荧光素酶基因在转化烟草中的表达
荧光素酶创新在生命科学研究中的应用
荧光素酶创新在生命科学研究中的应用荧光素酶是一种特殊的酶，它由荧光素（Luciferin）和荧光素酶（Luciferase）组成。
荧光素酶的主要作用是催化荧光素的氧化反应，产
生光和其他产物。
根据不同的荧光素酶，产生的光可以在不同的波长范围
内发射，因此可以应用于生命科学研究中的各个领域。
荧光素酶的应用主要可以分为以下几个方面：
1.基因表达和蛋白质定位研究：通过将荧光素酶基因与目标基因融合，并进行转染或转化表达，可以实现对基因表达的定量和定位研究。
荧光素
酶的光学信号具有极高的灵敏度和低背景噪音，可以用于对基因表达的实
时监测和定量分析。
同时，荧光素酶还可以与其他荧光蛋白质（如绿色荧
光蛋白）相结合，用于蛋白质定位和相互作用的研究。
2.细胞信号转导研究：荧光素酶可以与其他信号分子（如钙离子、ATP等）结合，用于研究细胞内信号转导的过程。
通过将荧光素酶与目标
信号分子结合，可以实现对细胞内信号分子的实时检测和定量分析。
3.荧光免疫染色和标记：荧光素酶可以用于免疫染色和标记的研究。
通过将荧光素酶与抗体结合成荧光素酶-抗体复合物，可以用于免疫组织
化学染色、免疫电镜和流式细胞术等多种生命科学研究方法中，实现对特
定抗原的检测和定位。
4.高通量筛选和药物研发：荧光素酶可以用于高通量筛选和药物研发。
通过将荧光素酶与目标蛋白质结合，并进行高通量荧光筛选，可以快速筛
选出对目标蛋白质具有抑制或激活作用的化合物。
同时，荧光素酶还可以
用于药物代谢动力学的研究，以及药物分子在体内的跟踪和定量分析。
荧光素酶在动植物生化研究中的应用
荧光素酶在动植物生化研究中的应用荧光素酶（Luciferase）是一种常见的发光酶，被广泛应用于生命科学研究中。
荧光素酶在动植物生化研究中的应用十分广泛，涵盖了很多领域，本文将就十分重要的领域、应用方式、研究现状以及未来发展方向进行探讨。
一、荧光素酶在靶标鉴定与药物筛选中的应用荧光素酶技术可以应用于筛选化合物对靶标的亲和力，查找分子突变造成的功能性影响，对通路进行分析等。
高难度荧光素酶检测技术也可以应用在抗体库筛选与药物循环代谢速度评估等方面。
因此，荧光素酶技术在靶标鉴定与药物筛选等方面具有重要意义。
二、荧光素酶在生理代谢与分子诊断领域的应用荧光素酶技术已被广泛应用于生理代谢过程与分子诊断领域。
例如，常见的同位素标记实验可以通过荧光素酶技术进一步加强信号检测和动力学模拟分析。
在分子诊断方面，荧光素酶技术可以追踪某些有助于疾病诊断的基因或蛋白质，或将配体与靶标相互作用引起的生物发光应用于特定疾病的检测中。
三、荧光素酶在基因编辑技术中的应用基因编辑技术已经成为近年来生命科学领域的重大突破，也是许多研究领域的支撑。
荧光素酶可以作为介导报告基因的元素，以帮助澄清基因编辑技术的效率和用途。
四、荧光素酶在逆境应答及植物分化中的应用逆境应答和植物分化通常与生存的基本方面相关。
荧光素酶的作为生物发光系统主要基于自动氧化反应，非常适用于植物物种学等研究领域。
五、荧光素酶在工业制品中的应用荧光素酶技术可以应用于工业制品中，例如在检测食品中添加的抗生素、检测污染物等方面，有重要意义。
荧光素酶技术具有灵敏性高、快速的特点，大大减少了实验室和其他检测机构的检测时间，并带动更快的监管环节，从而保护消费者健康。
六、荧光素酶技术的发展与未来展望荧光素酶技术的广泛应用带来了很多机会和挑战。
随着近几年荧光素酶技术的不断推进，这个技术流派的研究和开发将越来越重要，并且必然会在更多的实验室以及行业中得到应用。
总之，荧光素酶作为一种重要的发光酶，其广泛应用于动植物生化研究中的各个方面。
高中生物选择性必修三 模块综合测评 课后作业
模块综合测评(时间：90分钟满分：100分)一、选择题(14×2＝28分，每小题只有一个选项符合题目要求)1．下列关于果酒和果醋制作的叙述，错误的是()A．制作果酒时瓶口需密闭，而制作果醋时要打开瓶盖或通气B．温度对酵母菌酒精发酵的影响很大，而对醋酸菌的发酵影响不大C．在变酸的果酒的表面观察到的菌膜可能是醋酸菌在液面大量繁殖形成的D．制作果酒和果醋时都应用体积分数为70%的酒精对发酵瓶消毒并注意无菌操作B[温度对酵母菌和醋酸菌的发酵都有影响，在制作果酒时温度要控制在18～30 ℃，而在制作果醋时则要将温度控制在30～35 ℃。
]2．在利用葡萄自然发酵产生果酒的过程中，未经杀菌，但其他杂菌不能生长的原因是()A．经冲洗后的葡萄上只有野生型酵母菌无其他杂菌B．其他杂菌不能利用葡萄汁中的糖作碳源C．在缺氧和呈酸性的发酵液中，酵母菌能大量繁殖，其他杂菌不适应环境而被抑制D．酵母菌发酵产生大量酒精，杀死了其他杂菌C[冲洗的目的是洗去浮尘，在冲洗过程中，杂菌和酵母菌被洗掉的机会是均等的；异养微生物都能利用糖；根本的原因是其他微生物不适应缺氧和酸性环境。
]3．微生物培养是微生物工程中的基础技术，下列相关叙述正确的是() A．病毒和细菌的培养基成分相同B．平板划线法中的“线”是连续的、不分区域的C．微生物培养基中并不是都必须添加碳源或氮源D．在微生物培养操作过程中，为防止杂菌污染，需对培养基和培养皿进行消毒C[病毒必须寄生在活细胞内才能进行生命活动，如可用活鸡胚培养病毒；平板划线法每次划线前都要灼烧接种环，划线是分区域的；微生物种类不同，对营养物质的需求不同，应根据所培养微生物的需要确定培养基的成分；对培养基和培养皿要进行灭菌，而不是消毒。
]4．三个培养皿中分别加入10 mL不同的培养基，然后接种相同的大肠杆菌样液。
培养36 h后，计算菌落数，结果如下表。
下列相关叙述正确的是()B．该实验采用平板划线法接种C．Ⅰ和Ⅲ对照，说明大肠杆菌的生长不需要生长因子D．Ⅱ和Ⅲ对照，说明大肠杆菌的生长需要葡萄糖D[该培养基加入了琼脂，故为固体培养基；对微生物进行计数时宜采用稀释涂布平板法接种，而不是平板划线法接种；Ⅰ与Ⅲ中有葡萄糖、生长因子两种变量，不能得出相应结论；Ⅱ和Ⅲ对照，自变量是有无葡萄糖，说明大肠杆菌的生长需要葡萄糖。
北京四中高二下生物试卷含答案
北京四中高二年级第二学期期末测试生物试卷（试卷满分为100分，考试时间60min）说明：本卷共40道单项选择题选修3模块水平测试（理科）一、选择题（60分，每题1.5分）1. mRNA上终止密码子不编码氨基酸，与之相对应DNA片段位于A. 基因编码区下游非编码区中B. 基因编码区内C. 基因编码区最末端内含子中D. 基因最末端2. 下列黏性末端属于同一种限制酶切割而成是A. ①②B. ①③C. ①④D. ②③3. 下图所示几个限制性核酸内切酶切割位点（箭头所指为切割位点），切割后可以互相连接末端是A. ①②B. ①③C. ②④D. ③④4. 某线性DNA分子含有5000个碱基对（bp），先用限制性核酸内切酶a完全切割，再把得到产物用限制性核酸内切酶b完全切割，得到DNA片段大小如下表。
限制性核酸内切酶a和b识别序列和切割位点如下图所示。
下列有关叙述错误．．是A. a酶与b酶切断不是两条链上互补配对碱基之间氢键B. 限制性核酸内切酶a和b切出DNA片段不能相互连接C. 该DNA分子中a酶能识别碱基序列有3个D. 仅用b酶切割该DNA分子可得到三种DNA片段5. 下列哪一项不是基因工程载体必备条件A. 能在宿主细胞中复制并保存B. 具有多个限制酶切点，以便与外源基因连接C. 具有标记基因，便于进行筛选D. 决定受体细胞生存6. 下列哪项不是基因工程中经常使用用来运载目基因载体A. 细菌质粒B. 噬菌体C. 动植物病毒D. 细菌核区DNA7. 下图表示限制性内切酶切割某DNA分子过程，有关叙述不正确是A. 该限制酶能识别碱基序列是GAA TTC，切点在G和A之间B. 用此酶切割含有目基因DNA片段，同时须用该限制酶切割运载体，以产生与目基因相同黏性末端C. 要把目基因与运载体“缝合”起来，要用DNA聚合酶D. 限制酶切割DNA分子时，是破坏了同一条链上相邻脱氧核苷酸之间化学键8. “超级细菌”是一种含超级耐药基因NDM－1细菌，能编码一种新耐药酶，可抵抗几乎所有抗生素。
荧光素酶报告基因检测
荧光素酶报告基因检测荧光素酶报告基因检测是一种非常重要和有效的检测方法。
它是基于荧光素酶报告基因技术的分子生物学技术，可以用来检测特定基因的表达情况。
荧光素酶报告基因检测的原理基于荧光素酶（luciferase）的活性，在其底物（luciferin）存在的情况下可以发出强烈的荧光信号。
因此，通过将荧光素酶基因放入需要检测的基因区域中，可以根据荧光素酶的活性来测定基因的表达情况。
这种技术广泛应用于生化和分子生物学研究，可以用于许多应用，包括药物研发、基因治疗和疾病诊断等。
以下是荧光素酶报告基因检测在三个不同领域的应用案例：1. 荧光素酶报告基因检测在癌症治疗中的应用一项为期一年的研究以多发性骨髓瘤（MM）患者为对象，研究了荧光素酶报告基因检测在癌症治疗中的应用。
结果表明，该检测方法可以用于评估患者对治疗的反应。
这个结果对临床医生更好地选择治疗方案和对治疗效果的监测非常有帮助。
2. 荧光素酶报告基因检测在药物筛选中的应用一项在2020年发表在Journal of Chemical Information and Modeling的研究表明，荧光素酶报告基因检测可以用于筛选潜在的抗病毒药物。
该研究展示了荧光素酶报告基因检测与其他基于荧光的筛选方法相比的优越性，并借此成功地开发了两种新型药物。
3. 荧光素酶报告基因检测在转基因作物研究中的应用一项针对棉花研究的研究表明，荧光素酶报告基因检测可以用于评估转基因作物的基因表达。
该研究在转基因棉花中成功地使用了荧光素酶基因，实现了在植物组织中的基因定量测量和活性报告。
总之，荧光素酶报告基因检测是一种非常有效和多样化的检测方法，其应用范围广泛，可以在许多领域提供有力的支持。
无论是在临床、生物制药还是基因科学领域，荧光素酶报告基因检测都具有重要的应用前景。
同时，荧光素酶报告基因检测在基因表达、蛋白质表达、分泌、酶活性等方面的检测也得到广泛应用。
这种检测方法对于研究疾病分子机制、药物筛选、基因治疗等领域的发展具有重要意义。
荧光素酶表达基因法_CALUX_用于二恶英检测的研究进展_张诺
Ｒeceived 28 January 2014
accepted 5 March 2014
简化了实验操作 , 降 低 了 成 本 , 并 且 由 于 可 利 用 基 因工程技术改 进 报 告 质 粒 进 一 汁 样 品、 二噁英暴 露人群的血液以及环境水样中二噁英的快速
噁英应答区域结合,并激活细胞色素 P450 基因和荧光 合成酶基因合成荧光素。该测试系统合成的荧光素 量及荧光强度与测定系统中加入的二噁英量成正相 关 [8 10] 。 与其它二噁英的分析检测方法相比,CALUX 法 具有一系列优势,如表 1 所示。 CALUX 生物检测法 精 使用高感度的细胞, 加上前处理简单, 拥有萃取、 制、 分离等优良技术,因此成为环境、 食品等领域二 噁英的快速检测方法。 此外,分析程序大幅度的缩 短使成 本 大 幅 降 低。 但 此 类 方 法 只 能 得 到 总 的 TEQ,不能了解样品中二噁英的具体组成 。 2 荧光素酶表达基因法与同类方法用于二噁英检
2014 年 第 9 卷 391397 第 3 期，
生
态
毒
理
学
报
Asian Journal of Ecotoxicology
Vol. 9, 2014 No.3, 391 397
DOI: 10.7524/AJE.1673 5897.20140128001 张 诺,孙韶华,王明泉,等. 荧光素酶表达基因法 (CALUX)用于二噁英检测的研究进展[J]. 生态毒理学报, 2014, 9(3): 391 397 Zhang N, Sun S H, Wang M Q, et al. Research progress of dioxins' detection using chemical - luciferase gene expression (CALUX) [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2014, 9(3): 391 397 (in Chinese)
烟草瞬时转化实验步骤
烟草叶片瞬时转化实验试验方法一、实验材料及药品pCAMBIA 1381Z-Luc载体、Gv3101农杆菌菌株及其感受态、MES、MgCl2、乙酰丁香通、5-6周本氏烟草等二、载体构建及农杆菌转化烟草瞬时转化实验选用融合Luc信号的pCAMBIA 1381Z-Luc载体，载体构建过程是将拟南芥及菊花的FT启动子分别采用双切双连的常规载体构建方式将启动子构建到pCAMBIA 1381Z-Luc载体上，同时将目的基因构建到pMDC43或pMDC32或pORE载体上作为超表达载体进行后续的瞬时转化实验。
通过农杆菌转化的方式，将上述构建好的质粒转化到农杆菌菌株GV3101的感受态细胞中。
三、材料的准备1、烟草植株5-6周幼嫩未开花植株2、携带质粒的农杆菌（GV3101或An105均可）3、YEB培养液（一瓶+K+R、一瓶只+R——pCAMBIA 1381Z-Luc载体为卡纳氯霉素抗性、Gv3101只有r抗性）4、处理液：10mL配方如下母液配方（10ml配方）：0.5M MES 200ul 0.976g1M MgCl2100ul 2.03g100mM乙酰丁香酮10ul 0.196g（使用DMSO溶解）灭菌水加至10ml （若长时间保存，需避光！）四、操作步骤1、农杆菌转化2、转化正确的农杆菌进行过夜培养，同时培养P19菌株（最好先进行划线）3、确定不同农杆菌所加菌液的量：计算公式：V=n×Vfinal×0.5/OD600 VP19= n×Vfinal×0.3/OD600OD600最好在1以上n=注射叶片数Vfinal=悬浮后的终体积多为2ml或3ml 注：在进行转录激活或抑制实验时，一般加入四种农杆菌（包括P19）而对照组往往只加入两种或三种菌液，此时，应使用Gv3101对体系进行补充，计算方法为公式一，具体加入量视对照组缺失的量确定，分别加入一倍或两倍Gv3101进行补充。
利用实时荧光定量PCR技术检测转基因烟草
3. 2 扩增曲线的形成 在定量 PCR 过程中, 以荧光值 Rn 和临界循
环值作图, 系统自动得到扩增曲线, 如图 2. 图中可 以看出相同样品的重复性还是比较好的. 这时需 要设置基线 ( base line) 和阈值, 实验表明, 基线要
基因定量分析是未来检测手段的一个重要发 展方向, 虽然他还存在着一定的技术性问题, 但是 随着分子生物学技术的不断发展会日趋完 善, 在 生命科学技术领域会有很大的应用前景.
72
哈尔滨师范大学自然科学学报
2005年
参考文献
1 瞿礼嘉, 顾红雅, 胡苹, 陈章量. ∀现代生物技 术导论 #, 1998, 第 一版
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样品 S8, 4. 84 ( 4. 32 % 105, 5. 12 % 105, 5. 09 % 105 ), 以上数据 ( 如图 4) 表明, 相同样品 ( 3 个重 复 ) 的重复性还 是比较吻合 的, 进 一步说明 定量 PCR 技术具有良好的检测准确性. 虽然相同条件 相同样品时, 实验结果会有差别, 但它为精确定量 检测提供了基础.
ct值与拷贝数示意图4讨论试验所用染料sybrgreenpcr产物的特异性要求特别高它的多少可能决定检测的灵因为sybrgreeni可以和双链dna小沟结无论是起始模板还是非特异性产物引物二聚体都会结合上所以要优化反应体系尽量减少引物二聚体非特异性产物由此也可以看出它不比常规pcr有更高特异性有试验表明使用双重标记的序列特异性荧光探针或能量信号转移探针方法获得荧光信号在很大程度上提高了检测的灵敏度特异性和精确度sybrgreen使用时要避光操作时要快
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荧光素酶基因在转化烟草中的表达
利用荧光素酶与底物结合发生化学发光反应的特点，把感兴趣的基因转录的调控元件克隆在萤火虫荧光素酶基因（firefly luciferase）的上游，构建成荧光素酶报告质粒。
然后转化烟草，测定荧光素酶活性。
通过荧光素酶活性的高低判断性刺前后或不同刺激对感兴趣的调控元件的影响。
为了减少内在的变化因素对实验准确性的影响，将带有海肾荧光素酶基因（Rinilla luciferase)的质粒作为对照质粒与报告基因质粒共转化，提供转录活力的内对照，使测试结果不受实验条件变化的干扰。
技术背景1荧光素酶生物检测技术诞生于1990年，已有30年的发展史。
单荧光素酶检测系统到双荧光素酶检测系统的发展，为科研人员提供了更为严谨的实验手段。
双荧光素酶报告基因检测系统在原有的基础上引入了海肾报告基因，可以排除不同组之间细胞生长状况、细胞数目以及转染效率带来的干扰，起到校正的作用，从而使实验结果更为可靠。
什么是双荧光素酶？2双荧光素酶通常是指萤火虫荧光素酶和海肾荧光素。
其中荧火虫荧光素是从萤火虫中分离得到，分子量为61 kDa；而海肾（Renilla）荧光素酶则是从海肾（Renilla reniformis）中分离，分子量为36 kDa。
两种荧光素酶的区别是什么？3①底物和辅因子不同：萤火虫荧光素酶需要荧光素、氧气、ATP和镁离子同时存在才能发光；而海肾荧光素酶仅需要腔肠素（coelenterazine）和氧气。
②发光的颜色不同：萤火虫荧光素酶产生的光颜色呈现黄绿色，波长550-570nm；而海肾荧光素酶产生蓝光，波长480nm。
正是由于这两种酶的底物和发光颜色不同，所以在双荧光素酶报告实验中得到广泛应用，它们的发光原理如下所示：
实验原理4Firefly luciferase和Renilla luciferase之所以被称为报告基因，是因为在基因表达调控研究时，利用两者表达产生的荧光比值可以监控、证实微观层面上的分子间的相互作用。
具体做法是：将靶基因的转录调控元件或5’启动子区克隆在Firefly luciferase基因的上游，或把3’-UTR区或lncRNA结合序列克隆在Firefly luciferase基因的下游，以研究启动子的强弱和转录因子对启动子的作用或miRNA对目的基因或lncRNA的调控作用（见图2）。
与此同时，引入包含Renilla luciferase基因的TK载体作为内参，以便消除细胞转染等因素带来的组间误差。
Dual Luciferase Reporter实验步骤5以烟草为材料进行Dual Luciferase
Reporter的实验步骤：1）构建相应的载体。
2）挑取转化有重组质粒的农杆菌单菌落，接种到2 mL LB液体培养基（添加相应抗生素）中，28℃220 rpm培养过夜。
3）农杆菌培养至OD600为1.0，1700×g离心5 min收集菌体后，用
1/2MS液体培养基清洗菌体2次；用含有150 μmol/L乙酰丁香酮的1/2MS液体培养基将农杆菌的OD600调至1.0。
4）将待检测的农杆菌菌液进行混合，使每种菌液的OD600为0.5。
5）选取生长期为1个月左右完全伸展的烟草叶片，将混合好的菌液用1 mL注射器(去掉针头)从烟草叶背面进行注射。
为保证实验结果的一致性，需要将对照载体和待检测目标载体的菌液注射在同一叶片的不同部位上,以保证相同的生长背景。
6）正常温室生长条件下，24-48 h即可取样观察。
7）取3-4片直径为6-8 mm的叶盘，放入2 mL的EP管（提前放入3-4个小钢珠）中，液氮中冷冻，使用破碎仪进行研磨破碎（45 Hz，30 s）。
破碎完全后在EP 管中加入100 μL裂解液。
8）冰上孵育5 min左右，充分裂解叶片。
9）10000-16000 rpm离心1 min，取上清。
10）荧光检测：①取20 μL裂解液，加至培养板中。
按照实验需要，可设置3孔-5孔重复。
②配制萤火虫萤光素酶反应工作液和海肾萤光素酶反应液，即萤火虫萤光素酶底物（50 ×）和海肾萤光素酶底物（50×）。
分别用对应的缓冲液稀释至1×工作液。
并孵育至室温。
③加入100 μL萤火虫萤光素酶反应液，震板混匀，检测萤火虫萤光素酶的活力，检测尽量在30 min内完成。
④加入100 μL海肾萤光素酶反应液，震板混匀，检测海肾萤光素酶的活力，检测尽量在30 min内完成。
荧光素酶报告基因的特点6 1、优越的灵敏度，比Western bloting灵敏度高1000倍以上；2、内源性低，无内源性表达；3、荧光素酶检测不受细胞内其他物质影响；4、发光检测，检测方便；5、灵敏度高，1020摩尔荧光素酶分子；6、检测范围广，大于7个数量级。
主要应用领域7 1、潜在启动子/启动子核心区域检测；2、潜在增强子/抑制子等调控子核心元件检测；3、启动子区可能的转录因子结合位点检测；4、启动子/增强子与转录因子的相互作用；5、病毒/细胞相互作用；6、物理化学等诱导因素对启动子活性的调节（抑制或增强）；。