CaCl2法制备感受态细胞
CaCl2感受态细胞的制备实验步骤
CaCl2感受态细胞的制备实验步骤⏹1、从新活化的E.coli DH5α平板上挑取一单菌落，接种于3～5ml LB液体培养中，37℃振荡培养至对数生长期(12h左右)；⏹ 2、将该菌悬液以1:100～1:50转接于100ml LB液体培养基中，37℃振荡扩大培养，当培养液开始出现混浊后，每隔20～30min测一次OD600，至OD600为0.3～0.5时停止培养，并转装到1.5 mL离心管中；⏹ 3、培养物于冰上放置20min；⏹ 4、 0～4℃，4000g离心10min，弃去上清液，加入1 mL冰冷的0.1mo1／L CaCl2溶液，小心悬浮细胞, 冰浴20分钟；⏹5、0～4℃， 4000g离心10min，倒净上清培养液，再用1.0 mL冰冷的0.1mo1／L CaCl2溶液轻轻悬浮细胞，冰浴20min；⏹ 6、 0～4℃， 4000g离心10min，弃去上清液，加入100 µL冰冷的0.1mo1／L CaCl2溶液，小心悬浮细胞，冰上放置片刻后，即制成了感受态细胞悬液；⏹ 7、制备好的感受态细胞悬液可直接用于转化实验，如果在4℃放置12～24h，其转化效率可以增高4～6倍；也可加入占总体积15％左右高压灭菌过的甘油，混匀后分装于1.5ml离心管中，置于-70℃条件下，可保存半年至一年。
CaCl2感受态细胞的制备实验步骤1．前夜接种受体菌（DH5α或DH10B），挑取单菌落于LB培养基中37℃摇床培养过夜（约16小时）；2 ．取1ml过夜培养物转接于100ml LB培养基中，在37℃摇床上剧烈振荡培养约2.5-3小时（250-300rpm）；3 ．将0.1M CaCl2溶液置于冰上预冷；以下步骤需在超净工作台和冰上操作；4 ．吸取1.5ml培养好的菌液至1.5ml离心管中，在冰上冷却10分钟；5 ．4℃下3000 g冷冻离心5分钟；6 ．弃去上清，加入100μl预冷0.1M CaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮，在冰放置20分钟；7 ． 4℃下3000 g冷冻离心5分钟；8 ．弃去上清，加入100μl预冷0.1M CaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮；9 ．细胞悬浮液可立即用于转化实验或添加冷冻保护剂（15% - 20%甘油）后超低温冷冻贮存备用（－70℃）。
CaCl2法制备感受态
准备：1，1L或0.5L大三角瓶（氧气充分，利于细菌生长），装入100mlLB液体培养基培养基中加100ul 4MNaOH2，50ml干净（最好较新）塑料离心管3，1ml枪头和200ul枪头足够数量4，足够数量的分装用1.5mlEp管5，80mMMgCl2+20mMCaCl2以上灭菌，1室温放置，2-5冷冻储藏制备：1，活化菌种，5mlLB不加抗生素，1：100接菌，37度振荡培养过夜，同时接一管加抗生素的看是否长菌（让菌复苏，进入对数期的早中期。
此时更容易制得感受态细胞）1：500-1000转接入100ml培养基中，培养2-3h（减少达到所需亮的均所需繁殖的世代数，以减少菌的变异。
）2，无菌台中将菌液转移到冰预冷的50ml离心管中，冰浴10’，4度4000rpm 10’，超净台中弃上清，（使细菌的生长停止，代谢减慢。
因为这时已经没有培养基了，如果细菌仍有很高的代谢效率，则有大量细菌死亡）3，用10ml冰预冷的5液体重悬100ml菌液所得菌体（一定要轻吹，这时细胞壁打开，十分脆弱），冰浴10’（细菌处于00C，CaCl2低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，外源DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸盐混合物黏附于细胞表面（羟基来源于细胞壁上的糖，磷酸来源于DNA，经短时间420C热激处理，促进细胞吸收DNA 复合物。
）4，4度4000rpm 10’收菌每100ml菌体用4ml冰预冷的0.1MCaCl2+10%甘油重悬（除去所有的LB以及细胞破损后释放出来的细胞内含物。
防止细胞分裂，以致大量细胞死亡。
（一定要轻吹，这时细胞壁打开，十分脆弱）5，）6，4度放置5hr7，分装100ul/冰预冷的1.5EP，-80度保存8，取两支分别转质粒和不转验证。
大肠杆菌感受态细胞制备实验(CaCl2法) (PDF)
大肠杆菌感受态细胞制备实验（CaCl2法）细胞经过一些特殊方法（电击法、CaCl2法）等处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的细胞，即感受态细胞（Compenent cells）。
1实验方法原理：带有外源DNA 的重组质粒，在体外构建后，导入宿主细胞，随着细胞的大量复制、繁殖，才能够有机会获得纯的重组质粒DNA，该过程称之为转化过程。
受体细胞经过一些特殊方法（如：CaCl2，RuCl 等化学试剂）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，能容许外源DNA 的载体分子通过。
2实验材料、试剂、仪器耗材：E. coli DH5α菌株LB固体培养基、LB液体培养基、CaCl2、硫酸镁、SOB、TFB等培养皿、恒温摇床、聚丙烯管、电热恒温培养箱、台式高速离心机、无菌工作台、烧瓶、恒温水浴锅、低温冰箱、制冰机、分光光度计、微量移液枪、锥形瓶、试管等3实验步骤：1、从37℃培养16-20 h的平板中挑取一个单菌落(直径2-3 mm)，转到一个含有100 ml LB 或SOB培养基的1L烧瓶中。
于37℃剧烈振摇培养3 h。
一般经验，1 OD600约含有大肠杆菌DH5α 109 个/mL。
2、将细菌转移到一个无菌、一次性使用的、用冰预冷的50 ml聚丙烯管中，在冰上放置10 min，使培养物冷却至0℃。
3、于4℃用Sorvall GS3特头（或与之相当的转头）以4 100 r/min离心10 min，以回收细胞。
4、倒出培养液，将管倒置1 min以使最后的痕量培养液流尽。
5、每50 ml初始培养液用30 ml预冷的0.1 mol/LCaCl2-MgCl2溶液(80 mmol/L MgCl2，20 mmol/L CaCl2)重悬每份细胞沉淀。
6、于4 ℃用Sorvall GS3转头（或与之相当的转头）以41 00 r/min离心10 min，以回收细胞。
7、倒出培养液，将管倒置1 min以使最后的痕量培养液流尽。
氯化钙制备大肠杆菌感受态细胞
氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞实验原理转化是将外源基因引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。
转化过程所用的受体细胞经过一些特殊方法处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性改变，成为允许外源DNA分子进入的状态，这种细胞称为感受态细胞。
进入受体细胞的DNA分子通过复制，表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。
将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子（即带有异源DNA分子的受体细胞）。
目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2和RbCl 法。
制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15%的无菌甘油，并于-70℃保存。
本实验以E.coli DH5α菌株为受体细胞，并用CaCl2处理，使其处于感受态，然后与pUC18质粒共保温，实现转化。
由于pUC18质粒带有氨苄青霉素抗性基因（Amp）,可通过Amp抗性来筛选转化子。
如受体细胞没有转入pUC18，则在含Amp的培养基上不能生长。
能在Amp培养基上生长的受体细胞（转化子）肯定已导入了pUC18。
转化子扩增后，可将转化的质粒提出，进行电泳、酶切等进一步鉴定。
实验方法一、材料DH5a菌种（生工），3ml不含抗生素的LB液体培养基，100ml不含抗生素的LB液体培养基，盐酸，三羟甲基氨基甲烷（Tris碱），CaCl2，2块氨苄抗性LB固体培养基，2块卡纳抗性LB固体培养基，2块无抗性LB固体培养基,甘油。
二、设备移液枪(20μl,200μl,1000μl)，50ml离心管4支，对应离心管转子，0.45um针头滤器，30ml注射器，烧杯，量筒，容量瓶，锥形瓶，冰浴。
三、试剂准备1. LB培养基300ml：胰化蛋白胨3g，酵母提取物1.5g，NaCl3g，290ml去离子水，加入10mol/L NaOH，每次5μl，比对PH试纸至PH7.0左右。
1) 分装出100ml LB液体培养基（不含抗生素）。
制备感受态细胞(CaCl2法)(Jin Lab)
Preparation of competent E.coli cells for transformation(CaCl2 Method)[Jin Quan-Wen Lab at XMU, Adapted from “Molecular Cloning 3”]1.取感受态细胞于无抗生素的LB培养基上划线以获得单菌落，于37℃培养;2.次日，挑取单菌落，接种于5 ml液体LB中，37℃，摇~24 hr;3.将以上preculture接种于三个盛有200 ml SOB培养液的1 L锥形瓶中，分别按1：50、1：100、1：200的比例稀释，于18-22℃摇床过夜。
次日，测定三瓶培养物的OD600，达到0.5-0.55即可;4.将该瓶培养物置于冰上10 min，后于4℃以3900 rpm离心10 min收集菌体;5.弃去上清，离心管倒扣于吸水纸上以吸干剩余液体;6.加80 ml预冷的Inoue转化缓冲液重悬菌体（注：切勿使用振荡器或吹吸混匀，以Inoue缓冲液轻轻冲刷管壁，缓慢摇动即可）;7.4℃3900rpm 10min 收菌;8.弃去上清，离心管倒扣于吸水纸上以吸干剩余液体;9.以体积为20 ml预冷的Inoue缓冲液重悬所有菌体;10.加入1.5 ml DMSO，混匀，冰浴10 min;11.按40、80及120μl体积分装; 在液氮中快速冷冻后，于-70 C冰箱中保存。
12.以已知浓度的质粒转化细胞，涂板并计算菌落数，以检测转化效率。
可转化0.1 ng、1 ng及5 ng三个梯度，最后的转化克隆数应该是线性的。
计算公式：转化效率[cfu/μg DNA] = 产生菌落的总数/ 铺板的DNA的总量转化效率1×106 cfu/μg DNA: 可用于普通的亚克隆实验;转化效率1×107 cfu/μg DNA: 可用于更复杂的亚克隆，有限量DNA的转化，T-克隆实验;转化效率>1×108 cfu/μg DNA: 可用于构建文库和突变要求用的转化。
CaCl2法制备感受态细胞-1
CaCl2法制备感受态细胞1）从新划线的平皿上挑取一个单菌落接种到10ml的LB培养基中于37℃过夜培养2）吸取500μl上述过夜培养的新鲜菌液，接种到一个盛有50ml LB的锥形瓶中，在37℃，200rpm条件下振荡培养直至菌浓度达到5×107个/ml，对大多数大肠杆菌菌株来说这时的OD600值为0.4~0.5。
一般从转接到达到此OD值约需2.5―3小时。
3）将培养液转至一灭菌并已预冷的50ml离心管（聚丙烯管）中于冰上放置10min，使培养物冷却至0℃。
4）然后于4℃以3000 rpm离心10min沉淀细胞，小心地弃去上清液，并倒转管子将残余的液体沥干。
5）将细胞悬浮在10ml冷的0.1mol/lCaCl2中，置冰上10min。
重复第4步操作，以沉淀菌体细胞。
6）收集菌体，加入1.5ml预冷的0.1mol/lCaCl2,小心悬浮，分装于200ul/管，若不马上进行转化，该感受态细胞可加入终浓度为10%的灭菌甘油，置于-70℃保存小刚论文：大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞的制备挑取新鲜的大肠杆菌BL21(DE3)单菌落接种于5ml LB培养基中，于37℃摇床培养过夜；培养物按1%接种量接种于100ml LB培养基中，37℃培养至OD600为0.5。
培养物冰上放置10分钟，然后于4℃，4000r/min 离心收集菌体（无菌离心管）；将菌体用10ml冰冷的0.1M CaCl2洗一次；4℃，4000r/min 离心收集菌体，用10ml冰冷的0.1M CaCl2重悬菌体，冰浴30min；4℃，4000r/min 离心收集菌体，加入2ml冰冷的0.1M CaCl2溶液，即制备成大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。
质粒转化过程操作步骤（1）事先将恒温水浴的温度调到42℃。
（2）从-70℃超低温冰柜中取出一管（100μL）感受态菌，立即用手指加温融化后插入冰上，冰浴5 10min。
（3）加入5–10 μL连接好的质粒混合液（DNA含量不超过100ng），轻轻震荡后放置冰上30min。
cacl2制备感受态细胞的原理
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用氯化钙法制备大肠杆菌的感受态细胞
用氯化钙法制备大肠杆菌的感受态细胞，方法如下：①从野生Top10平板上挑取单菌落，接种于3ml LB液体培养基中，37℃震荡培养过夜；②以1%的接种量转接于20-40ml的LB液体培养基中，37℃震荡培养至OD值为0.3-0.4时，将菌液置于冰浴中至少30分钟（目的：抑制大肠杆菌生长）③于4℃，4000rpm离心10分钟，弃去上清，沉淀重悬于20ml预冷的0.1mol/L中，冰浴放置40分钟；CaCl2④4℃，4000rpm离心10分钟，弃去上清，加入2ml预冷的0.1mol/L CaCl（含210%甘油）重悬细胞，以每管100-200µl分装备用。
不及时使用的各管于-80℃保存。
注：细胞重悬时动作要尽量轻柔，切忌用枪吹打。
新鲜感受态不立即使用-80度冻几小时后再用效果可能会更好（2）热激转化感受态取感受态细胞，加入外源连接产物，轻轻混匀，冰浴30分钟混合物放入42C循环水浴中，90秒-2分钟立刻转到冰浴，冷却2分钟加入900UL培养基，37温育45-60分钟10000rmp离心半分钟，弃上清，留100-200ul混匀后均匀涂在含相应抗生素的琼脂平板上，倒置平皿，37培养过夜，菌落长出。
注：转质粒加入质粒1-2ul即可，且无须加800ul培养基孵育,热击冷却后直接涂板。
原理：其原理是：细菌处于0℃氯化钙低渗溶液中，细胞膨胀成球形。
转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基鸟磷酸复合物粘附于细胞表面；经42℃短时间热休克处理，促进细胞吸收DNA复合物。
在丰富的培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增殖。
被转化的细菌中，重组的基因得到表达，在选择性培养基平板上可筛选出所需的转化因子。
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大肠杆菌感受态细胞的CaCl2法制备及质粒转化
实验原理
处于对数生长期的细菌经CaCl2 处理后接受外源DNA的能力显著增加。
细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。
在自然条件下，很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内，但在人工构建的质粒载体中，一般缺乏此种转移所必需的mob基因，因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。
如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态，以摄取外源DNA。
转化（Transformation）是将外源DNA分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。
转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体（R-,M-），它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。
受体细胞经过一些特殊方法（如电击法，CaCl2 ，RbCl(KCl)等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞（Compenent cells）。
进入受体细胞的DNA分子通过复制、表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。
将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子（Transformant，即带有异源DNA 分子的受体细胞）。
目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2和RbCl(KCl)法，RbCl(KCl)法制备的感受态细胞转化效率较高，但CaCl2法简便易行，且其转化效率完全可以满足一般实验的要求，制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15%的无菌甘油于-70℃保存（半年），因此CaCl2法使用更广泛。
主要试剂
(1)0.1mol/L CaCl2溶液
(2)LB液体培养基
(3)30%甘油：30mL甘油溶于100mL蒸馏水，高压灭菌。
主要设备
(1)超净工作台
(2)冷冻离心机
(3)恒温摇床
(4)－70℃冰箱
(5)10mL移液管
(6)吸耳球
(7)1mL、200μL移液枪（配套枪头）
(8)50mL 离心管
(9)1.5mL离心管
实验材料
(1)大肠杆菌DH5α（R-，M-，Amp-）
实验步骤
（一）受体菌的培养
(1)从LB平板上挑取新活化的E. coli DH5α单菌落，接种于3～5mL LB液体培养基中，37℃下振荡培养过夜（12h左右）。
(2)将该菌种悬液以1:100的比例接种，取250μL菌液转接到25mL LB液体培养基中，37℃振荡培养2～3h至OD600＝0.5左右。
（二）感受态细胞的制备（注意：以下操作在超净工作台完成。
）
(1)将菌液转入50mL离心管中，冰上放置10min。
(2)在4℃下，4000r/min离心10min。
弃去上清，将管倒置1min以便培养液流尽。
(3)用冰上预冷的0.1mol/L的CaCl2 溶液10mL轻轻悬浮细胞，冰上放置30min。
(4)0～4℃ 4000r/min离心10min，弃去上清，加入2mL预冷的0.1mol/L的CaCl2 溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置（务必冰上放置）。
（注意：以上操作完成了新鲜感受态细胞的制备）
（三）感受态细胞的分装与冻存
(1)在2mL制备好的感受态细胞中加入2mL30%甘油（即1:1体积，甘油终浓度15%）。
(2)将此感受态细胞分装成每份200μL (1.5mL dorf管)，液氮速冻，快速转入-70℃冰箱保存。
（如果没有液氮，可以将分装的感受态细胞直接转入-70℃冰箱保存。
）
注意事项
⑴、细胞的生长状态和密度
最好从-70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。
不要用已经过多次转接，及贮存在4℃的培养菌液。
细胞生长密度以每毫升培养液中的细胞数在
5×107个左右为佳。
即应用对数期或对数生长前期的细菌，可通过测定培养液的OD600控制。
对TG1菌株，OD600为0．5时，细胞密度在5×107个/ml左右。
（应注意OD600值与细胞数之间的关系随菌株的不同而不同）。
密度过高或不足均会使转化率下降。
此外，受体细胞一般应是限制-修饰系统缺陷的突变株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。
并且受体细胞还应与所转化的载体性质相匹配。
⑵、试剂的质量
所用的CaCl2等试剂均需是最高纯度的，并用最纯净的水配制，最好分装保存于4℃。
⑶、防止杂菌和杂DNA的污染
整个操作过程均应在无菌条件下进行，所用器皿，如离心管，移液枪头等最好是新的，并经高压灭菌处理。
所有的试剂都要灭菌，且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染，否则均会影响转化效率或杂DNA的转入。
⑷、整个操作均需在冰上进行，不能离开冰浴，否则细胞转化率将会降低。