在光镜下观察到由微丝组成的纤维束。
〔仪器材料〕1、器材：恒温水浴锅、光学显微镜、小培养皿、小镊子、载玻片、盖玻片、吸管、50ml烧杯、小烧杯、吸水纸、擦镜纸2、材料：洋葱鳞茎3、试剂：6mmol/L磷酸缓冲液（PBS）、1% Triton X-100，3%戊二醛、M缓冲液、0.2%考马斯亮蓝R250染液4、试剂配制：（1）PBS（pH=6.5）A液：NaH2PO4.2H2O 936mg/1000mlB液：Na2HPO4.12H2O 2148mg/1000ml工作液：A液68.5ml+B液31.5ml，NaHCO3调pH=6.5（2）M缓冲液（pH=7.2）咪唑3.4克、KCl 3.71g、MgCl2.6H2O 101.65mg、EGTA(乙二醇双醚四乙酸)380.35mg、EDTA（乙二胺四乙酸）29.22mg、巯基乙醇0.07ml、甘油292ml，加蒸馏水至1000l。
HCl调pH为7.2。
（3）1% Triton X-100：Triton X-100 1ml、M缓冲液99ml。
（4）3%戊二醛：25%戊二醛12ml、6mmol/LPBS 88ml（5）0.2%考马斯亮蓝R250染液：考马斯亮蓝R250 0.2g、甲醇46.5ml、冰醋酸7ml、蒸馏水46.5ml〔内容方法〕1、取材：洋葱内表皮，浸入装有PBS缓冲液的烧杯中，使其下沉处理3分钟2、抽提：吸去PBS，加2ml 1% Triton X-100入烧杯中，置37℃恒温处理30分钟3、冲洗：转移到载波片上,吸去Triton X-100，用M缓冲液轻轻洗2次，每次10分钟。
细胞骨架的显示和观察
• 配方：
试剂 相对分子质量 所需浓度 每升加量 备注 咪唑 68.08 50mmol/L 3.40g KCL 74.55 50mmol/L 3.73g MgCl2。6H2O 203.30 0.5mmol/L 0.1g EGTA 380.40 1.0mmol/L 0.38g EDTA。2H2O 372.24 0.1mmol/L 0.04g B-巯基乙醇 78.13 1.0 mmol/L 70ul 甘油 92.09 4.0mmol/L 294.8ml 加水定容至1L，PH调至7.2
『实验内容和方法』
1、取材：撕取小块洋葱鳞茎内皮(约1cm2大小若干片) ，浸于6 mmol/L PBS中，使其下沉，处理5-10min。
2、抽提：吸去PBS，加2 ml 1%的TritonX-100，于37℃水浴处理 30min。
3、冲洗： 吸去TritonX-100，用M缓冲液轻轻洗3次，每次5min。 4、固定：3%戊二醛固定20min。 5、冲洗：弃戊二醛，用6mmol/L PBS液洗3次，每次5min。 6、染色：吸去PBS，用0.2%考马斯亮蓝R250染色10min。 7、制片：倒掉染液，用水洗2-3次，在载玻片上铺展开，加盖玻
错的纤维网络结构，按组成和形态结构的不同分为微 管（microtubule，MT）、微丝（microfilament， MF）、中间纤维（intermediatefilament，IF）。它 们对细胞的形态的维持、细胞的生长、运动、分裂、 分化和物质的运输等起重要作用。观察和研究细胞骨 架可用光镜、电镜、间接免疫荧光技术、细胞化学技 术等方法。对光镜下细胞骨架的形态学观察多用1%的 TritonX-100（聚乙二醇辛基苯醚）处理细胞，使95% 以上的可溶性蛋白质以及全部脂质被抽提，再以蛋白 质染料考马斯亮蓝R250染色，使细胞内细胞骨架得以 清晰显现。
细胞骨架高中生物教案
细胞骨架高中生物教案教学目标：1. 了解细胞骨架的组成和功能。
2. 掌握细胞骨架在细胞内的重要作用。
3. 能够描述细胞骨架在细胞运动和细胞形状维持中的作用。
教学重点：1. 细胞骨架的组成和结构。
2. 细胞骨架在细胞内的功能和作用。
教学难点：1. 理解微管、微丝和中间丝在细胞骨架中的作用。
2. 掌握细胞骨架在细胞运动和形状维持中的作用。
教学准备：1. PowerPoint课件2. 实验用显微镜3. 细胞骨架模型教学过程：一、导入（5分钟）通过展示细胞骨架的结构图，激发学生对细胞骨架的兴趣，并引入本节课的主题。
二、讲解细胞骨架的组成和结构（15分钟）1. 细胞骨架的组成：微管、微丝和中间丝。
2. 细胞骨架的结构：微管由蛋白质管组成，微丝由蛋白质丝组成，中间丝则是一种介于微管和微丝之间的结构。
三、探讨细胞骨架在细胞内的功能（20分钟）1. 细胞骨架在细胞形状维持中的作用：通过支撑细胞膜，维持细胞形状的稳定性。
2. 细胞骨架在细胞运动中的作用：微管参与细胞器的运输，微丝促进细胞的运动。
四、观察细胞骨架实验（20分钟）利用显微镜观察细胞骨架的结构和运动方式，让学生亲自感受细胞骨架在细胞内的作用。
五、总结与评价（10分钟）让学生总结本节课所学内容，强化对细胞骨架的理解。
并进行课堂表现评价，激励学生的学习兴趣。
六、作业布置（5分钟）布置练习题，让学生对所学知识进行巩固。
扩展阅读：1. 了解细胞骨架在细胞分裂过程中的作用。
2. 探究细胞骨架在疾病发生中的作用。
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• 2.2 细胞骨架的观察
生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室
大连理工大学
环境与生命学院
2.1 免疫组织化学技术
• 免疫组织化学(Immunochistochemistry) 是利用免疫学抗原抗体反 应的原理，用带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗 体反应和组织化学的呈色反应，对组织细胞内特定抗原进行定性、定 位和定量研究的一项新技术，又称免疫细胞化学 (immunocytochemistry)。
• 目前观察细胞骨架的手段主要有电镜、间接免疫荧光技术、 酶标、组织化学等。
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微丝的观察—考马斯亮蓝法
• 考马斯亮蓝R250是一种普通的蛋白质染料，它可以使各 种细胞骨架蛋白质着色，并非特异地显示微丝，但是由于 有些细胞骨架纤维在该实验条件下不够稳定，例如微管； 还有些类型的纤维太细，在光学显微镜下无法分辨，因此 我们看到的主要是微丝组成的张力纤维，直径约40nm左 右。
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细胞骨架的观察
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1.实验目的
• 熟悉免疫化学方法的原理及操作步骤。 • 掌握掌握考马斯亮蓝R250染色法及观察
细胞内微丝的方法。 • 掌握用间接免疫荧光法显示细胞内微管的
方法。
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2. 实验原理
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微管的观察—免疫组织化学法
• 用抗管蛋白的免疫血清(一级抗体，例如兔抗管蛋白抗体) 与体外培养细胞一起温育，该抗体将与胞质中的微管(抗 原)特异结合，然后再加荧光素标记的抗球蛋白抗体（二 级抗体），例如异硫氰酸荧光素(FITC)标记的羊抗兔抗体 共同温育，该二级抗体与一级抗体结合，从而使微管间接 地标上荧光素。置荧光显微镜下用一定波长激发光照射即 由荧光所在显示出微管的形态和分布。
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2.2 细胞骨架的观察
• 细胞骨架(cytoskeleton)是真核细胞细胞质中错综复杂的 蛋白质纤维网络，按纤维直径、组成成分和组装结构的不 同分为微丝(microfilaments，MF，5～7nm)、微管 (microtubule，MF，20～25nm)和中等纤维 (intermediate filaments，IF，8～11nm)。
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4.实验步骤
微丝的观察—考马斯亮蓝法 • ①细胞培养在平皿中的盖玻片上，生长密度达++～+++时，取出盖玻片，
用PBS洗3次。 • ②用1%Triton X—100处理25—30 min，室温或37℃均可。 • ③立即用M—缓冲液轻轻洗细胞3次。 • ④略晾干后，用3%戊二醛固定细胞5-15 min。 • ⑤PBS洗数次，滤纸吸干。 • ⑥用0.2%考马斯亮蓝R250染片30min-1h。然后小心用水冲洗，蒸馏水冲
• ④荧光显微镜下观察结果，用绿光激发。
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4. 实验步骤 微管的观察
• ①细胞培养在盖玻片上，长到++～+++时取出，用37℃预温的 PEMP缓冲液轻轻漂洗细胞。
生物科学与工程系细胞生物学实验教验材料 、用品
• 实验材料：培养的Hela细胞 • 实验用品：
①实验器材：光学显微镜，荧光显微镜，冰箱(—20℃及4℃)，小型 振荡器，温箱，细胞培养设备；平皿，直径30mm小染缸，载玻片， 盖玻片，铝盒等。 ②主要试剂 M—缓冲液，1%Triton X—100（用M—缓冲液配制），0.2%考 马斯亮蓝R250，3.0%戊二醛（用0.2mol/L磷酸盐缓冲液配制）， 3.7%甲醛—PEMD，甲基罗丹明—鬼笔环肽染液。 PEM缓冲液，PEMP缓冲液，PEMD缓冲液， 兔抗管蛋白血清（一 抗），FITC-羊抗兔抗体（二抗），甘油-PBS(9:1，pH 8.5-9.0)。
• ②3.7%甲醛—PEMD室温固定10 min，用PBS洗去固定液后，略 干燥再放人预冷的–20℃丙酮中再固定3～5 min，取出略干燥。
• ③在清洁的载玻片上滴加20µl染液，将盖玻片上的细胞样品反扣其 上，放人湿盒内，置暗处室温下染色20～25 min。然后用PBS洗 3次，无离子水洗2次，略干燥后甘油—PBS封片。
洗，空气中略干燥。 • ⑦普通光学显微镜下用40×物镜或油镜观察。
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4. 实验步骤
微丝的观察—甲基罗丹明—鬼笔环肽法
• ①细胞培养在平皿中的盖玻片小条上，当细胞生长密度达+++(约 70%～80%)时取出放进小染缸中，用PBS清清冲洗。
• 免疫组织化学技术具有特异性强、灵敏度高、定位准确和简便快速等 优点，又能够同形态、功能及代谢等研究结合起来，用以研究其它技 术（如化学、生化、免疫及生理等）难以深入的领域。
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大连理工大学 免疫荧光法
环境与生命学院
免疫荧光法分为直接法和间接法。
• 直接法：将荧光素（最常用异硫氰酸荧光素、FITC）标记 在特异性抗体上，使其直接与细胞上相应抗原结合，在荧 光显微镜下观察即可鉴定未知抗原。
• 间接法：将荧光素标记在第二抗体上，待一抗与细胞抗原 结合后，再用标记了的二抗与一抗相接，从而显示未知抗 原。间接免疫荧光法中具有2对抗原、抗体系统。
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• 实验中用1％Triton X—100可抽提掉胞质中除骨架蛋白 以外的其他蛋白，能清晰地显示微丝束。 生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室
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微丝的观察—荧光法
• 用荧光染料甲基罗丹明标记的鬼笔环 肽处理后，可在荧光显微镜下看到微 丝动态变化的图象。
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